Изучение инфекционного процесса у кур при различных способах заражения вирусом ньюкаслской болезни генотипа VII

ВВЕДЕНИЕ

На протяжении века ньюкаслская болезнь птиц представляет серьезную угрозу птицеводству и продолжает наносить значительный экономический ущерб хозяйствам по всему миру. Несмотря на активные усилия по вакцинации, в последние десятилетия внимание исследователей привлекли постоянные вспышки ньюкаслской болезни и их пагубные последствия для птицеводства [1]. Болезнь вызывается вирулентным птичьим ортоавулавирусом (Orthoavulavirus javaense, OAVJ). Данный патоген относится к семейству Paramyxoviridae [2] и ранее обозначался многими авторами как парамиксовирус птиц серотипа 1 (APMV-1) [3]. Геном вируса ньюкаслской болезни (NDV) представлен одноцепочечной отрицательной молекулой РНК, что соответствует порядку Mononegavirales, а сам возбудитель имеет спиральную симметрию капсида и реплицируется в цитоплазме пораженной клетки [4][5]. Хотя все штаммы вируса ньюкаслской болезни являются представителями OAVJ и относятся к одному серотипу, между различными генотипами наблюдается антигенное и генетическое разнообразие [6]. Длина генома и особенности нуклеотидных последовательностей изолятов легли в основу их разделения на классы (I и II) [7, 8]. Штаммы класса I принадлежат к одному генотипу, тогда как представители класса II отличаются большим разнообразием и в настоящее время разделены на 21 генотип на основе комплексного секвенирования кодирующей области гибридного гена F [7][9-11].

К вирусу ньюкаслской болезни восприимчиво большое количество птиц, хотя вирулентность возбудителя и исход болезни различаются в зависимости от конкретного вида [12]. Многочисленные виды домашней птицы, включая бройлеров, кур-несушек, голубей, уток, индеек, страусов, павлинов, фазанов, водоплавающих птиц и попугаев (Psittacidae), подвержены заражению различными штаммами вируса ньюкаслской болезни по всему миру. Все больший интерес в последние годы вызывает генотип VII, возникший еще в 1990-х гг., но превалирующий в настоящее время в Азии и на Ближнем Востоке, а также в Европе, Южной Африке и Южной Америке [13]. В силу своей высокой вирулентности он вызывает тяжелую форму болезни у кур и других видов коммерческой птицы вплоть до 100%-й летальности поголовья. Представители генотипа VII первоначально были разделены на два субгенотипа: штаммы подтипа VIIa, которые появились в 1990-х гг. на Дальнем Востоке и распространились в Европе и Азии, и штаммы подтипа VIIb, возникшие на Дальнем Востоке и распространившиеся в Южной Африке [14]. С течением времени классификация претерпела ряд изменений, и генотип VII был разделен на 8 субгенотипов, в том числе субгенотип VII-L, ассоциируемый в последние годы со вспышками ньюкаслской болезни в Иране [15] и других странах. В настоящее время введены новые номенклатурные критерии, на основании которых генотип VII включает три субгенотипа: VII.1.1, VII.1.2 и VII.2 [16]. Известно, что субгенотип VI.1.1 привел к третьей панзоотии у голубей в 1980-х гг.; четвертая панзоотия, начавшаяся в 1985 г., и последняя, пятая, панзоотия также были вызваны вирусом ньюкаслской болезни генотипа VII [17].

