Разработка тест-системы для выявления генома вируса бешенства на основе ПЦР в режиме реального времени с использованием эндогенного контроля: теоретический дизайн и оптимизация

Введение. Бешенство в России, несмотря на снизившуюся в последние десять лет инцидентность, остается крайне актуальным заболеванием. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в разных вариантах является одним из методов обнаружения и характеристики вируса бешенства в патологическом материале. Для обеспечения надежной диагностики при разработке ПЦР должны быть учтены актуальные данные по генетическим особенностям изолятов, циркулирующих на определенной территории.

Цель исследования. Выполнение теоретического дизайна и оптимизация тест-системы на основе совмещенной обратной транскрипции – полимеразной цепной реакции (С-ОТ-ПЦР) для выявления фрагмента генома вируса бешенства с использованием эндогенного внутреннего контроля.

Материалы и методы. В работе использованы вакцинный штамм вируса бешенства «РВ-97» и лабораторный фиксированный штамм вируса бешен ства «CVS», образцы головного мозга животных разных видов, положительные и отрицательные на вирус бешенства. Дизайн олигонуклеотидов и проверку специфичности in silico осуществляли с помощью онлайн-сервиса Primer Blast. Для проведения С-ОТ-ПЦР использованы реактивы НПК «Синтол» (Россия).

Результаты. В результате анализа 193 последовательностей гена N изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории России и сопредельных государств, был разработан дизайн шести праймеров и двух TaqMan-зондов. Экспериментальным путем из них были выявлены лучшие два праймера и зонд для создания тест-системы. В ходе серии экспериментов были оптимизированы такие параметры С-ОТ-ПЦР, как концентрация олигонуклеотидов, концентрация ионов магния и температура отжига. Для проведения контроля условий реакции в каждой пробирке была разработана система олигонуклеотидов для амплификации и детекции участка гена бета-актина млекопитающих. Экспериментально продемонстрирована возможность одновременного применения двух систем ПЦР в одной пробирке. Анализ 193 последовательностей гена N различных изолятов вируса бешенства показал, что разработанные олигонуклеотиды теоретически могут обеспечивать выявление подавляющего большинства вирусов, циркулирующих на территории Российской Федерации и сопредельных государств.

Заключение. Разработаны и оптимизированы основные компоненты и условия реакции тест-системы для выявления генома вируса бешенства методом С-ОТ-ПЦР с использованием эндогенного внутреннего контроля на основе гена бета-актина млекопитающих.

1. Гулюкин А. М., Шабейкин А. А. Обзор современной эпизоотической ситуации по бешенству в Российской Федерации. Динамика изменений за 35-летний период, закономерности, влияющие факторы. Ветеринария сегодня. 2025; 14 (3): 232–240. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2025-14-3-232-240

2. ГОСТ 26075-2013 Животные. Методы лабораторной диагностики бешенства. https://docs.cntd.ru/document/1200104625

3. Хисматуллина Н. А., Юсупов Р. Х., Чернов А. Н., Янбарисова С. Р., Тятигачев Ш. А., Селимов М. А. и др. Методические указания по лабораторной диагностике бешенства животных: утв. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 14.05.1997. 11 с.

4. Rabies (infection with rabies virus and other lyssaviruses). In: WOAH. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 2023; Chapter 3.1.18. https://www.woah.org/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.18_RABIES.pdf

5. International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). MSL41: 2025 2026 ICTV taxonomy release. International 2026. https://ictv.global/msl

6. Полещук Е. М., Кузьмин И. В., Газарян С. В., Ботвинкин А. Д. Западно- кавказский лиссавирус рукокрылых: отсутствие вакцинной защиты. Plecotus et al. 2003; (6): 67–71.

