Mycoplasma dispar является одним из возбудителей респираторных заболеваний крупного рогатого скота (КРС), в том числе телят, и имеет повсеместное распространение. Болезнь, вызванная M. dispar, характеризуется воспалением слизистых оболочек верхних дыхательных путей и поражением легких, что приводит к значительным убыткам в животноводстве [1-3].

Данный вид микроорганизмов относится к роду Mycoplasma, классу Mollicutes, характеризуется отсутствием клеточной стенки, плеоморфизмом, небольшим для бактерий размером генома (803 т. п. н.) с низким соотношением G + C (28,5–29,3 моль%) [4][5].

Культивирование M. dispar требует специальной питательной среды для роста, микроорганизм не образует типичных для микоплазм колоний в виде «яичницы-глазуньи». Кроме того, M. dispar не всегда ингибируется гипериммунной сывороткой, что затрудняет традиционную идентификацию на ранних стадиях [5]. M. dispar ферментирует глюкозу и восстанавливает соли тетразолия в аэробных и анаэробных условиях, но не гидролизует аргинин, не катаболизирует сыворотку и не обладает фосфатазной активностью [6-8]. M. dispar имеет внешнюю капсулу, состоящую из полисахарида, идентифицированного как полимер галактуроновой кислоты [9]. Эта капсула образуется во время инфицирования клеток млекопитающих-хозяев и может оказывать ингибирующее действие на активность бычьих альвеолярных макрофагов, предотвращая их активацию [10].

Сообщалось, что для уничтожения микоплазмы альвеолярными макрофагами необходимо наличие антител против капсульного полисахарида [9].

Впервые М. dispar была выделена и идентифицирована в Англии в 1969 г. от телят с пневмонией. Затем данный вид микоплазм обнаружили в Дании, Бельгии, Голландии, Франции, Австралии, США, Канаде, Корее и Японии [8]. В Европе сообщения о выявлении возбудителя поступали из Великобритании, также инфекция, вызванная M. dispar, была зарегистрирована в Бразилии и Италии [11-15]. В Российской Федерации при исследовании 1186 проб биоматериала, полученных от КРС с клиническими признаками респираторной и/или репродуктивной патологии из 34 различных регионов в период с 2015 по 2018 г., методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле ДНК М. dispar была обнаружена в 37,15% проб [16].

Передается M. dispar от инфицированных животных к здоровым в основном через дыхательные секреты, выявляется в дыхательных путях как здоровых, так и больных пневмонией телят [3]. При неблагоприятных условиях микоплазмы самостоятельно или в комбинации с другими инфекционными агентами могут вызывать серьезные респираторные заболевания, тем самым причиняя экономический ущерб крупным животноводческим хозяйствам с высокой концентрацией животных [17][18]. При обследовании поголовья КРС в Нидерландах M. dispar была выделена из 92% проб легких телят с пневмонией и из 40% проб легких здоровых телят [7][19]. В Дании при исследовании легких телят с признаками фибринозно-некротизирующей, гнойной бронхопневмонии и эмболической пневмонии M. dispar выявляли в 50% случаев [20]. Одновременно с микоплазмами обнаруживались и другие бактерии, такие как Histophilus somni, Pasteurella multocida, Arcanobacterium pyogenes и Mannheimia haemolytica. В Великобритании M. dispar часто выявляют у телят с пневмонией, считается, что она является причиной тяжелой плевропневмонии, сходной с контагиозной плевропневмонией КРС, включенной в список Всемирной организации здравоохранения животных (ВОЗЖ) и подлежащей обязательной нотификации [21].

Детальные исследования определили точную роль M. dispar в развитии комплекса респираторных заболеваний КРС, который является хронической болезнью, поражающей молочных телят и мясной скот на откормочных площадках. В результате было установлено, что в животноводческой отрасли США производственные потери, расходы на лечение и профилактику данного заболевания составляют более 4 млрд долларов [21].

