Валидация и применение тест-системы на основе метода ПЦР в режиме реального времени для выявления ДНК Mycoplasma dispar

Введение. В настоящее время наблюдается широкое распространение и активная циркуляция Mycoplasma dispar в животноводческих хозяйствах по всему миру, в том числе и в Российской Федерации. Актуальность внедрения в ветеринарную практику тест-системы на основе полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для выявления ДНК Mycoplasma dispar обусловлена важной ролью данного возбудителя в развитии комплекса респираторных болезней крупного рогатого скота, приводящих к значительным экономическим потерям в животноводстве, в том числе являющихся причиной падежа телят.

Цель исследования. Определение основных валидационных характеристик и внедрение в ветеринарную практику разработанной тест-системы для выявления ДНК Mycoplasma dispar методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Материалы и методы. Референтный штамм Mycoplasma dispar (ATCC № 27140) культивировали на питательной среде 1699 Revised Mycoplasma Medium, рекомендованной American Type Culture Collection. ДНК выделяли с использованием коммерческого набора, постановка ПЦР в режиме реального времени осуществлялась по заранее подобранным параметрам. Были определены основные валидационные характеристики тест-системы: аналитическая чувствительность, аналитическая специфичность, эффективность амплификации, повторяемость и воспроизводимость. Показана возможность практического применения тест-системы на основе ПЦР в режиме реального времени для выявления ДНК Mycoplasma dispar.

Результаты. Аналитическая чувствительность (предел обнаружения) тест-системы по выявлению ДНК Mycoplasma dispar составила 10 копий ДНК/мкл (или 100 копий ДНК/реакцию), специфичность – 100% (детектирует только ДНК Mycoplasma dispar), эффективность амплификации – 99,01%, среднее значение коэффициента вариации при оценке повторяемости – 0,91%, воспроизводимости – 0,66–1,26% в рамках 5 повторений и 0,91% в рамках 15 повторений. Апробацию тест-системы проводили на 228 пробах биоматериала, отобранных от крупного рогатого скота из 13 регионов Российской Федерации, при этом ДНК Mycoplasma dispar была обнаружена в 39,47% исследуемых проб.

Заключение. Разработанная тест-система для выявления ДНК Mycoplasma dispar продемонстрировала высокие валидационные показатели и может быть использована в диагностике микоплазмоза крупного рогатого скота.

1. Tortorelli G., Carrillo Gaeta N., Mendonça Ribeiro B. L., Miranda Marques L., Timenetsky J., Gregory L. Evaluation of Mollicutes microorganisms in respiratory disease of cattle and their relationship to clinical signs. Journal of Veterinary Internal Medicine. 2017; 31 (4): 1215–1220. https://doi.org/10.1111/jvim.14721

2. Chen S., Hao H., Yan X., LiuY., Chu Y. Genome-wide analysis of Mycoplasma dispar provides insights into putative virulence factors and phylogenetic relationships. G3: Genes, Genomes, Genetics. 2019; 9 (2): 317–325. https://doi.org/10.1534/g3.118.200941

3. Абед Алхуссен М., Кирпиченко В. В., Яцентюк С. П., Нестеров А. А., Бьядовская О. П., Жбанова Т. В., Спрыгин А. В. Патогенные микоплазмы крупного рогатого скота Mycoplasma bovis, M. bovigenitalium и M. dispar: краткая характеристика возбудителей (обзор). Сельскохозяйственная биология. 2021; 56 (2): 245–260. https://doi.org/10.15389/agrobiology.2021.2.245rus

4. Herrmann R. Genome structure and organization. In: Mycoplasmas: Molecular Biology and Pathogenesis. Ed. by J. Maniloff. Washington: American Society for Microbiology; 1992; 157–168.