7. Botvinkin A. D., Poleschuk E. M., Kuzmin I. V., Borisova T. I., Gazaryan S. V., Yager P., Rupprecht C. E. Novel lyssaviruses isolated from bats in Russia. Emerging Infectious Diseases. 2003; 9 (12): 1623–1625. https://doi.org/10.3201/eid0912.030374

8. Leonova G. N., Somova L. M., Belikov S. I., Kondratov I. G., Plekhova N. G., Krylova N. V., et al. The fatal case of lyssavirus encephalitis in the Russian Far East. In: Encephalitis. Ed. by S. E. Tkachev. Croatia: InTechOpen; 2013; Chapter 13: 231–250. https://doi.org/10.5772/52869

9. Полещук Е. М., Тагакова Д. Н., Сидоров Г. Н., Орлова Т. С., Гордей ко Н. С., Кайсаров А. Ж. Случаи летальной лиссавирусной инфекции у людей после контактов с рукокрылыми на Дальнем Востоке России в 2019–2021 гг. Вопросы вирусологии. 2023; 68 (1): 45–58. https://doi.org/10.36233/0507-4088-156

10. Badrane H., Tordo N. Host switching in Lyssavirus history from the Chiroptera to the Carnivora orders. Journal of Virology. 2001; 75 (17): 8096 8104. https://doi.org/10.1128/jvi.75.17.8096-8104.2001

11. Bourhy H., Reynes J.-M., Dunham E. J., Dacheux L., Larrous F., Huong V. T., et al. The origin and phylogeography of dog rabies virus. Journal of General Virology. 2008; 89 (11): 2673–2681. https://doi.org/10.1099/vir.0.2008/003913-0

12. Kuzmin I. V., Hughes G. J., Botvinkin A. D., Gribencha S. G., Rupprecht C. E. Arctic and Arctic-like rabies viruses: distribution, phylogeny and evolutionary history. Epidemiology and Infection. 2008; 136 (4): 509 519. https://doi.org/10.1017/s095026880700903x

13. Kuzmin I. V., Shi M., Orciari L. A., Yager P. A., Velasco-Villa A., Kuzmina N. A., et al. Molecular inferences suggest multiple host shifts of rabies viruses from bats to mesocarnivores in Arizona during 2001–2009. PLoS Pathogens. 2012; 8 (6):e1002786. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002786

14. Biek R., Henderson J. C., Waller L. A., Rupprecht C. E., Real L. A. A high-resolution genetic signature of demographic and spatial expansion in epizootic rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2007; 104 (19): 7993–7998. https://doi.org/10.1073/pnas.0700741104

15. Davis R., Nadin-Davis S. A., Moore M., Hanlon C. Genetic characterization and phylogenetic analysis of skunk-associated rabies viruses in North America with special emphasis on the central plains. Virus Research. 2013; 174 (1–2): 27–36. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2013.02.008

16. Kuzmina N. A., Lemey P., Kuzmin I. V., Mayes B. C., Ellison J. A., Orciari L. A., et al. The phylogeography and spatiotemporal spread of south-central skunk rabies virus. PLoS ONE. 2013; 8 (12):e82348. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0082348

17. Bourhy H., Kissi B., Audry L., Smreczak M., Sadkowska-Todys M., Kulonen K., et al. Ecology and evolution of rabies virus in Europe. Journal of General Virology. 1999; 80 (10): 2545–2557. https://doi.org/10.1099/0022-1317-80-10-2545

18. Nel L. H., Sabeta C. T., von Teichman B., Jaftha J. B., Rupprecht C. E., Bingham J. Mongoose rabies in southern Africa: a re-evaluation based on molecular epidemiology. Virus Research. 2005; 109 (2): 165–173. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2004.12.003

19. Oem J.-K., Kim S.-H., Kim Y.-H., Lee M.-H., Lee K.-K. Complete genome sequences of three rabies viruses isolated from rabid raccoon dogs and a cow in Korea. Virus Genes. 2013; 47 (3): 563–568. https://doi.org/10.1007/s11262-013-0923-1