В зависимости от степени вирулентности вирус ньюкаслской болезни подразделяется на четыре патотипа: велогенный, мезогенный, лентогенный и бессимптомный кишечный, хотя проявление этих патотипов не всегда может быть четко выражено [18]. Велогенные штаммы далее делятся на висцеротропные, вызывающие множественные геморрагии, и нейротропные, при инфицировании которыми характерны неврологические и дыхательные расстройства [19]. Заражение происходит в основном при вдыхании или проглатывании вируса, выделяемого инфицированными птицами с фекалиями и респираторными секретами в течение различного периода времени [20, 21], а также через конъюнктиву. При этом эффективность передачи возбудителя от птицы к птице зависит от наличия вируса в инфекционной форме [22]. Заражение может произойти в результате вдыхания крупных капель или мелкодисперсных аэрозолей, содержащих инфекционный вирус, однако алиментарный путь инфицирования, вероятно, является основным [23]. Болезнь развивается быстро, ее признаки проявляются у всего стада уже через 2 сут (в среднем через 4–6 сут) при аэрогенной передаче возбудителя инфекции, но инкубационный период может достигать и 15 сут при заражении фекально-оральным способом, особенно у птиц, содержащихся в клетках
[24][25]. По данным некоторых авторов, при экспериментальном инфицировании длительность инкубационного периода составляет от 2 до 5 сут [23]. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения животных (ВОЗЖ), максимальный инкубационный период при ньюкаслской болезни составляет 21 сут.

Клинически болезнь проявляется нарушениями со стороны пищеварительной, дыхательной и нервной систем, при этом симптомы могут отличаться в зависимости от вирулентности вируса, возраста, иммунного статуса и восприимчивости организма птицы [26]. У зараженных птиц часто наблюдается угнетение, снижение аппетита, взъерошенность перьев, конъюнктивиты, возможна диарея с зеленым или белым цветом фекальных масс [23]. Зеленый цвет кала обусловлен нарушением выработки печенью и поджелудочной железой желчи и пищеварительных ферментов [27]. К респираторным симптомам относятся кашель и хрипы, к нервным – тремор, паралич крыльев и ног, кривошея и манежные движения. Неврологические симптомы могут проявляться одновременно с другими, но, как правило, возникают позднее по мере прогрессирования болезни [23].

Для ньюкаслской болезни описан ряд характерных патолого-анатомических изменений, хотя их выраженность также может значительно отличаться в зависимости от вирулентности конкретного изолята и восприимчивости организма. Значительные патолого-анатомические изменения обычно наблюдаются только при инфицировании велогенными штаммами вируса ньюкаслской болезни. Для патолого-анатомической картины характерны петехии на серозных оболочках, кровоизлияния в слизистую оболочку преджелудка и серозную оболочку кишечника, сопровождаемые многоочаговыми некротическими геморрагическими поражениями, особенно в лимфоидных образованиях, таких как слепокишечные (цекальные) миндалины [25]. Селезенка может быть увеличена, покрыта пятнами и некротизирована [28]. В легочной ткани возможно наличие гиперемии, а также многоочаговых кровоизлияний (от точечных до экхиматозных) и некротических участков. В области гребня иногда наблюдаются небольшие кровоподтеки и цианоз [29]. У кур, инфицированных велогенным висцеротропным вирусом ньюкаслской болезни, могут обнаруживаться застойные явления и кровоизлияния в трахею. Также сообщается, что у кур, в отличие от гусей, вирус присутствует в головном мозге и, как следствие, оказывает на его структуры патологическое воздействие [30]. Другие авторы подтверждают данную информацию, указывая, что при заражении цыплят некоторыми штаммами вируса ньюкаслской болезни в оболочках головного мозга могут наблюдаться гиперемия и многоочаговые точечные кровоизлияния [25]. Поражения при инфекциях, обусловленных лентогенными штаммами, обычно связаны с утолщением мембран воздушных мешочков в результате воспаления и пневмонии, вызванных вирусом или вторичной бактериальной инфекцией [29].

