Индикация бактерий Listeria monocytogenes при оценке микробиологической контаминации сырья и продуктов животного происхождения

ВВЕДЕНИЕ

Листериоз – инфекционное заболевание большинства видов сельскохозяйственных и домашних животных (свиньи, лошади, крупный и мелкий рогатый скот, кролики, куры, утки) и человека. Экономический ущерб от этой болезни определяется снижением продуктивности животных, затратами на лечебно-профилактические и карантинно-ограничительные мероприятия. В России и других странах мира количество заболеваний пищевого происхождения, в том числе листериоза, не снижается [1, 2, 3]. Листериоз занимает пятое место среди наиболее часто регистрируемых зоонозов у людей в странах Европейского союза и является одним из наиболее значимых заболеваний пищевого происхождения [4]. Инфекция, вызванная бактериями Listeria monocytogenes, особенно опасна для беременных женщин (приводит к выкидышам), младенцев (гибель новорожденных) и людей с ослабленной иммунной системой [5]. Описаны случаи листериозной инфекции у беременных женщин и их новорожденных детей в Республике Дагестан [6]. В 2021 г. в Воронежской области у пациента с коронавирусной инфекцией был выявлен листериозный менингоэнцефалит [7]. В 2022 г. в Тульском регионе зарегистрирован случай неонатального листериоза [8].

В Российской Федерации листериоз животных фиксируется с 1956 г., в медицине регистрация и учет листериоза людей как самостоятельной нозологической формы была введена Минздравом России в 1992 г. [9, 10]. По данным Государственного доклада Роспотребнадзора, за 2023 г. в РФ было зарегистрировано 100 случаев листериоза (18 смертей). Больше всего случаев инфицирования в мегаполисах: в г. Москве (32 случая) и г. Санкт-Петербурге (19 случаев) [11].

Особенностью листерий является широкий температурный диапазон роста – от 4 до 45 °C (оптимум 36–38 ºC) и диапазон рН 5–11 [12]. Установлено, что L. monocytogenes погибают при нагревании до 100 °С в течение 3–5 мин, до 75–90 °С – за 20 мин [13]. Листерии устойчивы во внешней среде [14, 15], развиваются в присутствии высокой концентрации хлорида натрия и углекислоты, способны выдерживать замораживание и высушивание. Они могут выживать в бескислородной среде, паразитировать внутриклеточно [16].

Инфицирование листериями, как правило, происходит при употреблении в пищу контаминированных продуктов животного происхождения, в том числе рыбы и морепродуктов, которые не были подвергнуты достаточной термической обработке, а также овощей и фруктов [17]. Большое количество случаев возникновения листериозов (15–20%) связано с употреблением зараженного мяса домашних животных и птицы (15–80%) [18]. В Эфиопии, по данным X. Wei et al., L. monocytogenes была выявлена в сыром и пастеризованном молоке [19]. Центр по контролю и профилактике заболеваний США (CDC) сообщает, что в 2022 г. сыр, произведенный компанией Old Europe Cheese, Inc., вызвал заболевание людей листериозом. В 2022 г. источником вспышек листериоза в штатах Флорида и Огайо послужило мороженое марки Big Olaf. В 2023 г. CDC сообщило о вспышках листериоза, связанных с употреблением в пищу листовой зелени, а также персиков, нектаринов и слив [20]. В нескольких штатах США в 2024 г. мясные деликатесы, а также ливерная колбаса марки Boar’s Head были контаминированы листериями, что привело к заболеванию и смерти людей [21, 22]. По данным ряда авторов, инфекция может развиться даже при относительно небольшой концентрации бактерий в продуктах питания (102 КОЕ/г) [23].

По данным издания Food Safety News, в 2022 г. в Швейцарии Федеральное управление общественного здравоохранения (OFSP) и Федеральное управление по безопасности пищевых продуктов и ветеринарии (OSAV) сообщили о вспышке листериоза, причиной которой послужила копченая форель [24].

Таким образом, выявление патогенных видов Listeria в продуктах животного происхождения, пищевом сырье и готовых пищевых продуктах является актуальной задачей.

