Клинические исследования по оценке эффективности вакцины против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек «Карнифел PCH» при иммунизации котят

ВВЕДЕНИЕ

Инфекции, вызванные вирусом панлейкопении (Feline panleukopenia virus, FPV), калицивирусом (Feline calicivirus, FCV) и герпесвирусом (Feline herpesvirus 1, FHV) у представителей семейства кошачьих, являются основными патогенами кошек, широко распространены во всех странах мира и с каждым годом все чаще регистрируются в России. Без специфического иммунитета данные инфекции могут вызывать развитие заболевания и смертность у кошек. Заразиться кошки могут не только от больного животного, но и от животных-вирусоносителей (возможно латентное вирусоносительство) без явных признаков заболевания, но являющихся переносчиками вирусов и выделяющих их в окружающую среду с каловыми массами, уриной, истечениями из носоглотки [1][2].

Вирусный ринотрахеит кошек (Feline viral rhinotracheitis, возбудитель – Feline herpesvirus 1, FHV) – контагиозное вирусное заболевание, вызываемое FHV и характеризующееся поражением верхних дыхательных путей, конъюнктивитами и кератитами. В случае осложнения вторичной бактериальной инфекцией болезнь может протекать в более тяжелой форме и приводить к гибели животного. Около 80% кошек остаются инфицированными FHV до конца жизни, у них периодически может происходить реактивация вируса, как правило, во время стресса или иммуносупрессии [2][3].

Панлейкопения кошек (Feline panleukopenia, возбудитель – Feline panleukopenia virus, FPV) – высококонтагиозное заболевание вирусной этиологии, характеризующееся лихорадкой, острым геморрагическим энтеритом, лейкопенией, обезвоживанием организма и высокой летальностью (от 25 до 100%) [1][4][5].

Калицивироз кошек (калицивирусная инфекция кошек, возбудитель – Feline calicivirus, FCV) – высококонтагиозное вирусное заболевание, характеризующееся преимущественно поражением слизистой ротовой полости и верхних дыхательных путей. По литературным данным, FCV обнаруживали в 18–30% случаев заболеваний, связанных с поражением верхних дыхательных путей. Также широко распространено вирусоносительство (до 75%), особенно среди бродячих кошек [2][6][7]. Помимо часто встречающихся симптомов язвенного стоматита, ринита и конъюнктивита, заболевание может проявляться хромотой, отеками головы и конечностей, пневмонией, некрозами языка и нёба, поражением желудочно-кишечного тракта. В различных источниках описана системная инфекция, вызывающая гибель до 60% заболевших животных. Калицивирус характеризуется высокой степенью изменчивости и большим антигенным разнообразием штаммов, что значительно снижает эффективность существующих вакцин [7][8].

Вирусы FPV, FHV, FCV распространены повсеместно и поражают домашних кошек всех пород и возрастов, а также зоопарковых и диких представителей семейства кошачьих.

Для специфической профилактики вирусных болезней кошек применяют живые и инактивированные моно- и ассоциированные вакцины. На эффективность иммунизации против вирусных инфекций оказывают большое влияние материнские антитела, которые обычно сохраняются у котят до 8–12-недельного возраста, а иногда и больше. При вакцинации котят имеется критический период, или «окно восприимчивости», когда материнские специфические антитела нейтрализуют вакцинный вирус, но не предохраняют от заражения полевыми вирулентными вирусами. Наличие у котят специфических материнских антител в высоких титрах препятствует развитию поствакцинального иммунитета и, как следствие, влияет на исход иммунизации [2][9][10][11]. Уровень материнских антител у животных отличается в разных пометах, а также у отдельных котят в одном помете в зависимости от уровня антител в молозиве кошек и количества поглощенного котятами молозива. Поэтому в обычной практике первую основную вакцинацию проводят котятам в возрасте 8–9 нед. (или раньше – тем котятам, которые относятся к группе особого риска, или тем, которые содержатся в приютах для бездомных животных) с последующим введением дополнительных доз с интервалом 2–4 нед. до достижения возраста 12–16 нед. или старше с расчетом на то, что одна из этих прививок придется на период после блокирующего эффекта материнских антител и до контакта с вирулентными полевыми вирусами. Три международные группы экспертов: Консультативная группа по вакцинам для кошек Американской ассоциации врачей-фелинологов (AAFP), Группа по разработке руководства по вакцинации собак и кошек Всемирной ветеринарной ассоциации мелких животных (WSAVA VGG) и Европейский консультативный совет по болезням кошек (ABCD) – предоставили ветеринарным врачам рекомендации по использованию вакцин для кошек. Несмотря на некоторые различия, все три группы рекомендуют бустеры для основных вакцин с интервалом более одного года. Актуальной в настоящее время рекомендацией для вакцинации против возбудителей инфекции FHV и FCV является первичная вакцинация двумя инъекциями с интервалом в 3–4 нед. с ревакцинацией через 1 год. Последующие бустеры следует вводить каждые 3 года, за исключением ситуаций высокого риска [4][10][11][12][13][14][15].