5. Ter Laak E. A., Noordergraaf J. H. An improved method for the identification of Mycoplasma dispar. Veterinary Microbiology. 1987; 14 (1): 25–31. https://doi.org/10.1016/0378-1135(87)90049-6

6. Nicholas R. A. J., Khan L. A., Houshaymi B., Miles R. J., Ayling R. D., Hotzel H., Sachse K. Close genetic and phenotypic relatedness between Mycoplasma ovine/caprine serogroup 11 and Mycoplasma bovigenitalium. Systematic and Applied Microbiology. 2002; 25 (3): 396–402. https://doi.org/10.1078/0723-2020-00121

7. Ter Laak E. A., Noordergraaf J. H., Dieltjes R. P. J. W. Prevalence of mycoplasmas in the respiratory tracts of pneumonic calves. Journal of Veterinary Medicine, Series B. 1992; 39 (1–10): 553–562. https://doi.org/10.1111/j.1439-0450.1992.tb01205.x

8. Nicholas R., Ayling R., McAuliffe L. Mycoplasma diseases of ruminants. Wallingford: CABI; 2008. 239 p. https://doi.org/10.1079/9780851990125.0000

9. Almeida R. A., Rosenbusch R. F. Capsulelike surface material of Mycoplasma dispar induced by in vitro growth in culture with bovine cells is antigenically related to similar structures expressed in vivo. Infection and Immunity. 1991; 59 (9): 3119–3125. https://doi.org/10.1128/iai.59.9.3119-3125.1991

10. Howard C. J., Gourlay R. N., Taylor G. Immunity to Mycoplasma infections of the calf respiratory tract. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1981; 137: 711–726. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/7331951

11. Ayling R. D., Bashiruddin S. E., Nicholas R. A. J. Mycoplasma species and related organisms isolated from ruminants in Britain between 1990 and 2000. Veterinary Record. 2004; 155 (14): 413–416. https://doi.org/10.1136/vr.155.14.413

12. França Dias de Oliveira B. A., Carrillo Gaeta N., Mendonça Ribeiro B. L., Reyes Alemán M. A., Miranda Marques L., Timenetsky J., et al. Determination of bacterial aetiologic factor on tracheobronchial lavage in relation to clinical signs of bovine respiratory disease. Journal of Medical Microbiology. 2016; 65 (10): 1137–1142. https://doi.org/10.1099/jmm.0.000345

13. Bottinelli M., Passamonti F., Rampacci E., Stefanetti V., Pochiero L., Coletti M., et al. DNA microarray assay and real-time PCR as useful tools for studying the respiratory tract Mycoplasma populations in young dairy calves. Journal of Medical Microbiology. 2017; 66 (9): 1342–1349. https://doi.org/10.1099/jmm.0.000571

14. Mosier D. Review of BRD pathogenesis: the old and the new. Animal Health Research Reviews. 2014; 15 (2): 166–168. https://doi.org/10.1017/S1466252314000176

15. Taylor G. Immunity to Mycoplasma infections of the respiratory tract: a review. Journal of the Royal Society of Medicine. 1979; 72 (7): 520–526. https://doi.org/10.1177/014107687907200711

16. Абед Алхуссен М., Нестеров А. А., Кирпиченко В. В., Яцентюк С. П., Спрыгин А. В., Бьядовская О. П., Кононов А. В. Распространение микоплазмозов крупного рогатого скота на животноводческих фермах в Российской Федерации в период с 2015 по 2018 год. Ветеринария сегодня. 2020; (2): 102–108. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2020-2-33-102-108

17. Bernier Gosselin V., Francoz D., Babkine M., Desrochers A., Nichols S., Doré E, et al. A retrospective study of 29 cases of otitis media/interna in dairy calves. The Canadian Veterinary Journal. 2012; 53 (9): 957–962. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23450859

18. Parker A. M., Sheehy P. A., Hazelton M. S., Bosward K. L., House J. K. A review of Mycoplasma diagnostics in cattle. Journal of Veterinary Internal Medicine. 2018; 32 (3): 1241–1252. https://doi.org/10.1111/jvim.15135

19. Ter Laak E. A., Noordergraaf J. H., Verschure M. H. Susceptibilities of Mycoplasma bovis, Mycoplasma dispar, and Ureaplasma diversum strains to antimicrobial agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1993; 37 (2): 317–321. https://doi.org/10.1128/AAC.37.2.317