В Российской Федерации в 2019 г. произошло резкое обострение ситуации по ньюкаслской болезни с распространением вируса субгенотипа VII-L (VII 1.1) по всей территории страны – от Приморского края до Курской области. В итоге зарегистрировано 17 неблагополучных пунктов, все – в личных подсобных хозяйствах, где содержалось невакцинированное поголовье [31]. По данным ВОЗЖ, всего в 2023 г. было зафиксировано 289 вспы-
шек ньюкаслской болезни среди домашней птицы, 13 из которых – в пределах Российской Федерации¹. В 2024 г. ньюкаслская болезнь была зарегистрирована в 15 странах Америки, Азии, Африки и Европы, а из 518 официально зафиксированных вспышек наибольшее число пришлось на Нигерию (212) и Ирак (187)². Несмотря на интенсивные программы вакцинации, вспышки ньюкаслской болезни, вызванные вирусом генотипа VII, и спорадические случаи периодически возникают даже в вакцинированных хозяйствах в Южной Америке [32] и азиатских странах [33]. Более того, штаммы генотипа VII способны расширять ареал своего распространения, что иногда приводит к заболеванию водоплавающих птиц [34]. Повторные вспышки ньюкаслской болезни среди иммунизированного поголовья могут указывать на неэффективность существующих вакцин ввиду антигенных различий между вакцинным и полевым штаммами или схем вакцинаций, применяемых для борьбы с заболеванием [13].

В настоящее время наиболее широко используемые вакцины против ньюкаслской болезни созданы на основе вируса ранних генотипов, в основном I и II, которые были выделены около 70 лет назад, в то время как преобладающие штаммы возбудителя ньюкаслской болезни у домашней птицы относятся к поздним генотипам, включая генотип V в Америке, генотип VII в Азии и Африке, а также генотип VI у голубей на разных континентах, которые генетически и антигенно отличаются [35].

Анализ эпизоотической ситуации в мире свидетельствует о наличии рисков заноса возбудителя на территорию нашей страны, что делает значимыми вопросы
профилактики данной болезни с целью предотвращения
ее появления и распространения. Научные исследования, посвященные изучению инфекционного процесса при заражении кур велогенными штаммами вируса ньюкаслской болезни, проведены многими авторами из различных стран мира. Однако в отечественной литературе существует мало публикаций, затрагивающих указанную проблему. Таким образом, проведение сравнительной оценки инфекционного процесса у кур при различных способах заражения вирулентным вирусом ньюкаслской болезни является актуальной задачей.

Воспроизведение инфекционного процесса при ньюкаслской болезни, вызванной вирусом генотипа VII, в экспериментальных условиях имеет важное значение для изучения свойств возбудителя и определения стандартных признаков развития болезни у восприимчивых животных с целью дальнейшего совершенствования мер специфической профилактики.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирус. Для заражения использовали вирулентный изолят вируса ньюкаслской болезни NDV/chicken/rus/Saratov/2403–3/22 субгенотипа VII.1.1 (VII-L) генотипа VII
в заражающей дозе 6,0 lgЭИД₅₀ согласно рекомендациям ВОЗЖ³. Данный изолят относится к группе велогенных на основании результатов секвенирования сайта расщепления белка F, а также значения индекса интрацеребральной патогенности, равного 1,62 [36].

Птица. Эксперимент был поставлен на цыплятах, полученных из SPF-яиц (VALO BioMedia GmbH, Германия). На момент инокуляции вируссодержащего материала возраст цыплят составлял 30 сут. Отсутствие специфических антител к вирусу ньюкаслской болезни подтверждали путем исследования сыворотки крови птиц, полученной до заражения, в реакции торможения гемагглютинации.

Способы заражения. Для моделирования инфекционного процесса использовали три различных способа заражения. Интраназальный метод заключался в закапывании в нос вируссодержащей суспензии в заражающей дозе в объеме 0,1 см³; пероральный – в выпаивании с водой вируссодержащей суспензии в заражающей дозе в объеме 1,0 см³; внутримышечный – в инъекционном введении в область бедра вируссодержащей суспензии в заражающей дозе в объеме 0,5 см³.

Контрольных птиц не заражали.