Телятам с комплексом респираторных заболеваний обычно назначают антимикробные препараты, в то время как некоторые из них неэффективны против микоплазм [22]. Следовательно, существует значительная опасность возникновения резистентности к такого рода лекарственным средствам, что отмечается и при лечении респираторных инфекций, вызванных другими бактериальными патогенами [23].

Механизмы патогенности M. dispar достаточно изучены, они включают в себя способность вырабатывать перекись водорода и формировать биопленки – оба известных фактора вирулентности. Также было отмечено, что данный вид микоплазм колонизирует эпителий слизистой оболочки дыхательных путей, оказывая цитостатическое и даже цитопатическое действие на клетки дистальных бронхов и бронхиол и приводя к нарушению трахеобронхиального клиренса [9][21][24]. Кроме того, было показано, что M. dispar оказывает иммуносупрессивное действие на организм хозяина [25]. В связи с этим данный вид микоплазм был включен вместе с Mycoplasma bovis в число возбудителей, вызывающих или усугубляющих комплекс респираторных заболеваний [8][21]. M. dispar является причиной экссудативного бронхита и пневмонии у телят, передача инфекции происходит в основном воздушно-капельным путем и при тесном многократном контакте [26].

Mycoplasma dispar вызывает образование уплотнений пурпурно-красного цвета, в основном в краниовентральных областях легкого [27]. При экспериментальном заражении телят M. dispar развивались умеренный субклинический бронхиолит с лимфоидной инфильтрацией и легкая пневмония [10]; иногда отмечались случаи мастита [28]. Другие авторы сообщают, что M. dispar вызывает альвеолит, при котором нейтрофилы, макрофаги и экссудат накапливаются в альвеолярных стенках и пространствах [26][29]. При полевых случаях субклинической пневмонии, когда из проб биоматериала была выделена M. dispar, регистрировали сходные поражения [30].

Объем генетической информации по M. dispar в открытых базах данных ограничен. Полногеномная последовательность референтного штамма M. dispar ATCC № 27140 была внесена в GenBank в 2015 г. На основе филогенетического анализа последовательности гена 16S рРНК M. dispar сгруппирована вместе с M. ovipneumoniae, M. flocculare и M. hyopneumoniae, выделяемыми от овец и коз [31].

Борьба с микоплазмозом должна включать меры по снижению стресса, обусловленного условиями окружающей среды, и обеспечению надлежащего содержания животных в помещениях с хорошей циркуляцией воздуха. Необходимо проводить мероприятия, направленные на предотвращение заражения телят от взрослых животных [8].

Одним из ключевых компонентов борьбы с микоплазмозами КРС является своевременная диагностика. Лабораторное подтверждение заболевания, вызванного M. dispar, играет важную роль, в связи с глобальным распространением патогена, что оказывает значительное влияние на благополучие животноводческой отрасли [18][32][33][34].

Классическим способом идентификации микоплазм КРС является их выделение на питательных средах, что имеет приоритетное значение, так как в этом случае можно получить наиболее полную информацию о культурально-морфологических и биологических свойствах возбудителя. Кроме того, у данного метода имеется дополнительное преимущество, заключающееся в возможности создания банка клинических изолятов, которые в дальнейшем можно использовать при разработке и совершенствовании стратегий профилактики, контроля и искоренения микоплазмозов, а также для выявления резистентности микоплазм к антибактериальным препаратам [8][18][33][34]. Но следует также отметить, что данный способ трудоемок и требует 7–10 дней для постановки диагноза [3][18][34].

Серологические тесты на выявление антител к M. dispar широко не распространены, хотя в прошлом сообщалось о применении реакции радиального гемолиза, иммуноферментного анализа [35] и пассивной гемагглютинации [36, 37]. Авторами описано, что наличие антител к M. dispar у КРС слабо выражено, поскольку данный вид микоплазм обитает только на поверхности легких, однако это может быть связано с низкой чувствительностью используемого серологического анализа, а не с недостаточностью гуморального ответа организма животного [35].

