Сортировка клеток, инфицированных вирусом африканской чумы свиней, методом проточной цитометрии

Панзоотия африканской чумы свиней продолжает свое распространение, а число пораженных стран и материальные потери увеличиваются. Так, в 2020–2021 гг. к перечню неблагополучных по африканской чуме свиней стран добавились  Индия, Папуа – Новая Гвинея, Малайзия, Греция и Бутан. Борьбу  с заболеванием затрудняет отсутствие коммерчески  доступных и эффективных вакцин, что, в свою очередь, обуславливается недостатком знаний о патогенезе и иммунной защите при африканской чуме свиней. Детальное изучение факторов, влияющих на вирулентность вируса африканской чумы свиней и вызываемого  им иммунного ответа, становится возможным  при использовании его аттенуированных вариантов. Для этого применяют как естественно аттенуированные варианты вируса, так и варианты, аттенуированные в ходе длительного пассирования вируса на культурах клеток. Однако гетерогенность по признаку вирулентности, свойственная популяции вируса африканской чумы свиней, требует проведения дополнительного отбора инфицированных клеток с целью клонирования  вируса. Классические культуральные методы клонирования вирусных частиц достаточно длительны и трудоемки, поэтому для отбора и клонирования инфицированных вирусом клеток с целью получения гомологичных вирусных линий целесообразно использовать сортировку клеток методом проточной цитометрии. В данной работе показаны результаты сортировки зараженных вирусом африканской чумы свиней клеток почки африканской зеленой мартышки CV-1 и костного мозга свиньи с помощью клеточного сортера MoFlo Astrios EQ в 96-луночные культуральные  планшеты с целью получения популяции вируса, происходящего из одной зараженной  клетки. После проведения  сортировки инфицированных культур клеток по одной клетке в лунки 96-луночных планшетов частота обнаружения положительных на африканскую чуму свиней клеток в лунках составила 30% для клеток костного мозга свиньи и 20% – для CV-1.

1. Ремыга С. Г., Першин А. С., Шевченко И. В., Иголкин А. С., Шевцов А. А. Клинические и патологоанатомические изменения у диких европейских кабанов и домашних свиней при заражении вирусом африканской чумы свиней. Ветеринария сегодня. 2016; (3): 46–51.

2. Шевченко И. В., Ремыга С. Г., Першин А. С. и др. Клинико-анатомическое проявление африканской чумы свиней при заражении разными методами вирусом, выделенным от дикого кабана. Современные проблемы патологической анатомии, патогенеза и диагностики болезней животных: материалы 18-й Международной научно-методической конференции по патологической анатомии животных (20–25 октября 2014 г.). М.: МГАВМиБ; 2014; 82–84.

3. Schoder M. E., Tignon M., Linden A., Vervaeke M., Cay A. B. Evaluation of seven commercial African swine fever virus detection kits and three Taq polymerases on 300 well-characterized field samples. J. Virol. Methods. 2020; 280:113874. DOI: 10.1016/j.jviromet.2020.113874.

4. European Food Safety Authority (EFSA), Desmecht D., Gerbier G., Gortázar Schmidt C., Grigaliuniene V., Helyes G., et al. Epidemiological analysis of African swine fever in the European Union (September 2019 to August 2020). EFSA J. 2021; 19 (5):e06572. DOI: 10.2903/j.efsa.2021.6572.

5. Zhu J. J., Ramanathan P., Bishop E. A., O’Donnell V., Gladue D. P., Borca M. V. Mechanisms of African swine fever virus pathogenesis and immune evasion inferred from gene expression changes in infected swine macrophages. PLoS One. 2019; 14 (11):e0223955. DOI: 10.1371/journal.pone.0223955.

6. Teklue T., Sun Y., Abid M., Luo Y., Qiu H. J. Current status and evolving approaches to African swine fever vaccine development. Transbound. Emerg. Dis. 2020; 67 (2): 529–542. DOI: 10.1111/tbed.13364.

7. Pikalo J., Zani L., Hühr J., Beer M., Blome S. Pathogenesis of African swine fever in domestic pigs and European wild boar – Lessons learned from recent animal trials. Virus Res. 2019; 271:197614. DOI: 10.1016/j.virusres.2019.04.001.

8. Borca M. V., Carrillo C., Zsak L., Laegreid W. W., Kutish G. F., Neilan J. G., et al. Deletion of a CD2-like gene, 8-DR, from African swine fever virus affects viral infection in domestic swine. J. Virol. 1998; 72 (4): 2881–2889. DOI: 10.1128/JVI.72.4.2881-2889.1998.

9. Shields C. W. IV, Reyes C. D., López G. P. Microfluidic cell sorting: a review of the advances in the separation of cells from debulking to rare cell isolation. Lab Chip. 2015; 15 (5): 1230–1249. DOI: 10.1039/c4lc01246a.

