Рекомбинантные антигены в серологической диагностике трансграничных и эмерджентных инфекций рогатого скота

Введение. Трансграничные и эмерджентные инфекции крупного и мелкого рогатого скота, такие как чума мелких жвачных животных, болезнь Шмалленберга и другие, в условиях развивающейся глобализации представляют серьезную эпизоотическую и экономическую угрозу. С учетом текущей геополитической обстановки необходимость в современных диагностических системах отечественного производства ощущается особенно остро. Подобные системы могут быть разработаны с использованием методов генной инженерии.

Цель исследования. Анализ отечественных и зарубежных публикаций, посвященных получению рекомбинантных белков возбудителей трансграничных и эмерджентных инфекций крупного и мелкого рогатого скота. Создание на основе обработанных данных генетических конструкций для дальнейшей разработки на их основе диагностических средств, в частности иммуноферментных тест-систем.

Материалы и методы. При помощи инструментов биоинформатики проведен анализ и оптимизация кодонного состава последовательностей, кодирующих нуклеокапсидные белки вирусов чумы мелких жвачных животных и болезни Шмалленберга. Оптимизированные фрагменты генов были синтезированы de novo и клонированы в экспрессирующий вектор pET-32b(+). Успешность вставки целевой последовательности в вектор подтверждали методом полимеразной цепной реакции и рестрикционного анализа.

Результаты. Представлена информация о разработанных на основе рекомбинантных антигенов иммуноферментных тест-системах для диагностики чумы мелких жвачных животных и болезни Шмалленберга. Освещены основные технологические аспекты получения рекомбинантных антигенов для дальнейшего их использования в диагностической системе с учетом особенностей биологии конкретного инфекционного агента, а также описана собственная методология создания векторов для экспрессии белков возбудителей обозреваемых болезней.

Заключение. Наиболее перспективными для использования в качестве рекомбинантных антигенов в иммуноферментных тест-системах, направленных на выявление антител к вирусам чумы мелких жвачных животных и болезни Шмалленберга, являются полные и усеченные нуклеокапсидные белки вирионов. При этом биофизические свойства и антигенная структура данных белков позволяют получать их в культуре клеток Escherichia coli. Следует отметить, что для получения значительных количеств функциональных белков в растворимой форме может понадобиться их экспрессия в составе слитых белков с повышающими растворимость и облегчающими корректный фолдинг тегами.

1. Kumar N., Maherchandani S., Kashyap S. K., Singh S. V., Sharma S., Chaubey K. K., Ly H. Peste des petits ruminants virus infection of small ruminants: A comprehensive review. Viruses. 2014; 6 (6): 2287–2327. https://doi.org/10.3390/v6062287

2. Das A., Mahanta D., Choudhury F. A., Barua A., Talukdar M. J. Peste des petits ruminants: A comprehensive overview. The Pharma Innovation Journal. 2022; 11 (9S): 776–782. https://www.thepharmajournal.com/archives/2022/vol11issue9S/PartJ/S-11-8-235-850.pdf

3. Закутский Н. И., Балышев В. М., Книзе А. В., Гузалова А. Г., Юрков С. Г. Чума мелких жвачных животных (современное состояние, эпизоотология, специфическая профилактика и меры борьбы). Научный журнал КубГАУ. 2012; (83). http://ej.kubagro.ru/2012/09/pdf/31.pdf

4. Калантаенко Ю. Ф., Михалкин И. П., Балышев В. М., Коломыцев А. А., Горшкова Т. Ф., Сурков В. Б. Чума мелких жвачных – распространение, диагностика и профилактика. Ветеринарная патология. 2007; (2): 38–43. https://elibrary.ru/oezjed

5. Мищенко А. В., Мищенко В. А., Черных О. Ю., Шевкопляс В. Н., Кривонос Р. А., Лысенко А. А., Чернов А. Н. Эпизоотические особенности чумы мелких жвачных животных. Ветеринарный врач. 2018; (6): 40–47. https://elibrary.ru/yqvekl

6. Baron M. D., Diallo A., Lancelot R., Libeau G. Peste des petits ruminants virus. Advances in Virus Research. 2016; 95: 1–42. https://doi.org/10.1016/bs.aivir.2016.02.001

7. Середа А. Д., Морозова Д. Ю., Иматдинов А. Р., Лыска В. М., Живодеров С. П., Сливко И. А., Луницин А. В. Конструирование тест-систем на основе рекомбинантного нуклеокапсидного белка для серодиагностики чумы мелких жвачных. Сельскохозяйственная биология. 2019; 54 (6): 1225–1235. https://doi.org/10.15389/agrobiology.2019.6.1225rus

8. Вавилова Н. В., Щербаков А. В. Применение рекомбинантного нуклеокапсидного белка в непрямом варианте ИФА для выявления антител к вирусу чумы мелких жвачных. Ветеринарная патология. 2006; (4): 76–78. https://elibrary.ru/oedrer

9. Морозова Д. Ю., Иматдинов А. Р., Живодеров С. П., Титов И. А., Лыска В. М., Луницин А. В., Середа А. Д. Получение рекомбинантного нуклеокапсидного белка вируса чумы мелких жвачных для применения в серодиагностике. Сельскохозяйственная биология. 2019; 54 (2): 337–346. https://doi.org/10.15389/agrobiology.2019.2.337rus