Использование ПЦР значительно облегчило выявление микоплазм, хотя только в 2004 г. было сообщено о ПЦР, специфичной для выявления генома M. dispar [38]. В данной реакции применялись специфические и универсальные олигонуклеотиды для обнаружения единичных полиморфизмов в 16S рРНК последовательности. В то же время был описан метод ПЦР/ДГГЭ (денатурирующий градиентный гель-электрофорез), который позволяет выявлять и идентифицировать более 70 различных микоплазм, включая M. dispar [39][40].

В современных условиях оперативность диагностики может быть достигнута за счет применения ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ), которая обеспечивает быструю и точную идентификацию специфических локусов генома микоплазм в пробах биологического материала [18][32][34][41].

Использование флуоресцентных (TaqMan) зондов, которые распознают конкретную последовательность-мишень в межпраймерном сегменте, позволяет достичь высокой специфичности исследования. В отличие от традиционных методов ПЦР, метод в реальном времени не требует дополнительных операций с образцом после амплификации, что снижает риск контаминации и приводит к сокращению времени проведения анализа и увеличению пропускной способности.

Включение в состав тест-систем ПЦР-PB внутреннего контрольного образца (ВКО) позволяет с высокой степенью достоверности интерпретировать полученные данные и исключить ложноотрицательные результаты из-за наличия в пробе ингибиторов ПЦР [42]. Таким образом, актуальной задачей для производителей современных тест-систем на основе ПЦР-РВ является использование ВКО, который позволяет контролировать как этап выделения нуклеиновой кислоты, так и этап амплификации [43-46].

Также стоит отметить, что в соответствии с требованиями ВОЗЖ в каждый ПЦР-тест рекомендуется включать BKO для контроля качества [47].

Наличие инструментов молекулярной идентификации геномов микоплазм, в том числе M. dispar, позволяет не только отслеживать эпизоотическую ситуацию в отечественных хозяйствах, но и осуществлять контроль как при ввозе животных, так и при использовании их в производственных целях [34][48].

На сегодняшний день в Российской Федерации отсутствуют коммерчески доступные тест-системы ПЦР-РВ отечественного производства, выявляющие ДНК М. dispar, в связи с чем разработка и внедрение в ветеринарную практику специфичной диагностической тест-системы на основе ПЦР-РВ является актуальной задачей [34].

Целью данной работы являлось определение основных валидационных характеристик и внедрение в ветеринарную практику разработанной в ФГБУ «ВНИИЗЖ» тест-системы для выявления ДНК M. dispar методом ПЦР-РВ.

Бактерии и вирусы. В работе использовали референтный штамм M. dispar (ATCC № 27140), полученный из коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ», а также пробы биологического материала, отобранные от КРС различных возрастных групп (стабилизированная кровь; назальные и трахеальные смывы; кусочки легких, трахеи и лимфатических узлов; плевральная жидкость).

Для оценки аналитической специфичности разработанной тест-системы были использованы штаммы бактерий: M. bovis ATCC № 25523, M. bovigenitalium ATCC № 19852, M. bovis «Калуга 2020», ДНК Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) Madugri-8 (ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии», Россия), Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (MmmSC) «T1/44/ВНИИЗЖ», а также другие бактериальные и вирусные агенты, способные вызвать аналогичную патологию у КРС: Escherichia coli «ЕС-21», Mannheimia haemolytica «№ 1412», Pasteurella multocida «№ 1414», изолят M. bovigenitalium, изолят M. dispar, изолят M. bovis, вирус парагриппа-3 КРС «ВГНКИ-4», респираторно-синцитиальный вирус КРС «Вологда/2020», вирус вирусной диареи КРС «NADL-ВНИИЗЖ».

Культивирование M. dispar. Референтный штамм M. dispar (ATCC № 27140) культивировали на рекомендованной American Type Culture Collection питательной среде 1699 Revised Mycoplasma Medium, состоящей из бульона с сердечно-мозговым экстрактом, – 7,5 г; 10× сбалансированного солевого раствора Хенкса – 40,0 мл; 0,25%-го раствора фенолового красного – 10,0 мл; термически инактивированной свиной сыворотки – 200,0 мл; 5%-го гидролизата лактальбумина в 1× фосфатно-буферном растворе – 100,0 мл; дрожжевого экстракта – 20,0 мл и дистиллированной воды – 660,0 мл. Культивирование проводили в инкубаторе при температуре (37 ± 0,5) °С и 5% CO2 в течение 5 сут. После завершения инкубации наблюдалось помутнение в пробирках и изменение цвета среды (пожелтение), на плотной питательной среде формировались колонии, характерные для M. dispar. Определение биологической активности М. dispar проводили путем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) [49][50].