Схема опыта. Подопытных птиц разделили на три равные группы по 8 гол. в каждой и заразили вышеуказанными методами. Через 48 ч после инфицирования к опытным группам поместили по 6 интактных цыплят. Опытные группы формировались в соответствии с «Правилами регулирования обращения ветеринарных лекарственных средств на таможенной территории Евразийского экономического союза» (решение Совета Евразийской экономической комиссии от 21 января 2022 г. № 1)⁴. В течение последующих 10 сут оценивали клиническое состояние зараженной и контактной птицы согласно ГОСТ Р 58090–2018 «Клиническое обследование непродуктивных животных. Общие требования»⁵. Осуществляли сбор ротоглоточных и клоакальных смывов в период разгара болезни в соответствии с «Методическими рекомендациями по отбору, хранению и транспортировке проб биоматериала для проведения диагностических исследований на грипп птиц и болезнь Ньюкасла»⁶. Также проводили патолого-анатомическое вскрытие павших птиц согласно ГОСТ Р 57547–2017 «Услуги для непродуктивных животных. Патологоанатомическое исследование трупов непродуктивных животных. Общие требования»⁷. Процедура вскрытия включала в себя наружный осмотр трупа животного и исследование внутренних органов различных систем на предмет наличия в них патологических изменений. Оценка состояния органов репродуктивной системы была затруднена в силу возраста опытной птицы.

Проводили ежедневное наблюдение за клиническим состоянием опытных птиц с фиксацией фаз течения болезни, различных проявлений и признаков болезни, а также гибели птиц. Павших птиц вскрывали и фиксировали все патологические изменения. Специфичность гибели подтверждали с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Все эксперименты на животных проводились в строгом соответствии с межгосударственным стандартом по содержанию и уходу за лабораторными животными ГОСТ 33215-2014, принятым Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации, а также согласно требованиям Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22.09.2010 по охране животных, используемых в научных целях. Исследования одобрены комиссией по биоэтике ФГБУ «ВНИИЗЖ» (заключение от 25.07.2025).

Индикация вируса. Выявление генома вируса ньюкаслской болезни в ротоглоточных и клоакальных мазках проводили методом ПЦР в режиме реального времени в соответствии с «Методическими указаниями по выявлению РНК и дифференциации вирулентных изолятов вируса ньюкаслской болезни методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени»⁸.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Инфекционный процесс. В ходе поставленного эксперимента было установлено, что исследуемый вирус ньюкаслской болезни генотипа VII субгенотипа VII.1.1 является контагиозным для кур во всех опытных группах. Была продемонстрирована способность возбудителя передаваться от больных птиц здоровым и вызывать 100%-ю гибель как экспериментально зараженных, так и контактных птиц. Основные показатели, характеризующие течение инфекционного процесса в каждой опытной группе, представлены в таблице 1.

Установлено, что наиболее короткий инкубационный период наблюдался при внутримышечном и пероральном способах заражения (2 сут), а наиболее длинный (3 сут) – при интраназальном заражении, что соответствует данным, представленным ВОЗЖ, а также некоторыми другими источниками [23, 25].

Срок гибели цыплят был самым коротким при внутримышечном заражении, средним – при пероральном, а самым длинным – при интраназальном (5, 6 и 7 сут соответственно). Птицы во всех опытных группах, как исходно зараженные, так и контактные, выделяли вирус с фекалиями и ротоглоточными истечениями. Динамика инфекционного процесса у цыплят контактной группы в целом соответствовала динамике инфекционного процесса у экспериментально инфицированных цыплят.

Экспериментальные способы инокуляции вируса, имитирующие естественный путь заражения, за исключением парентерального (внутримышечного), вызывают развитие острого инфекционного процесса, характерного для велогенных штаммов вируса ньюкаслской болезни. Клинически болезнь у контактных цыплят проявлялась практически в одинаковые сроки с экспериментально зараженными цыплятами, что свидетельствует о высокой контагиозности и патогенности возбудителя.

Клинические признаки. Помимо данных об инфекционном процессе, в ходе исследования учитывались клинические признаки, зафиксированные в результате мониторинга состояния экспериментально зараженной и контактной птицы. Вариабельность клинических признаков ньюкаслской болезни у кур разных опытных групп представлена в таблице 2.

Как следует из полученных данных, неспецифические признаки болезни, такие как гипертермия (рис. 1), диарея, отсутствие аппетита и угнетение (рис. 2), были характерны для птиц во всех опытных группах. При диарее фекалии имели жидкую консистенцию и зеленоватый цвет.