10. Lacasta A., Monteagudo P. L., Jiménez-Marín Á., Accensi F., Ballester M., Argilaguet J., et al. Live attenuated African swine fever viruses as ideal tools to dissect the mechanisms involved in viral pathogenesis and immune protection. Vet. Res. 2015; 46:135. DOI: 10.1186/s13567-015-0275-z.

11. Pershin A., Shevchenko I., Igolkin A., Zhukov I., Mazloum A., Aronova E., et al. Long-term study of the biological properties of ASF virus isolates originating from various regions of the Russian Federation in 2013–2018. Vet. Sci. 2019; 6 (4):99. DOI: 10.3390/vetsci6040099.

12. Boinas F. S., Hutchings G. H., Dixon L. K., Wilkinson P. J. Characterization of pathogenic and non-pathogenic African swine fever virus isolates from Ornithodoros erraticus inhabiting pig premises in Portugal. J. Gen. Virol. 2004; 85 (Pt 8): 2177–2187. DOI: 10.1099/vir.0.80058-0.

13. Oļševskis E., Schulz K., Staubach C., Seržants M., Lamberga K., Pūle D., et al. African swine fever in Latvian wild boar – A step closer to elimination. Transbound. Emerg. Dis. 2020; 67 (6): 2615–2629. DOI: 10.1111/tbed.13611.

14. Orfao A., Ruiz-Arguelles A. General concepts about cell sorting techniques. Clin. Biochem. 1996; 29 (1): 5–9. DOI: 10.1016/0009-9120(95)02017-9.

15. Liou Y. R., Wang Y. H., Lee C. Y., Li P. C. Buoyancy-activated cell sorting using targeted biotinylated albumin microbubbles. PLoS One. 2015; 10 (5):e0125036. DOI: 10.1371/journal.pone.0125036.

16. Pereira H., Schulze P. S., Schüler L. M., Santos T. F., Barreira L., Varela J. Fluorescence activated cell-sorting principles and applications in microalgal biotechnology. Algal Research. 2018; 30: 113–120. DOI: 10.1016/J.ALGAL.2017.12.013.

17. Sasagawa Y., Nikaido I., Hayashi T., Danno H., Uno K. D., Imai T., Ueda H. R. Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity. Genome Biol. 2013; 14 (4):R31. DOI: 10.1186/gb-2013-14-4-r31.

18. Liao X., Makris M., Luo X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. J. Vis. Exp. 2016; 117:e54641. DOI: 10.3791/54641.

19. Ender F., Zamzow P., Bubnoff N. V., Gieseler F. Detection and quantification of extracellular vesicles via FACS: Membrane labeling matters! Int. J. Mol. Sci. 2019; 21 (1):291. DOI: 10.3390/ijms21010291.

20. Schierer S., Ostalecki C., Zinser E., Lamprecht R., Plosnita B., Stich L., et al. Extracellular vesicles from mature dendritic cells (DC) differentiate monocytes into immature DC. Life Sci. Alliance. 2018; 1 (6):e201800093. DOI: 10.26508/lsa.201800093.

21. Lippé R. Flow virometry: a powerful tool to functionally characterize viruses. J. Virol. 2018; 92 (3):e01765-17. DOI: 10.1128/JVI.01765-17.

22. Shehadul Islam M., Aryasomayajula A., Selvaganapathy P. R. A review on macroscale and microscale cell lysis methods. Micromachines. 2017; 8 (3):83. DOI: 10.3390/mi8030083.

23. Galindo I., Alonso C. African swine fever virus: A review. Viruses. 2017; 9 (5):103. DOI: 10.3390/v9050103.

24. Власова Н. Н., Жуков И. Ю., Мазлум Али, Шарыпова Д. В., Першин А. С., Иголкин А. С. Штамм «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» вируса африканской чумы свиней, со сниженной вирулентностью для свиней, для вирусологических, диагностических, молекулярно-генетических и мониторинговых исследований. Патент 2675535 Российская Федерация, МПК C12N 7/00 (2006.01). ФГБУ «ВНИИЗЖ». № 2018117990. Заявл. 15.05.2018. Опубл. 19.12.2018. Бюл. № 35. Режим доступа: https://patentimages.storage.googleapis.com/9b/54/86/bad913ad3ea42a/RU2675535C1.pdf.

25. Мазлум Али, Шарыпова Д. В., Гаврилова В. Л., Пузанкова О. С., Жуков И. Ю., Аронова Е. В. и др. Методические рекомендации по выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней в культуре клеток селезенки свиней: утв. 15.03.2019 № 09-19. Владимир: ФГБУ «ВНИИЗЖ»; 2019. 24 с.