20. Tsai K. J., Hsu W. C., Chuang W. C., Chang J. C., Tu Y. C., Tsai H. J., et al. Emergence of a sylvatic enzootic formosan ferret badger-associated rabies in Taiwan and the geographical separation of two phylogenetic groups of rabies viruses. Veterinary Microbiology. 2016; 182: 28–34. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2015.10.030

21. Zhao J., Liu Y., Zhang S., Zhang F., Wang Y., Mi L., et al. Molecular characterization of three ferret badger (Melogale moschata) rabies virus isolates from Jiangxi province, China. Archives of Virology. 2014; 159 (8): 2059–2067. https://doi.org/10.1007/s00705-014-2044-0

22. Kuzmin I. V., Botvinkin A. D., McElhinney L. M., Smith J. S., Orciari L. A., Hughes G. J., et al. Molecular epidemiology of terrestrial rabies in the former Soviet Union. Journal of Wildlife Diseases. 2004; 40 (4): 617–631. https://doi.org/10.7589/0090-3558-40.4.617

23. Deviatkin A. A., Lukashev A. N., Poleshchuk E. M., Dedkov V. G., Tkachev S. E., Sidorov G. N., et al. The phylodynamics of the rabies virus in the Russian Federation. PLoS ONE. 2017; 12 (2):e0171855. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0171855

24. Chupin S. A., Sprygin A. V., Zinyakov N. G., Guseva N. A., Shcherbinin S. V., Korennoy F. I., et al. Phylogenetic characterization of rabies virus field isolates collected from animals in European Russian Regions in 2009–2022. Microorganisms. 2023; 11 (10):2526. https://doi.org/10.3390/microorganisms11102526

25. Bustin S. A., Ruijter J. M., van den Hoff M. J. B., Kubista M., Pfaffl M. W., Shipley G. L., et al. MIQE 2.0: Revision of the Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments Guidelines. Clinical Chemistry. 2025; 71 (6): 634–651. https://doi.org/10.1093/clinchem/hvaf043

26. Validation of diagnostic assays for infectious diseases of terrestrial animals. In: WOAH. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 2023; Chapter 1.1.6. https://www.woah.org/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/1.01.06_VALIDATION.pdf

27. Mittelberger C., Obkircher L., Oberkofler V., Ianeselli A., Kerschbamer C., Gallmetzer A., et al. Development of a universal endogenous qPCR control for eukaryotic DNA samples. Plant Methods. 2020; 16:53. https://doi.org/10.1186/s13007-020-00597-2

28. Hall T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. 1999; 41: 95–98.

29. Troupin C., Dacheux L., Tanguy M., Sabeta C., Blanc H., Bouchier C., et al. Large-scale phylogenomic analysis reveals the complex evolutionary history of rabies virus in multiple carnivore hosts. PLoS Pathogens. 2016; 12 (12):e1006041. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006041

30. Bustin S., Huggett J. qPCR primer design revisited. Biomolecular Detection and Quantification. 2017; 14: 19–28. https://doi.org/10.1016/j.bdq.2017.11.001

31. Freuling C. M., Hoffmann B., Fischer M., McElhinney L. M., Marston D. A., Fooks A. R., Müller T. F. Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction for the Demonstration of Lyssavirus Nucleic Acid. In: Current Laboratory Techniques in Rabies Diagnosis, Research, and Prevention. Ed. by C. Rupprecht, T. Nagarajan. San Diego: Academic Press; 2014; Chapter 7: 75–84. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-800014-4.00007-X

32. Toussaint J. F., Sailleau C., Breard E., Zientara S., De Clercq K. Bluetongue virus detection by two real-time RT-qPCRs targeting two different genomic segments. Journal of Virological Methods. 2007; 140 (1–2): 115–123. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2006.11.007

33. Fischer M., Wernike K., Freuling C. M., Müller T., Aylan O., Brochier B., et al. A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses – results of a ring trial among European laboratories. PLoS ONE. 2013; 8 (3):e58372. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0058372