По окончании инкубационного периода зараженные внутримышечно птицы демонстрировали более тяжелое и стремительное течение болезни с ранней гибелью, однако клиническая картина не всегда была четко выражена и могла быть ограничена неспецифическими проявлениями. Тем не менее у особей, инфицированных внутримышечно и перорально, отмечались ярко выраженные неврологические симптомы. При этом респираторные признаки заболевания, такие как кашель, чихание и хрипы, были характерны для особей в группах, где вируссодержащую суспензию вводили перорально и интраназально, а истечения из носа – только в случае интраназального заражения. Тем не менее ни в одной из групп нативно инфицированных цыплят, а также у контактной птицы не наблюдалось истечений из глаз или конъюнктивита, несмотря на то, что многие авторы указывают данный признак как характерный при заражении вирусом ньюкаслской болезни [25, 37]. Клинические признаки ньюкаслской болезни у контактной птицы всех трех групп были аналогичны клинической картине, наблюдаемой у птиц, инфицированных внутримышечно.

Патолого-анатомическое исследование. В результате патолого-анатомического вскрытия было установлено, что у птиц, павших в первые 24 ч после проявления клинических признаков, отсутствовали явные патолого-анатомические изменения внутренних органов, характерные для ньюкаслской болезни. Упитанность птиц оценивалась ниже средней, перьевой покров был взъерошен. Клюв и глазная щель закрыты, выделения отсутствовали. Под серозной оболочкой в области грудины отмечались незначительные петехии. Среди изменений внутренних органов брюшной полости присутствовали слабо выраженная гиперемия слизистой оболочки кишечника, без кровоизлияний
и/или очагов некроза, а также незначительное увеличение селезенки. Головной мозг отечен, с гиперемированными сосудами и кровоизлияниями.

У птиц, павших после 24 ч с момента проявления признаков ньюкаслской болезни, был обнаружен ряд патолого-анатомических изменений, которые отличались в зависимости от метода заражения и клинических проявлений. Упитанность туши оценивалась ниже средней, перья были взъерошены. Клоака закрыта, перья вокруг нее запачканы фекальными массами зеленоватого цвета. В интерстициальной ткани в области головы и шеи, особенно в области грудной части, наблюдали серозные отеки. Гребень и сережки бледные, иногда с синюшностью. У павших птиц, зараженных интраназально, были отмечены скопления экссудата на поверхности клюва и вокруг носовых отверстий. Слизистая оболочка ротовой полости у птиц всех опытных групп цианотичная, катарально-набухшая, слизистая оболочка глотки и пищевода покрасневшая, с множественными кровоизлияниями. Глотка и ротовая полость заполнены слизистым экссудатом (рис. 3). Наличие кровоизлияний на задней стенке глотки и трахеи (рис. 4) было отмечено у птиц, зараженных перорально и интраназально. Кровь в полости сердца и в крупных сосудах свернувшаяся, в некоторых случаях сердечная мышца дряблая. Легкие гиперемированы и отечны. Селезенка синеватого цвета, капсула напряженная. Слизистая оболочка кишечника гиперемирована на всем протяжении, с кровоизлияниями и очагами некроза. Лимфатические узлы увеличены. В некоторых случаях печень дряблая, неравномерно окрашена, почки увеличены в объеме, выходят за пределы костных впадин. Головной мозг отечен, с гиперемированными сосудами и кровоизлияниями.

У птиц, павших спустя 72–96 ч после начала болезни, были зафиксированы явные патологические изменения при наружном и внутреннем осмотрах. Трупы истощенные, перья взъерошены и загрязнены жидкими фекальными массами зеленого цвета. Кожа головы, гребень и бородка с выраженным цианозом, без кровоизлияний. На слизистой оболочке преджелудка присутствовали петехии и небольшие экхимозы. Кутикула желудка рыхлая, легко отслаивается. У некоторых особей слизистая оболочка на границе преджелудка и желудка была гиперемирована и пронизана кровоизлияниями в виде пояска (рис. 5). Селезенка темного цвета, с очагами некроза. Кишечник катарально воспален, с кровоизлияниями и очагами некроза, в том числе в области слепокишечных миндалин и лимфатической ткани. Головной мозг отечен, с гиперемированными сосудами и кровоизлияниями (рис. 6).