Выделение ДНК осуществляли с использованием коммерческого набора «Ампли Прайм РИБО-сорб» (ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

Постановка ПЦР-РВ. Реакционная смесь для амплификации на одну реакцию содержала следующие компоненты: ПЦР-буфер-Б для Taq ДНК-полимеразы 10× («Синтол», Россия); SynTaq ДНК-полимераза с ингибирующими активность фермента антителами, 5 ЕД/мкл («Синтол», Россия); 25 мМ водный раствор хлорида магния MgCl2 («Синтол», Россия); 100 мМ водных растворов четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ): дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ (готовится общая смесь дНТФ и разводится водой, свободной от нуклеаз, до концентрации 10 мМ каждого дНТФ; Fermentas, Литва); прямой праймер (100 пмоль/мкл), обратный праймер (100 пмоль/мкл) и TaqMan-зонд (100 пмоль/мкл) для выявления участка гена, кодирующего 16S рРНК M. dispar («Синтол», Россия); прямой праймер (100 пмоль/мкл), обратный праймер (100 пмоль/мкл) и TaqMan-зонд (100 пмоль/мкл) для выявления искусственно синтезированного ВКО («Синтол», Россия) [51]. Полученный объем реакционной смеси доводили до 15 мкл водой деионизированной, свободной от нуклеаз («Евроген», Россия). После добавляли в подготовленные пробирки по 15 мкл реакционной смеси и по 10 мкл ДНК-матрицы исследуемых образцов. Амплификацию проводили в программируемом амплификаторе Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия).

В качестве положительного контрольного образца (ПКО) использовали плазмидную конструкцию, содержащую олигонуклеотидную последовательность участка генома (с начальной концентрацией 2 × 107 копий/мкл) и специфичный участок генома M. dispar (целевой фрагмент).

В качестве отрицательного контрольного образца (ОКО) и отрицательного контроля ПЦР (ОК) использовали воду деионизированную, свободную от нуклеаз («Евроген», Россия).

Валидация. Валидационные параметры тест-системы определяли согласно рекомендованному S. A. Bustin et al. руководству по публикации результатов разработки количественных ПЦР-РВ-протоколов [52].

Для установления специфичности разработанной ПЦР-РВ были протестированы образцы биологического материала, содержащие ДНК представителей рода Mycoplasma и нуклеиновые кислоты вирусов и бактерий, способных вызывать аналогичную патологию у КРС. Чувствительность тест-системы определяли, используя заведомо положительные пробы биологического материала, содержащие ДНК M. dispar.

Предел обнаружения ДНК M. dispar (аналитическую чувствительность) разработанной тест-системы устанавливали, применяя ПКО, включающий ДНК M. dispar с начальной концентрацией 2 × 107 копий/мкл, каждое разведение исследовалось в 5 повторностях.

Эффективность амплификации оценивали с помощью серии последовательных 10-кратных разведений положительного образца биоматериала, содержащего ДНК M. dispar, в 3 повторностях и вычисляли согласно формуле:

Е = (101/slope − 1) × 100%,

где slope – это значение наклона линейной области зависимости Ct от логарифма концентрации кДНК-матрицы.

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программы Microsoft Excel: рассчитывали средние значения и их стандартные отклонения (± SD), проводили регрессионный анализ и вычисляли коэффициенты вариации. Коэффициент вариации (CV) при оценке воспроизводимости и сходимости (повторяемости) не должен превышать 10%.

Анализ промежуточной прецизионности в условиях повторяемости (воспроизводимость) проводили с одним образцом, который тестировали в 5 повторностях в течение трех постановок ПЦР-РВ (n = 15).