Целью работы было определение контаминации бактериями L. monocytogenes продуктов животного происхождения (мясных, рыбных, молочных), произведенных и реализуемых в Нижегородской области в период с 2023 по 2024 г.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалами для исследования послужили пробы продуктов животного происхождения, в том числе пищевое сырье и готовые продукты, поступившие на исследование в испытательную лабораторию Нижегородского филиала ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Объекты исследования. Всего было исследовано 3650 проб продуктов животноводства и рыбоводства, отобранных в период с 2023 по 2024 г. в птицеводческих хозяйствах и торговых сетях Нижегородской области Российской Федерации.

Отбор проб. Для исследования отбирали образцы продукции на разных сроках хранения (в пределах сроков годности) в соответствии с установленными требованиями отбора проб для микробиологических испытаний. Доставку их в лабораторию осуществляли в сумке-холодильнике. Время доставки не превышало 1 ч.

Питательные среды: бульон Фрейзера (ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Россия); ALOA – агар Listeria пo Оттавиани и Агости (Merсk, Германия); ПАЛКАМ-агар (HiMedia Laboratories Pvt Ltd., Индия); кровяной агар («Средофф», Россия).

Методы. Исследование проб, а также идентификацию чистой культуры микроорганизмов по совокупности морфологических и биохимических признаков, определяющих принадлежность к L. monocytogenes, осуществляли в соответствии с ГОСТ 32031-2022 «Продукты пищевые. Методы выявления бактерий Listeria monocytogenes и других видов Listeria (Listeria spp.)»¹.

Препараты из чистых культур микроорганизмов фиксировали, окрашивали по Граму, микроскопировали и идентифицировали по способности к росту при 25 °С, β-гемолизу, продукции каталазы, реакции Фогеса – Проскауэра, ферментации ксилозы и рамнозы, лецитиназной активности. Для идентификации использовали тест-систему API Listeria (bioMérieux, Франция), включающую 10 биохимических тестов.

Для определения L. monocytogenes в пробах продуктов применяли автоматический анализатор miniVidas и тест-набор Vidas Listeria (bioMérieux, Франция).

Для статистической обработки информации и построения диаграмм использовали приложение Microsoft Excel и стандартные статистические приемы обработки данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В период с 2023 по 2024 г. на базе испытательной лаборатории Нижегородского филиала ФГБУ «ВНИИЗЖ» на наличие L. monocytogenes провели исследование 3650 проб продуктов животного происхождения: 680 проб молочных, 615 проб рыбных и 2355 проб мясных продуктов. Образцы мясных продуктов, не подверженных тепловой обработке, были представлены 323 пробами говядины, 834 пробами мяса птицы, 326 про- бами мясных полуфабрикатов смешанного состава и 288 пробами свинины. Также было испытано 584 пробы готовых продуктов мясного происхождения, из них 187 проб мяса птицы и 397 проб мясных изделий, готовых к употреблению, кроме изделий из мяса птицы. К готовым мясным изделиям относились желированные продукты, колбасы, паштеты, а также мясные и мясосодержащие кулинарные изделия, прошедшие термическую обработку и готовые к употреблению мясные продукты, за исключением колбас.

В результате проведенных исследований было установлено, что изоляты бактерий имели морфологию клеток, характерную для листерий, окрашивались грамположительно, были каталазоположительными, демонстрировали положительную реакцию Фогеса – Проскауэра, были подвижны при температуре (25 ± 1) °C, ферментировали рамнозу и не сбраживали ксилозу, проявляли лецитиназную активность на среде с активированным углем и образовывали зону β-гемолиза на кровяном агаре. Таким образом, идентификация чистых культур бактерий, выделенных из контаминированных проб исследованных продуктов, показала, что все они принадлежали к виду L. monocytogenes.

Результаты испытаний продуктов животного происхождения, произведенных и реализуемых в Нижегородской области в период с 2023 по 2024 г., представлены в таблице 1.

В течение 2023 г. при проведении исследований был выявлен 41 образец, контаминированный бактериями L. monocytogenes, что составило 2,1% от всех протестированных проб (N = 1970). Доля обнаружения листерий в замороженных и охлажденных продуктах статистически не различалась и составила 1,1 и 1,0% соответственно.

При испытании продуктов питания, произведенных в 2024 г., было выявлено 16 проб, контаминированных бактериями L. monocytogenes, что составило 1,0% от всех исследованных образцов (N = 1680). В замороженных и охлажденных продуктах данный вид листерий обнаруживали в 0,4 и 0,6% случаев соответственно.