10. Yadav V., Balamurugan V., Bhanuprakash V., Sen A., Bhanot V., Venkatesan G., et al. Expression of peste des petits ruminants virus nucleocapsid protein in prokaryotic system and its potential use as a diagnostic antigen or immunogen. Journal of Virological Methods. 2009; 162 (1–2): 56–63. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2009.07.014

11. Zhang G.-R., Zeng J.-Y., Zhu Y.-M., Dong S.-J., Zhu S., Yu R.-S., et al. Development of an indirect ELISA with artificially synthesized N protein of PPR virus. Intervirology. 2012; 55 (1): 12–20. https://doi.org/10.1159/000322220

12. Libeau G., Préhaud C., Lancelot R., Colas F., Guerre L., Bishop D. H. L., Diallo A. Development of a competitive ELISA for detecting antibodies to the peste des petits ruminants virus using a recombinant nucleoprotein. Research in Veterinary Science. 1995; 58 (1): 50–55. https://doi.org/10.1016/00345288(95)90088-8

13. Choi K.-S., Nah J.-J, Ko Y.-J., Kang S.-Y., Jo N.-I. Rapid competitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to peste des petits ruminants virus. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2005; 12 (4): 542–547. https://doi.org/10.1128/CDLI.12.4.542-547.2005

14. Бурова О. А., Захарова О. И., Торопова Н. Н., Лискова Е. А., Яшин И. В., Блохин А. А. Болезнь Шмалленберг: обзор литературы и эпизоотическая ситуация в мире и России. Аграрная наука Евро- Северо- Востока. 2022; 23 (1): 7–15. https://doi.org/10.30766/2072-9081.2022.23.1.7-15

15. Макаров В. В., Гулюкин М. И., Львов Д. К. Зоопатогенные ортобуньявирусы (Orthobunyavirus, Bunyaviridae). Вопросы вирусологии. 2016; 61 (2): 53–58. https://doi.org/10.18821/0507-4088-2016-61-2-53-58

16. Bréard E., Lara E., Comtet L., Viarouge C., Doceul V., Desprat A., et al. Validation of a commercially available indirect ELISA using a nucleocapside recombinant protein for detection of Schmallenberg virus antibodies. PLoS ONE. 2013; 8 (1): e53446. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0053446

17. Lazutka J., Zvirbliene A., Dalgediene I., Petraityte-Burneikiene R., Spakova A., Sereika V., et al. Generation of recombinant Schmallenberg virus nucleocapsid protein in yeast and development of virus- specific monoclonal antibodies. Journal of Immunology Research. 2014; 2014:160316. https://doi.org/10.1155/2014/160316

18. Zhang Y., Wu S., Wang J., Wernike K., Lv J., Feng C., et al. Expression and purification of the nucleocapsid protein of Schmallenberg virus, and preparation and characterization of a monoclonal antibody against this protein. Protein Expression and Purification. 2013; 92 (1): 1–8. https://doi.org/10.1016/j.pep.2013.08.012

19. Кухаркина О. В., Борисова О. А. Болезнь Шмалленберга (обзор). Труды Федерального центра охраны здоровья животных. 2014; 12: 86–102. https://elibrary.ru/sysyff

20. Спрыгин А. В., Кононов А. В., Бабин Ю. Ю., Мищенко В. А. Болезнь Шмалленберга: молекулярно- биологические особенности и клиническая картина (обзор). Сельскохозяйственная биология. 2012; (6): 24–34. https://doi.org/10.15389/agrobiology.2012.6.24rus

21. Луницин А. В., Сальников Н. И., Никитина Е. Г., Цыбанов С. Ж., Колбасов Д. В. Болезнь Шмалленберг – новое заболевание жвачных в Европе. Ветеринария. 2012; (4): 23–26. https://elibrary.ru/ownuxr

22. Varela M., Schnettler E., Caporale M., Murgia C., Barry G., McFarlane M., et al. Schmallenberg virus pathogenesis, tropism and interaction with the innate immune system of the host. PLoS Pathogens. 2013; 9 (1): e1003133. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003133

23. Collins Á. B., Doherty M. L., Barrett D. J., Mee J. F. Schmallenberg virus: a systematic international literature review (2011–2019) from an Irish perspective. Irish Veterinary Journal. 2019; 72:9. https://doi.org/10.1186/s13620-019-0147-3

24. Fan K., Li Y., Chen Z., Fan L. GenRCA: a user-friendly rare codon analysis tool for comprehensive evaluation of codon usage preferences based on coding sequences in genomes. BMC Bioinformatics. 2024; 25 (1):309. https://doi.org/10.1186/s12859-024-05934-z

25. Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M, the UGENE team. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 2012; 28 (8): 1166–1167. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bts091

26. Elena C., Ravasi P., Castelli M. E., Peirú S., Menzella H. G. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Frontiers in Microbiology. 2014; 5:21. https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00021

27. Menzella H. G. Comparison of two codon optimization strategies to enhance recombinant protein production in Escherichia coli. Microbial Cell Factories. 2011; 10:15. https://doi.org/10.1186/1475-2859-10-15