Впервые в России в ФГБУ «ВНИИЗЖ» была разработана и валидировна тест-система на основе ПЦР-РВ с применением ВКО для выявления ДНК M. dispar.

Использование ВКО значительно повышает достоверность и точность результатов ПЦР, в том числе решает проблемы ингибирования. Комитет Американской ассоциации ветеринарных лабораторных диагностов (AAVLD) рекомендовал, чтобы все внедряемые молекулярные диагностические тесты, которые проходят процедуру валидации, включали стратегию контроля ингибирования реакции, основанную на внутренней валидации для тестируемого образца, целевого вида-хозяина и комбинации матриц проб [53].

Начальным этапом валидации тест-системы был подбор температурного профиля, при котором достигается максимальная аналитическая чувствительность и эффективность амплификации.

Оптимизация температурно-временного режима ПЦР-РВ проводилась с ранее выверенными концентрациями компонентов реакции для получения средних значений порогового цикла Сt. Результаты представлены в таблице 1.

Был определен следующий оптимальный температурно-временной режим ПЦР-РВ для выявления ДНК M. dispar: 5 мин при 95 °С (прогрев реакционной смеси), далее 40 циклов ПЦР, состоящих из денатурации ДНК в течение 15 с при 95 °С, отжига праймеров и элонгации кДНК в течение 60 с при 60 °С.

В результате проведенных испытаний продемонстрировано, что разработанная тест-система позволяет избежать ложноположительных результатов при тестировании с генетическим материалом бактерий – возбудителей респираторных заболеваний КРС. Показано, что тест-система обладает 100%-й аналитической специфичностью в отношении M. dispar (табл. 2), что выше, чем в исследовании J. B. W. J. Cornelissen et al., где специфичность составила 98,2% [54]. Олигонуклеотиды также верифицировались по базе данных BLAST NCBI, при этом значимой гомологии ни с одним из видов микоплазм не установлено, то есть олигонуклеотиды уникальны для генома M. dispar.

Эффективность амплификации при постановке реакции оценивали с помощью серии последовательных 10-кратных разведений положительного образца, содержащего ДНК M. dispar. На основе полученных средних значений порогового цикла каждого разведения эффективность амплификации (Е) составила 99,01%, что оказалось более значительным по сравнению с 97,49%-й эффективностью, продемонстрированной J. B. W. J. Cornelissen et al. при разработке одноплексной ПЦР [54]. Коэффициент детерминации (R2) при этом был равен 0,9832 (рис. 1).

Внутрилабораторную прецизионность в условиях воспроизводимости оценивали с учетом таких показателей, как «персонал», «время» и «оборудование». Испытания осуществляли с использованием биологического материала, содержащего и не содержащего ДНК M. dispar. Проведенные исследования показали, что результаты выявления ДНК M. dispar с использованием разработанной тест-системы полностью совпадают с ожидаемым результатом и не зависят от показателей «время», «персонал» и «оборудование».

Оценку промежуточной прецизионности в условиях повторяемости (сходимости) проводили с одним образцом, который тестировали в 5 повторностях в течение трех постановок ПЦР (n = 15).

Среднее значение порогового цикла (Ct) на протяжении трех постановок ПЦР-РВ варьировало от 26,74 до 27,36 с разбросом стандартного отклонения (SD) от 0,18 до 0,34. Коэффициент вариации составил 0,91% при максимальном допустимом значении 10%. При суммировании результатов трех постановок ПЦР-РВ среднее значение порогового цикла (Ct) и стандартного отклонения было равно 27,03 и ± 0,25 соответственно (табл. 3).

На следующем этапе определяли предел обнаружения (аналитическую чувствительность) ДНК M. dispar, выделенной из ряда 10-кратных последовательных разведений искусственно синтезированной последовательности ДНК, соответствующей специфичному участку в геноме M. dispar, с исходной активностью 2 × 107 копий ДНК/мкл. Каждое разведение исследовалось в 5 повторностях (табл. 4).