34. Wakeley P. R., Johnson N., McElhinney L. M., Marston D., Sawyer J., Fooks A. R. Development of a real-time, TaqMan reverse transcription-PCR assay for detection and differentiation of lyssavirus genotypes 1, 5, and 6. Journal of Clinical Microbiology. 2005; 43 (6): 2786–2792. https://doi.org/10.1128/jcm.43.6.2786-2792.2005

35. Stuchin M., Machalaba C. M., Olival K. J., Artois M., Bengis R. G., Caceres-Soto P., et al. Rabies as a threat to wildlife. Revue Scientifique et Technique. 2018; 37 (2): 341–357. https://doi.org/10.20506/rst.37.2.2858

36. Nakajima-Iijima S., Hamada H., Reddy P., Kakunaga T. Molecular structure of the human cytoplasmic beta-actin gene: interspecies homology of sequences in the introns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1985; 82 (18): 6133–6137. https://doi.org/10.1073/pnas.82.18.6133

37. Vedula P., Kurosaka S., Leu N. A., Wolf Y. I., Shabalina S. A., Wang J., et al. Diverse functions of homologous actin isoforms are defined by their nucleotide, rather than their amino acid sequence. eLife. 2017; 6:e31661. https://doi.org/10.7554/elife.31661

38. Chupin S. A., Botvinkin A. D., Zarva I. D., Chernyshova E. V. Phylogenetic analysis and the spatial spread of arctic rabies virus in Chukotka. Acta Biologica Sibirica. 2024; 10: 1805–1817. https://doi.org/10.5281/zenodo.14555704

39. Чупин С. А., Чернышова Е. В., Чернышев Р. С., Груздев К. Н., Спи ридонов А. Н., Варкентин А. В. и др. Филогенетический анализ изолятов вируса бешенства, выделенных от животных на территории Волго градской области. Ветеринария сегодня. 2025; 14 (3): 241–248. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2025-14-3-241-248

40. Ботвинкин А. Д., Зарва И. Д., Мельцов И. В., Чупин С. А., Полещук Е. М., Зиняков Н. Г. и др. Возвращение бешенства после многолетнего межэпизоотического периода (Амурская область, Россия). Ветеринария сегодня. 2022; 11 (4): 309–318. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2022-11-4-309-318

41. Yakovchits N. V., Adelshin R. V., Zarva I. D., Chupin S. A., Melnikova O. V., Andaev E. I., et al. Fox rabies outbreaks in the republic of Buryatia: Connections with neihbouring areas of Russia, Mongolia and China. Transboundary and Emerging Diseases. 2021; 68 (2): 427–434. https://doi.org/10.1111/tbed.13692

42. Дедков В. Г., Девяткин А. А., Полещук Е. М., Сафонова М. В., Маркелов М. Л., Шипулин Г. А. Разработка и апробация набора реагентов для определения РНК классического вируса бешенства методом ОТ ПЦР в реальном времени. Вопросы вирусологии. 2016; 61 (5): 235–240. https://doi.org/10.18821/0507-4088-2016-61-4-235-240

43. Allawi H. T., Santa Lucia J. Jr. Thermodynamics and NMR of internal G.T mismatches in DNA. Biochemistry. 1997; 36 (34): 10581–10594. https://doi.org/10.1021/bi962590c

44. Kubista M., Andrade J. M., Bengtsson M., Forootan A., Jonák J., Lind K., et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine. 2006; 27 (2–3): 95–125. https://doi.org/10.1016/j.mam.2005.12.007

45. de Almeida Campos A. C., Melo F. L., Romano C. M., Araujo D. B., Cunha E. M. S., Sacramento D. A. V., et al. One-step protocol for amplification of near full-length cDNA of the rabies virus genome. Journal of Virological Methods. 2011; 174 (1–2): 1–6. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2011.03.030