На рисунке 1 представлены результаты испытаний проб пищевых продуктов, проведенных в 2023 г. Максимальный процент выявления листерий был зафиксирован в мясных полуфабрикатах смешанного состава – 6,3%, продуктах из говядины – 5,1% и из мяса птицы – 3,8%. Доля обнаружения бактерий в рыбных продуктах составила 1,0% от общего числа проанализированных проб этой категории.

На рисунке 2 отражены результаты испытаний проб продуктов животного происхождения, проведенных в 2024 г. Установлено, что по 2,0% положительных проб приходилось на мясные полуфабрикаты смешанного состава и продукты из говядины. Количество выявлений листерий в рыбных продуктах составило 1,5% от общего числа испытанных проб продуктов данного вида, в продуктах из мяса птицы – 1,7%; наименьший процент обнаружений был отмечен в продуктах из свинины – 0,6%.

В испытанных нами пробах молочных продуктов и готовых к употреблению мясных продуктах как в 2023, так и в 2024 г. L. monocytogenes выявлены не были. Также в 2023 г. данные патогенные микроорганизмы не обнаруживали в продуктах из свинины.

В таблице 2 представлены данные по выявлению листерий в пробах продуктов переработки мяса птицы, произведенных в период с 2023 по 2024 г. Наибольший процент обнаружения L. monocytogenes от общего количества проб продуктов птицеводства (N = 834) установлен в полуфабрикатах из мяса птицы рубленых (в том числе фарше) – 1,2%, а наименьший – в мясе птицы механической обвалки – 0,4%.

При испытании проб продуктов птицеводства, а именно проб мяса птицы (тушки, полутушки, крыло, окорочок, бедро), бактерии L. monocytogenes были выявлены в 1,6% проб от количества проб данного вида продуктов (N = 385), причем в замороженных и охлажденных продуктах число выявлений было равным – по 0,8%.

Контаминация листериями испытуемых проб полуфабрикатов (рубленых) из мяса птицы (котлеты, купаты, фарш и др.) составила 4,2% от количества проб данного вида продуктов (N = 236), при этом в 0,4% случаев были обсеменены замороженные продукты и в 3,8% случаев – охлажденные.

Наличие листерий зафиксировано в 9,3% проб полуфабрикатов из мяса птицы в тестовой оболочке (замороженные пельмени, N = 43), и в 7,1% испытанных проб мяса птицы механической обвалки (только в замороженных продуктах, N = 42).

В пробах субпродуктов птицы (сердце, желудок, печень, жир-сырец), коже, кулинарных полуфабрикатах из мяса птицы, не доведенных до готовности, и полуфабрикатах кусковых из мяса птицы (в том числе маринованных) бактерии L. monocytogenes выя- влены не были.

Доля контаминированных проб от всех исследованных в 2023–2024 гг. образцов продуктов из говядины (N = 323) по видам продукции составила: полуфабрикаты крупнокусковые – около 1,9% (0,6% – замороженные; 1,2% – охлажденные продукты), фарш говяжий – 0,9% (охлажденные продукты), субпродукты, полуфабрикаты мелкокусковые и полуфабрикаты в тестовой оболочке – по 0,3%. В полуфабрикатах рубленых (биточки, котлеты и др.) бактерии L. monocytogenes выявлены не были. Полученные результаты представлены в таблице 3.

В период с 2023 по 2024 г. L. monocytogenes обнаруживали в следующих видах мясных полуфабрикатов смешанного состава (N = 326): в полуфабрикатах рубленых – в 2,76% случаев (1,23% – в замороженных и 1,53% – в охлажденных продуктах), в фарше (только охлажденном) – в 0,6% проб, в полуфабрикатах в тестовой оболочке – 0,9% (в замороженных).

Контаминация листериями была выявлена и в пробах рыбных продуктов, а именно в свежемороженых креветках и полуфабрикатах с мучным компонентом (котлетах).

Обсеменение бактериями L. monocytogenes установлено в одной из проб фарша свиного замороженного, что составило 0,3% от общего количества проб продуктов из свинины (N = 288). Остальные продукты переработки свинины (полуфабрикаты крупнокусковые и мелкокусковые, рубленые, в тестовой оболочке, субпродукты) соответствовали требованиям безопасности и не содержали листерий.