В отличие от вакцин против панлейкопении, которые обеспечивают длительную полную защиту кошек, иммунологические препараты против вирусного ринотрахеита и калицивирусной инфекции существенно снижают частоту клинических случаев, но не обеспечивают полной защиты, и иммунитет, вызванный вакциной, может снижаться со временем, требуя регулярной ревакцинации [16][17][18]. Поэтому, наряду с антигеном FPV, FCV и FHV считаются основными компонентами вакцины, которые должны получать все кошки независимо от возраста и пола [2][4][19].

Вакцины против калицивироза не обеспечивают полной защиты из-за широкого спектра генетической и антигенной изменчивости вируса [8][20], что приводит к низкой эффективности препаратов и неспособности полностью предотвратить заражение полевыми вирулентными штаммами возбудителя и дальнейшую передачу вируса среди кошек [7][8]. В течение нескольких десятилетий в составе коммерческих вакцин для кошек использовались вакцинные штаммы F9 или 255 калицивируса либо комбинация двух вакцинных штаммов G1 и 431, однако в некоторых источниках обсуждается, что из-за высокой частоты мутаций FCV данные препараты не всегда эффективны [16][17][21]. Кроме того, вакцины против калицивироза или вирусного ринотрахеита не предотвращают инфекцию, а, скорее, уменьшают тяжесть клинических симптомов и иногда выделение вируса [6][9][10][21][22][23][24]. Хотя коммерческие ассоциированные вакцины против панлейкопении, вирусного ринотрахеита и калицивирусной инфекции широко применяются во всем мире, приводя к существенному снижению как заболеваемости, так и смертности, тем не менее данные вирусные заболевания по-прежнему распространены среди кошек в различных странах, в том числе на территории Российской Федерации. При разработке вакцин против указанных инфекционных болезней кошек важно учитывать большое разнообразие генотипов FCV, а также генетическую и антигенную изменчивость данных вирусов. В связи с этим обновление штаммового состава вакцин против панлейкопении, вирусного ринотрахеита и калицивироза кошек в настоящее время является актуальной необходимостью.

Таким образом, вопрос формирования специфической защиты, направленной против FPV, FCV, FHV, и предотвращение распространения среди представителей семейства кошачьих вызываемых данными возбудителями заболеваний имеет первостепенное значение для обеспечения ветеринарного благополучия страны.

На основании вышеизложенного перед подведомственным Россельхознадзору ФГБУ «ВНИИЗЖ» была поставлена задача разработать и зарегистрировать на территории Российской Федерации безопасную и эффективную против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита вакцину для кошек.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Разработка и контроль качества вакцины «Карнифел PCH» против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек были проведены согласно требованиям Федерального закона № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» и приказа Минсельхоза России № 101 «Об утверждении правил проведения доклинического исследования лекарственного средства для ветеринарного применения, клинического исследования лекарственного препарата для ветеринарного применения, исследования биоэквивалентности лекарственного препарата для ветеринарного применения».

Вакцина. Действующим веществом вакцины «Карнифел PCH» являются инактивированные вирус панлейкопении кошек (штамм «Шеба»), калицивирус кошек (штамм «Перс» генотип I и штамм «Фауна» генотип II) и герпесвирус кошек (штамм «Лавр»). В качестве адсорбента применяется гидроокись алюминия. Все компоненты вакцины проходят всесторонний входной контроль качества, включая контроль стерильности и полноты инактивации антигенов в культуре клеток почки кошки CRFK в трех последовательных пассажах.

Животные. Клинические исследования проводились с использованием котят 8–12-недельного возраста (n = 37) из разных пометов, рожденных от серонегативных, невакцинированных кошек, содержавшихся в домашних условиях, ветеринарном госпитале и приютах для животных.

Все процедуры, выполненные с участием животных, соответствовали этическим стандартам, принятым Европейской конвенцией ETS № 123, и одобрены Комиссией по биоэтике ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Серологические исследования. Исследование сывороток крови котят, полученных до и через 7, 14, 21, 28, 35, 42 сут после вакцинации, а затем отбираемых каждый месяц в течение года, на наличие антител к FPV проводили методом ингибирования гемагглютинации (HI, РТГА – реакция торможения гемагглютинации), к FCV и FHV – методом нейтрализации вируса (VN, РН – реакция нейтрализации). Перед исследованием сыворотки крови инактивировали прогреванием при температуре 56 °С в течение 30 мин.

