Реактивация культур микобактерий, выделенных из биоматериала животных и образцов внешней среды, с бактериологической, молекулярно-биологической и молекулярно-генетической идентификацией

Введение. В современной микробиологии сбор и поддержание коллекций микроорганизмов в рабочем состоянии являются наиболее важными направлениями практической деятельности микробиологической лаборатории.

Цель исследования. Осуществление процесса реактивации нежизнеспособных культур микобактерий, выделенных из биоматериала животных и образцов внешней среды, на жидких и плотных питательных средах с ростовой добавкой с последующим бактериологическим, молекулярно биологическим и молекулярно-генетическим типированием восстановленных патогенов.

Материалы и методы. Процесс реактивации включал в себя посев культур на жидкую среду Middlebrook 7H9 и плотную среду Левенштейна – Йенсена с использованием ростовой добавки OADC. Последующую идентификацию микобактерий проводили методом времяпролетной масс-спектрометрии и методом гибридизации на микрочипе с помощью тест-системы «МИКО-Биочип» (Россия).

Результаты. Для эксперимента in vitro отобрано 75 образцов культур микобактерий, полученных при обработке биоматериала животных и объектов внешней среды и находящихся в некультивируемом состоянии. Реактивировано 46 (61,3%) культур, среди которых идентифицированы Mycobacterium tuberculosis (4,3%) и нетуберкулезные микобактерии следующих видов: медленнорастущие патогенные Mycobacterium avium (65,2%) и Mycobacterium intracellulare (2,2%); медленнорастущие непатогенные Mycobacterium nonchromogenicum (15,2%) и Mycobacterium monacense (2,2%); быстрорастущие патогенные Mycobacterium fortuitum (4,3%) и Mycobacterium abscessus (2,2%), быстрорастущие условно-патогенные Mycobacterium neoaurum (2,2%), а также Mycobacterium kyogaense (2,2%). Ведущая роль среди реактивированных культур принадлежала микобактериям III группы нетуберкулезных микобактерий согласно классификации Раньона: Mycobacterium avium, Mycobacterium nonchromogenicum, Mycobacterium intracellulare.

Заключение. Осуществлена реактивация 46 из 75 патогенов полевых изолятов микобактерий в условиях микробиологической лаборатории, позволяющих получить жизнеспособные популяции, что свидетельствует об эффективности использованного метода реактивации. Сохранены основные характеристики полученных культур и разнообразие видов микобактерий в коллекции. Результаты проведенных исследований можно использовать для оптимизации лабораторной микробиологической диагностики туберкулеза.

1. Курилова А. Е., Лебедева А. Ю., Богун А. Г. Накопление мутаций в геномах микроорганизмов в процессе длительного хранения и культивирования. Бактериология. 2021; 6 (4): 84–93. https://elibrary.ru/hcbaqs

2. Blevins S. M., Bronze M. S. Robert Koch and the ‘golden age’ of bacteriology. International Journal of Infectious Diseases. 2010; 14 (9): e744 e751. https://doi.org/10.1016/j.ijid.2009.12.003

3. Van Hop D. Establishment and management of culture collections of microorganisms (mbrc): an overview. In: Microbial Resource Conservation: Conventional to Modern Approaches. Eds. S. K. Sharma, A. Varma. Cham: Springer; 2018; Chapter 3: 55–109. https://doi.org/10.1007/978-3-319 96971-8_3

4. Маркин В. А. Коллекции патогенных вирусов в решении обще биологических проблем. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2007; (6): 84–93. https://elibrary.ru/iisqft

5. Онищенко Г. Г., Кутырев В. В., Осин А. В. Коллекционная деятельность в области использования патогенных микроорганизмов в обеспечении биологической безопасности Российской Федерации. Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2016; (1): 37–46. https://elibrary.ru/vretot

6. Morgan C. A., Herman N., White P. A., Vesey G. Preservation of micro organisms by drying; a review. Journal of Microbiological Methods. 2006; 66 (2): 183–193. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2006.02.017

7. Сидорчук А. А., Краснова А. А. Сохранность культур бактерий различных групп при длительном хранении в лиофилизированном состоянии. Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные. 2016; (3): 22–25. https://elibrary.ru/witnij