В результате проведенной работы в период с 2023 по 2024 г. было выявлено 57 проб, контаминированных бактериями L. monocytogenes, что составило 1,6% от всех исследований продуктов животного происхождения. Процент обнаружения листерий в замороженных и охлажденных мясных продуктах статистически не различался – 0,7 и 0,8% от общего количества протестированных проб соответственно. Контаминация листериями продуктов различных пищевых категорий варьировала от 0,6 (пробы продуктов из свинины) до 6,3% (пробы мясных полуфабрикатов смешанного состава). Доля выявления L. monocytogenes в рыбных продуктах составила 1,1% от общего числа испытанных проб данной продукции (N = 615), в продуктах из свинины – 0,3%.

Полученные нами результаты соответствуют данным научных публикаций других авторов. Так, по итогам мониторинга пищевых продуктов в 14 странах Европейского союза, общее число случаев обнаружения L. monocytogenes в мясных продуктах из говядины, предназначенных для употребления в пищу, в 2019 г. составляло 4,2%, в 2020 г. этот показатель вырос до 7,4%, а в 2021 г. снизился до 3,9% [4]. По данным зарубежных исследований, в категории «рыба» в 2023 г. выявление проб, контаминированных L. monocytogenes, было на уровне 1,1% [3], что соотносится с результатами нашего исследования.

Как сообщается в иностранных источниках, L. monocytogenes обнаруживают в молоке, сырах, сливочном масле, сливках и мороженом [4, 20, 25, 26], а также в мясных продуктах, готовых к употреблению [21, 22, 27]. Отсутствие контаминации бактериями L. monocytogenes готовой мясной продукции и молочных продуктов, установленной в результате исследований, проведенных в испытательной лаборатории Нижегородского филиала ФГБУ «ВНИИЗЖ», может говорить о том, что на предприятиях, где были произведены продукты питания, соблюдаются технологические и санитарные нормы: ведется правильная термическая обработка продукции, поддерживается гигиена производства, организован контроль качества сырья, внедрена эффективная система контроля качества, условия хранения и транспортировки продукции отвечают требованиям нормативной документации. Однако необходимо осуществлять постоянный контроль, следует продолжать мониторинг продукции, несмотря на обнадеживающие результаты.

Полученные данные свидетельствуют о том, что контаминация бактериями L. monocytogenes мясных продуктов не зависит от температурного режима их хранения (заморозка или охлаждение), что подтверждает наличие у данного патогена механизмов адаптации к холодовому стрессу, описанных зарубежными учеными [28-30].

Рис. 1. Выявление L. monocytogenes в продуктах животного происхождения в Нижегородской области в 2023 г.

Fig. 1. Detection of L. monocytogenes in products of animal origin in the Nizhny Novgorod Oblast in 2023

Рис. 2. Выявление L. monocytogenes в продуктах животного происхождения в Нижегородской области в 2024 г.

Fig. 2. Detection of L. monocytogenes in products of animal origin in the Nizhny Novgorod Oblast in 2024

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные в 2023–2024 гг. на территории Нижегородской области исследования продуктов животного происхождения показали, что 1,6% проб были контаминированы L. monocytogenes. Наибольший уровень обсемененности выявлен в мясных полуфабрикатах смешанного состава (6,3% в 2023 г. и 2,0% в 2024 г.), а также в продуктах из говядины (5,1 и 2,0% соответственно) и мяса птицы (3,8 и 1,7%). В то же время в молочных продуктах и готовых к употреблению мясных изделиях L. monocytogenes не обнаружена, что может свидетельствовать о соблюдении технологических и санитарных норм на производстве.

Среди продуктов птицеводства наибольшая контаминация отмечена в полуфабрикатах в тестовой оболочке (9,3%), испытанных пробах мяса птицы механической обвалки (7,1%) и рубленых изделиях (4,2%), тогда как в цельном мясе птицы уровень обсемененности был ниже (1,6%). Наиболее контаминированными продуктами из говядины оказались фарш (10,7%) и крупнокусковые полуфабрикаты (4,6%). В рыбных продуктах L. monocytogenes обнаружена в 1,1% случаев (в креветках и рыбных котлетах).

Температурный режим (охлаждение/заморозка) не оказывал значимого влияния на уровень контаминации бактериями L. monocytogenes, что свидетельствует о холодовой толерантности данного патогенного микроорганизма.