Метод ингибирования гемагглютинации (HI, РТГА). При постановке реакции 25 мкл термоинактивированного образца сыворотки подвергали двукратным последовательным разведениям начиная с 1:10 физиологическим раствором с фосфатным буфером (рН 6,8) на 96-луночном микропланшете с U-образным дном. Затем к разведенным сывороткам добавляли равный объем FPV, содержащий 8 гемагглютинирующих единиц (HA). После часовой инкубации в каждую лунку добавляли 0,8%-е свиные эритроциты, инкубировали в течение ночи при 4 °C. Учет реакции проводили визуально после полного оседания эритроцитов в контрольных лунках (в виде пуговки). Результат реакции считали положительным, если исследуемая сыворотка содержала специфические к FPV антитела в титре ≥ 1:40 (≥ 5,3 log₂ HI) и выше. Титр антител выражался в максимальном разведении сыворотки с полным подавлением гемагглютинации (HA).

Метод нейтрализации вируса (VN, РН). Для определения уровня нейтрализующих FCV и FHV антител использовали монослойную перевиваемую линию клеток почки кошки CRFK (Crandell-Rees Feline Kidney). Титр антител устанавливали путем последовательного разведения образца сыворотки крови, который затем добавлялся к стандартному количеству вируса: 50 мкл разведенной сыворотки и 50 мкл инфекционной культуральной среды, содержащей 100 TCID₅₀ выбранного штамма вируса, смешивали и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C и 5% CO₂. По истечении времени инкубации смесь вирус – антитело инокулировали в клеточные культуры CRFK в 96-луночные микропланшеты с поверхностью дна CellBIND. Каждое разведение сыворотки тестировали с использованием четырех лунок на разведение. Культуры инкубировали в течение 5 дней при 37 °C и 5% CO₂. Реакцию учитывали визуально при помощи микроскопа. Титр вируснейтрализующих антител определяли как величину, обратную наибольшему разведению, которое предотвращало инфицирование клеток (VN).

Статистический анализ результатов. Обработка полученных данных производилась с использованием статистических методов в программе Microsoft Exсel. Определяли среднегрупповые значения титров и стандартное отклонение. Расчет титра специфических антител осуществляли по формуле Кербера и выражали в логарифмах с основанием 2 (log₂).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для клинических исследований по оценке эффективности вакцинации против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек препаратом «Карнифел PCH» были отобраны беспородные котята из разных пометов в возрасте 8–12 недель (n = 37), которым вводили вакцину подкожно двукратно с интервалом в 21 сут в объеме 1,0 см³. За животными после вакцинации вели клиническое наблюдение и в течение 10 дней измеряли температуру тела.

На рисунке 1 представлена динамика среднегрупповой температуры тела у животных после вакцинации. Было установлено, что на протяжении 10 дней после первой иммунизации температура у котят оставалась в пределах нормы, угнетения и отказа от корма у животных не наблюдалось.

В процессе наблюдения за привитыми животными установлено, что в течение 21 сут после первой иммунизации и после бустерной вакцинации котята оставались здоровыми, каких-либо изменений в поведении и клинических симптомов заболевания панлейкопенией, калицивирусной инфекцией и вирусным ринотрахеитом не регистрировали, что указывает на безопасность используемой вакцины.

Исследование проб сывороток крови, отобранной от котят до вакцинации, показало, что животные были серонегативными к FCV и FHV (по данным РН), к FPV специфические антитела (по данным РТГА) определялись в титре ≤ 1:20 (4,3 log₂ HI).

На рисунке 2 отражена динамика формирования гуморального иммунного ответа у котят на введение вакцины «Карнифел PCH». Было установлено, что иммунная система животных активно реагировала на входящие в состав препарата антигены, концентрация антител к FCV, FHV и FPV со временем монотонно нарастала. Уровень антител к FPV был выше порогового значения ≥ 1:40 к 14-м сут после первой вакцинации, максимальных показателей (1:640–1:1280) титры достигли на 42-е сут и сохранялись на протяжении всего периода исследования.