20. Tegtmeier C., Uttenthal A. A., Friis N. F., Jensen N. E., Jensen H. E. Pathological and microbiological studies on pneumonic lungs from Danish calves. Journal of Veterinary Medicine, Series B. 1999; 46 (10): 693–700. https://doi.org/10.1046/j.1439-0450.1999.00301.x

21. Bottinelli M., Merenda M., Gastaldelli M., Picchi M., Stefani E., Nicholas R. A. J., Catania S. The pathogen Mycoplasma dispar shows high minimum inhibitory concentrations for antimicrobials commonly used for bovine respiratory disease. Antibiotics. 2020; 9 (8):460. https://doi.org/10.3390/antibiotics9080460

22. DeDonder K. D., Apley M. D. A literature review of antimicrobial resistance in Pathogens associated with bovine respiratory disease. Animal Health Research Reviews. 2015; 16 (2): 125–134. https://doi.org/10.1017/S146625231500016X

23. Anholt R. M., Klima C., Allan N., Matheson-Bird H., Schatz C., Ajitkumar P., et al. Antimicrobial susceptibility of bacteria that cause bovine respiratory disease complex in Alberta, Canada. Frontiers in Veterinary Science. 2017; (4):207. https://doi.org/10.3389/FVETS.2017.00207

24. Dabo S. M., Taylor J. D., Confer A. W. Pasteurella multocida and bovine respiratory disease. Animal Health Research Reviews. 2007; 8 (2): 129–150. https://doi.org/10.1017/S1466252307001399

25. Almeida R. A., Wannemuehler M. J., Rosenbusch R. F. Interaction of Mycoplasma dispar with bovine alveolar macrophages. Infection and Immunity. 1992; 60 (7): 2914–2919. https://doi.org/10.1128/iai.60.7.2914-2919.1992

26. Friis N. F. Mycoplasma dispar as a causative agent in pneumonia of calves. Acta Veterinaria Scandinavica. 1980; 21: 34–42. https://doi.org/10.1186/bf03546898

27. Ross R. F. Mycoplasma – animal pathogens. In: Rapid Diagnosis of Mycoplasmas. Ed. by I. Kahane, A. Adoni. Boston: Springer; 1993; 69–109. https://doi.org/10.1007/978-1-4615-2478-6_7

28. Jasper D. E. Bovine mycoplasmal mastitis. Journal of the American Veterinary Medical Association. 1979; 175 (10): 1072–1074. https://doi.org/10.2460/javma.1979.175.10.1072

29. Gourlay R. N., Howard C. J., Thomas L. H., Wyld S. G. Pathogenicity of some Mycoplasma and Acholeplasma species in the lungs of gnotobiotic calves. Research in Veterinary Science. 1979; 27 (2): 233–237. https://doi.org/10.1016/S0034-5288(18)32836-4

30. George T. D., Horsfall N., Sullivan N. D. A subclinical pneumonia of calves associated with Mycoplasma dispar. Australian Veterinary Journal. 1973; 49 (12): 580–586. https://doi.org/10.1111/j.1751-0813.1973.tb06738.x

31. Shilan Faqe Muhammad Salih. Detection of Mycoplasma dispar in bovine respiratory disease by polymerase chain reaction assay in Sulaimaniyah city. Iraqi Journal of Agricultural Sciences. 2024; 55 (2): 703–710. https://doi.org/10.36103/p6042k98

32. Andersson A.-M., Aspán A., Wisselink H. J., Smid B., Ridley A., Pelkonen S., et al. A European inter-laboratory trial to evaluate the performance of three serological methods for diagnosis of Mycoplasma bovis infection in cattle using latent class analysis. BMC Veterinary Research. 2019; 15:369. https://doi.org/10.1186/s12917-019-2117-0

33. Dudek K., Nicholas R. A. J., Szacawa E., Bednarek D. Mycoplasma bovis infections – occurrence, diagnosis and control. Pathogens. 2020; 9 (8):640. https://doi.org/10.3390/pathogens9080640

34. Абед Алхуссен М. Молекулярно-биологические методы диагностики микоплазмозов крупного рогатого скота: дис. ... канд. вет. наук. Владимир: ФГБУ «ВНИИЗЖ»; 2023. 194 с.