Описанные признаки в целом соответствуют результатам, полученным другими авторами при проведении аналогичных исследований [23, 37]. Патологические изменения со стороны головного мозга были обнаружены у всех опытных птиц вне зависимости от наличия или степени выраженности неврологических симптомов, способа заражения или срока гибели. Изменение цвета и увеличение селезенки являлось часто встречаемым признаком, несмотря на то, что некоторые источники указывают на отсутствие изменений данного органа при патолого-анатомической диагностике ньюкаслской болезни [38]. Специфические патолого-анатомические признаки развивались у особей, павших не ранее 24 ч с момента окончания инкубационного периода, и прогрессировали по мере развития болезни. При острой форме заболевания и ранней гибели птицы патолого-анатомические изменения носили слабо выраженный и неспецифический характер, а процедура вскрытия не являлась информативной для посмертной диагностики ньюкаслской болезни.

Рис. 1. Гипертермия у зараженной птицы

Fig. 1. Hyperthermia in infected chicks

Рис. 2. Взъерошенные перья и общее угнетение зараженной птицы (справа) и клинически здоровая контактная птица (слева)

Fig. 2. Ruffled feathers and general depression (right chick) and a clinically healthy contact chick (left)

Рис. 3. Скопление слизистого экссудата в ротовой полости и ротоглотке

Fig. 3. Accumulation of mucosal exudate in the mouth and pharynx

Рис. 4. Кровоизлияния на задней стенке глотки и слизистой оболочке трахеи

Fig. 4. Submucosal hemorrhages in the posterior oropharynx and trachea

Рис. 5. Кровоизлияния в виде пояска на границе железистого и мышечного желудков

Fig. 5. Hemorrhagic banding at the proventricular-ventricular junction

Рис. 6. Отечный головной мозг с кровоизлияниями

Fig. 6. Cerebral edema with associated hemorrhages

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение биологических свойств штаммов вируса ньюкаслской болезни генотипа VII и вызываемого ими инфекционного процесса лежит в основе улучшения мер профилактики данной болезни и, как следствие, предупреждения новых вспышек.

В ходе настоящего исследования была экспериментально подтверждена контагиозность изолята вируса ньюкаслской болезни генотипа VII субгенотипа VII-L NDV/chicken/rus/Saratov/2403–3/22 для кур при внутримышечном, пероральном и интраназальном способах заражения, а также доказана его способность выделяться во внешнюю среду органами респираторной и пищеварительной систем. Было установлено, что заражающая доза, равная 6,0 lgЭИД₅₀, является абсолютно летальной для цыплят SPF-стада в возрасте 30 сут, поскольку вызывает в экспериментальных условиях 100%-ю гибель опытных птиц.

Специфические клинические признаки ньюкаслской болезни у птиц зависели от способа инфицирования и отличались по исследуемым группам: с преобладанием неврологических симптомов после внутримышечного заражения и у контактных птиц; с преобладанием респираторных признаков при интраназальном введении вируссодержащей суспензии. Птицы, зараженные перорально, демонстрировали и неврологические, и респираторные симптомы болезни. В результате вскрытия павших птиц было установлено, что патолого-анатомическая картина ньюкаслской болезни характеризуется разнообразием патологических изменений, которые в большей степени определяются сроком гибели птицы с момента проявления болезни, чем способом заражения.

Установлено, что при внутримышечном введении велогенного изолята вируса ньюкаслской болезни генотипа VII субгенотипа VII–L NDV/chicken/rus/Saratov/2403–3/22 инкубационный период сокращается и гибель птиц наступает быстрее. Невзирая на то, что внутримышечный метод введения не является естественным, он широко применяется при контрольном заражении и рекомендован ВОЗЖ для оценки эффективности вакцин против ньюкаслской болезни. Следовательно, данный метод введения вируссодержащей суспензии изолята NDV/chicken/rus/Saratov/2403–3/22 можно считать наиболее предпочтительным при экспериментальном моделировании болезни.