После двукратного введения вакцины все котята на 35-е сут имели высокий уровень специфических антител к FCV, FHV и FPV. Так, среднегрупповой титр вируснейтрализующих антител к вирусу FHV (шт. «Лавр») составил 6,3 log₂, к FCV (шт. «Фауна») – 6,5 log₂, к FCV (шт. «Перс») – 7,2 log₂; среднегрупповой титр специфических антител к FPV (шт. «Шеба») был на уровне 10,3 log₂ HI.

Среднегрупповые титры, установленные на 7, 14, 21-е сут после вакцинации, достоверно отличались от аналогичного показателя на 35-е сут (р ≥ 0,1). При этом средние величины титров, выявленные на 35-е и 42-е сут, были статистически тождественны (р ≥ 0,05). В биологическом смысле это означало, что период до 35-х сут соответствовал активной фазе формирования гуморального иммунитета, период после 35-х сут – фазе стабилизации. На основании полученных данных сделали вывод, что после двукратной вакцинации препаратом «Карнифел PCH» напряженный гуморальный иммунный ответ у котят формируется к 35-м сут, т. е. через 14 сут после повторной вакцинации.

Для оценки напряженности поствакцинального иммунитета к возбудителям панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита проводили отбор проб крови у котят каждый месяц в течение года. Исследования полученных сывороток крови показали, что в течение 12 мес. средний уровень специфических антител к FHV находился в диапазоне от 4,0 до 6,5 log₂, к FCV (шт. «Перс») – от 5,5 до 7,0 log₂, к FCV (шт. «Фауна») – от 5,0 до 6,0 log₂ (в РН), к FPV – от 9,0 до 10,0 log₂ HI (в РТГА).

Как видно из представленных на рисунке 3 данных, у котят наблюдалось незначительное снижение уровня специфических антител, который к 14-месячному возрасту в среднем по группе составил: к FHV – 3,8 log₂, к FCV (шт. «Перс») – 5,5 log₂, к FCV (шт. «Фауна») – 5,2 log_2, к FPV – 9,0 log₂ HI. Через месяц после ревакцинации препаратом «Карнифел PCH» однократно подкожно в дозе 1,0 см³, проведенной через год, у котят производили отбор проб крови для исследований. Результаты показали, что в среднем по группе уровень специфических антител к FHV повысился на 2,3 log₂, к FCV (шт. «Перс») – на 1,6 log₂, к FCV (шт. «Фауна») – на 1,1 log₂ (в РН), к FPV – на 1,2 log₂ HI (в РТГА).

Таким образом, на основании полученных данных установлено, что вакцина против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек «Карнифел PCH» индуцировала сероконверсию при бустерном подкожном введении в дозе 1,0 см³ с интервалом 21 сут, продолжительность иммунитета составила не менее 12 мес.

Большинство руководств по вакцинации кошек рекомендуют применять базовую схему вакцинации – с первичной иммунизацией и последующей ревакцинацией через год [4][10][11][14][25]. В нашем исследовании использована та же схема проведения иммунизации кошек, которая показала свою эффективность при вакцинации препаратом «Карнифел PCH», что выражалось в формировании напряженного иммунитета и после ревакцинации приводило к выработке специфических антител к FPV, FHV и FCV на высоком уровне.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании проведенных исследований пришли к выводу, что вакцина вызывает формирование иммунного ответа у кошек против возбудителей панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита через 14 сут после двукратного введения с интервалом в 21 сут. Продолжительность иммунитета против указанных заболеваний составляет не менее 12 мес. При изучении динамики напряженности поствакцинального иммунитета против FPV, FCV и FHV у котят, привитых вакциной «Карнифел PCH», была доказана ее специфическая эффективность. Результаты серологических исследований в РТГА и РН показали наличие выраженного гуморального иммунного ответа.

В ходе испытаний продемонстрировано, что разработанный иммунобиологический препарат обладает хорошей переносимостью при введении котятам в 8–12-недельном возрасте. Двукратная иммунизация животных с интервалом в 21 сут в дозе 1,0 см³ индуцирует выработку антител к FCV, FHV и FPV в высоких титрах. Было установлено, что вакцина против панлейкопении, калицивироза и вирусного ринотрахеита кошек «Карнифел PCH» безвредна, ареактогенна и иммуногенна и может быть рекомендована для кошек с целью профилактики данных инфекций.

Риск заражения кошек инфекционными заболеваниями велик в любом возрасте, поэтому важно понимать необходимость иммунизации, которая позволяет контролировать заболеваемость. Вакцинация даже одного животного является существенным вкладом в предотвращение распространения инфекционных заболеваний в популяции семейства кошачьих. Чем больше процент вакцинированных животных в своей популяции, тем меньше риск возникновения эпизоотий.