35. Howard C. J. Mycoplasmas and bovine respiratory disease: studies related to pathogenicity and the immune response – a selective review. Yale Journal of Biology and Medicine. 1983; 56 (5–6): 789–797. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/6382831

36. Martin S. W., Bateman K. G., Shewen P. E., Rosendal S., Bohac J. E. The frequency, distribution and effects of antibodies, to seven putative respiratory pathogens, on respiratory disease and weight gain in feedlot calves in Ontario. Canadian Journal of Veterinary Research. 1989; 53 (3): 355–362. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2766158

37. Martin S. W., Bateman K. G., Shewen P. E., Rosendal S., Bohac J. G., Thorburn M. A group level analysis of the associations between antibodies to seven putative pathogens and respiratory disease and weight gain in Ontario feedlot calves. Canadian Journal of Veterinary Research. 1990; 54 (3): 337–342. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2165846

38. Miles K., McAuliffe L., Ayling R. D., Nicholas R. A. J. Rapid detection of Mycoplasma dispar and M. bovirhinis using allele specific polymerase chain reaction protocols. FEMS Microbiology Letters. 2004; 241 (1): 103–107. https://doi.org/10.1016/j.femsle.2004.10.010

39. McAuliffe L., Ellis R. J., Lawes J. R., Ayling R. D., Nicholas R. A. J. 16S rDNA PCR and denaturing gradient gel electrophoresis; a single generic test for detecting and differentiating Mycoplasma species. Journal of Medical Microbiology. 2005; 54 (8): 731–739. https://doi.org/10.1099/jmm.0.46058-0

40. McAuliffe L., Ellis R. J., Ayling R. D., Nicholas R. A. J. Differentiation of Mycoplasma species by 16S ribosomal DNA PCR and denaturing gradient gel electrophoresis fingerprinting. Journal of Clinical Microbiology. 2003; 41 (10): 4844–4847. https://doi.org/10.1128/JCM.41.10.4844-4847.2003

41. Baird S. C., Carman J., Dinsmore R. P., Walker R. L., Collins J. K. Detection and identification of Mycoplasma from bovine mastitis infections using a nested polymerase chain reaction. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 1999; 11 (5): 432–435. https://doi.org/10.1177/104063879901100507

42. Moalic P.-Y., Gesbert F., Kempf I. Utility of an internal control for evaluation of a Mycoplasmameleagridis PCR test. Veterinary Microbiology. 1998; 61 (1–2): 41–49. https://doi.org/10.1016/S0378-1135(98)00173-4

43. Maaroufi Y., de Bruyne J.-M., Duchateau V., Scheen R., Crokaert F. Development of a multiple internal control for clinical diagnostic real-time amplification assays. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 2006; 48 (2): 183–191. https://doi.org/10.1111/j.1574-695X.2006.00125.x

44. Hymas W., Stevenson J., Taggart E. W., Hillyard D. Use of lyophilized standards for the calibration of a newly developed real time PCR assay for human herpes type six (HHV6) variants A and B. Journal of Virological Methods. 2005; 128 (1–2): 143–150. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2005.05.003

45. Dingle K. E., Crook D., Jeffery K. Stable and noncompetitive RNA internal control for routine clinical diagnostic reverse transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 2004; 42 (3): 1003–1011. https://doi.org/10.1128/JCM.42.3.1003-1011.2004

46. Stöcher M., Leb V., Berg J. A convenient approach to the generation of multiple internal control DNA for a panel of real-time PCR assays. Journal of Virological Methods. 2003; 108 (1): 1–8. https://doi.org/10.1016/S0166-0934(02)00266-5

47. OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. 2nd ed. 2008. 70 p.

48. Frey J., Nicolet J. Molecular identification and epidemiology of animal mycoplasmas. Wiener Klinische Wochenschrift. 1997; 109 (14–15): 600–603. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9286067

49. Абед Алхуссен М., Нестеров А. А., Спрыгин А. В., Шумилова И. Н., Брянцева М. С., Бьядовская О. П. Оптимизация состава питательной среды и изучение стадий роста изолята «Калуга 2020» Mycoplasma bovis. Ветеринария сегодня. 2022; 11 (3): 262–267. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2022-11-3-262-267

50. Hwang M.-H., Damte D., Cho M.-H., KimY.-H., Park S.-C. Optimization of culture media of pathogenic Mycoplasma hyopneumoniae by a response surface methodology. Journal of Veterinary Science. 2010; 11 (4): 327–332. https://doi.org/10.4142/jvs.2010.11.4.327

51. Морозова Е. О., Кротова А. О., Садчикова А. С., Тенитилов Н. А., Бьядовская О. П., Иголкин А. С. и др. Методические рекомендации по получению экзогенного внутреннего контрольного образца для ПЦР в режиме реального времени при выявлении ДНК микроорганизмов: утв. ФГБУ «ВНИИЗЖ» 13.10.2023 № 81-23. Владимир: ФГБУ «ВНИИЗЖ»; 2023. 32 с.

52. Bustin S. A., Benes V., Garson J. A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 2009; 55 (4): 611–622. https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797

53. Yan L., Toohey-Kurth K. L., Crossley B. M., Bai J., Glaser A. L., Tallmadge R. L., Goodman L. B. Inhibition monitoring in veterinary molecular testing. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 2020; 32 (6): 758–766. https://doi.org/10.1177/1040638719889315

54. Cornelissen J. B. W. J., de Bree F. M., van der Wal F. J., Kooi E. A., Koene M. G. J., Bossers A., et al. Mycoplasma detection by triplex real-time PCR in bronchoalveolar lavage fluid from bovine respiratory disease complex cases. BMC Veterinary Research. 2017; 13:97. https://doi.org/10.1186/s12917-017-1023-6

55. Neilson J. W., Jordan F. L., Maier R. M. Analysis of artifacts suggests DGGE should not be used for quantitative diversity analysis. Journal of Microbiological Methods. 2013; 92 (3): 256–263. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2012.12.021

56. Marques L. M., Buzinhani M., Yamaguti M., Oliveira R. C., Ferreira J. B., Mettifogo E., Timenetsky J. Use of a polymerase chain reaction for detection of Mycoplasma dispar in the nasal mucus of calves. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 2007; 19 (1): 103–106. https://doi.org/10.1177/104063870701900118

57. Zhang G., Brown E. W., González-Escalona N. Comparison of real-time PCR, reverse transcriptase real-time PCR, loop-mediated isothermal amplification, and the FDA conventional microbiological method for the detection of Salmonella spp. in produce. Applied and Environmental Microbiology. 2011; 77 (18): 6495–6501. https://doi.org/10.1128/AEM.00520-11

58. Deeney A. S., Collins R., Ridley A. M. Identification of Mycoplasma species and related organisms from ruminants in England and Wales during 2005–2019. BMC Veterinary Research. 2021; 17:325. https://doi.org/10.1186/s12917-021-03037-y

59. Chen J., Wang S., Dong D., Zhang Z., Huang Y., Zhang Y. Isolation and characterization of Mycoplasma ovipneumoniae infecting goats with pneumonia in Anhui Province, China. Life. 2024; 14 (2):218. https://doi.org/10.3390/life14020218

60. Wolfe L. L., Diamond B., Spraker T. R., Sirochman M. A., Walsh D. P., Machin C. M., et al. A bighorn sheep die-off in southern Colorado involving a Pasteurellaceae strain that may have originated from syntopic cattle. Journal of Wildlife Diseases. 2010; 46 (4): 1262–1268. https://doi.org/10.7589/0090-3558-46.4.1262