8. Pennings L. J., Zweijpfenning S., Ruth M. M., Wattenberg M., Boeree M. J., Hoefsloot W., van Ingen J. Mycobacterium avium complex bacteria remain viable in sputum during storage and refrigeration. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2018; 92 (4): 309–310. https://doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2018.06.017

9. Griffith D. E., Adjemian J., Brown-Elliott B. A., Philley J. V., Prevots D. R., Gaston C., et al. Semiquantitative culture analysis during therapy for Mycobacterium avium complex lung disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 2015; 192 (6): 754–760. https://doi.org/10.1164/rccm.201503-0444OC

10. Умпелева Т. В., Еремеева Н. И., Вахрушева Д. В. Разработка техно логии длительного хранения культур микобактерий туберкулеза. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2021; 23 (4): 404–408. https://doi.org/10.36488/cmac.2021.4.404-408

11. Кишилова С. А., Леонова В. А., Митрова В. А., Рожкова И. В. Основные методы сохранения жизнеспособности и свойств микроорганизмов при разных сроках хранения: обзор. Пищевая промышленность. 2025; 2: 78–84. https://doi.org/10.52653/PPI.2025.2.2.016

12. Kwon B. S., Park J. S., Shin J.-A., Kim E. S., Lim S. Y., Song M. J., et al. A prospective study on the long-term storage of sputum and the recovery of nontuberculous mycobacteria. Therapeutic Advances in Respiratory Disease. 2023; 17:17534666231162244. https://doi.org/10.1177/17534666231162244

13. Мулюкин А. Л., Демкина Е. В., Кряжевских Н. А., Сузина Н. Е., Воробьева Л. И., Дуда В. И. и др. Покоящиеся формы Micrococcus luteus и Arthrobacter globiformis, не прорастающие на стандартных средах. Микробиология. 2009; 78 (4): 456–468. https://elibrary.ru/kptljf

14. Oliver J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 2010; 34 (4): 415–425. https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2009.00200.x

15. Oliver J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 2005; 43 (Sp): 93–100. https://www.jmicrobiol.or.kr/upload/pdf/jm-43-1-93.pdf

16. Shleeva M., Kondratieva T., Rubakova E., Vostroknutova G., Kaprelyants A., Apt A. Reactivation of dormant “non-culturable” Mycobacterium tuberculosis developed in vitro after injection in mice: Both the dormancy depth and host genetics influence the outcome. Microbial Pathogenesis. 2015; 78: 63–66. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2014.11.016

17. Демина Г. Р., Шлеева М. О., Багаева Д. И., Вострокнутова Г. Н., Капрельянц А. С. Выявление «некультивируемых» клеток Mycobacterium tuberculosis культуральными методами. Прикладная биохимия и микробиология. 2023; 59 (3): 244–252. https://doi.org/10.31857/S0555109923020058

18. Shleeva M. O., Bagramyan K., Telkov M. V., Mukamolova G. V., Young M., Kell D. B., Kaprelyants A. S. Formation and resuscitation of “non-culturable” cells of Rhodococcus rhodochrous and Mycobacterium tuberculosis in prolonged stationary phase. Microbiology. 2002; 148 (5): 1581–1591. https://doi.org/10.1099/00221287-148-5-1581

19. Kaprelyants A. S., Gottschal J. C., Kell D. B. Dormancy in non sporulating bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 1993; 10 (3–4): 271 285. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.1993.tb05871.x

20. Chao M. C., Rubin E. J. Letting sleeping dos lie: does dormancy play a role in tuberculosis? Annual Review of Microbiology. 2010; 64: 293 311. https://doi.org/10.1146/annurev.micro.112408.134043

21. Ионина С. В., Донченко А. С., Гусельникова Е. П., Гордеева Е. И. Микробиологическое и генетическое типирование атипичных микобактерий, выявленных на территории Новосибирской области. Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2024; 54 (8): 75–82. https://doi.org/10.26898/0370-8799-2024-8-8

22. Nouioui I., Brunet L. R., Simpson D., Klenk H.-P., Goodfellow M. Description of a novel species of fast growing mycobacterium: Mycobacterium kyogaense sp. nov., a scotochromogenic strain received as Mycobacterium vaccae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2018; 68 (12): 3726–3734. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.003039