Установлено, что для разработанной тест-системы на основе ПЦР-РВ предел обнаружения ДНК M. dispar составляет 10 копий ДНК/мкл (100 копий ДНК/реакцию).

В исследованиях, проведенных L. McAuliffe et al., для дифференциации 32 видов микоплазм был использован денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE) продукта ПЦР 16S рибосомальной ДНК. Данный метод позволяет быстро идентифицировать многие виды микоплазм, для которых не существует специфичной ПЦР и которые выявляются с помощью культуральных и серологических тестов [39][40]. Однако артефакты, вносимые в ходе ПЦР или последующего DGGE-анализа, приводят к искажению результатов при использовании этого метода для количественного анализа α-разнообразия или относительного обилия оперативных таксономических единиц [55].

Некоторые исследователи для выявления M. dispar в пробах биологического материала использовали классическую ПЦР [31][38][56], однако ПЦР-РВ позволяет в режиме реального времени без использования гелей быстрее получить более точные результаты [57].

Анализ и интерпретация результатов. Рекомендуемые параметры ПЦР-анализа для каналов Green/FAM и Red/Cy5 тождественны: установка динамического фона, корректировка уклона, устранение выбросов на 10%, линейная шкала и пороговое значение, которое составляет 0,05 (рис. 2). Результаты интерпретируются на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что соответствует наличию или отсутствию на каналах Green/FAM и Red/Cy5 значений пороговых циклов амплификации (Ct) в соответствующих графах таблиц результатов, отображаемых амплификатором.

Результат ПЦР-РВ считают достоверным при условии получения корректных результатов для отрицательного контроля ПЦР, отрицательного контрольного образца «ОКО» (контроль экстракции) и положительного контроля «M. dispar». Требования к контролям описаны в таблице 5.

Интерпретацию результатов для исследуемых образцов необходимо проводить согласно требованиям, представленным в таблице 6.

С использованием разработанной тест-системы исследовали 228 проб биоматериала, отобранного от КРС с клиническими признаками респираторной патологии, поступивших в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2024 г. из 13 регионов РФ. Результаты представлены в таблице 7.

Установлено, что частота обнаружения ДНК M. dispar в образцах биоматериала составила 39,47%. Полученные данные свидетельствуют о достаточно широком распространении M. dispar среди КРС в российских хозяйствах в 2024 г.

Таким образом, в результате проведенных исследований были установлены основные валидационные параметры и доказана возможность применения тест-системы «МИК-ДИСПАР ПЦР-РВ» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») для выявления ДНК Mycoplasma dispar методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, которая продемонстрировала высокую аналитическую специфичность и чувствительность, сходимость и воспроизводимость в различных условиях проведения теста (диапазон коэффициента вариации: 0,66–0,91%). Эффективность амплификации (E) составила 99,01%, а предел обнаружения – 100 копий ДНК/реакцию. Важно отметить, что данные показатели являются ключевыми в объективной оценке качества тест-систем ПЦР.

Использование экзогенного внутреннего контрольного образца позволяет исключить ложноотрицательные результаты. С применением разработанной тест-системы в 2024 г. ДНК M. dispar была выявлена в 39,47% исследованных проб, поступивших из разных регионов РФ в ФГБУ «ВНИИЗЖ», что свидетельствует об актуальности диагностических исследований на обнаружение ДНК M. dispar. При этом внутренний контрольный образец служит индикатором этапа выделения и присутствия возможных ингибиторов.

Следует отметить, что валидационная составляющая данного исследования может быть расширена за счет включения других родственных микоплазм, таких как M. bovirhinis, M. flocculare и М. ovipneumoniae, однако данные о выявлении указанных патогенов у крупного и мелкого рогатого скота на территории РФ отсутствуют. Более того, М. ovipneumoniae является возбудителем микоплазменной пневмонии овец и коз, и риски его циркуляции среди КРС ничтожно малы [58, 59, 60]. Учитывая высокую специфичность олигонуклеотидов при использовании ресурса BLAST, тест-система может применяться для диагностических исследований КРС на выявление ДНК M. dispar.

Таким образом, данная тест-система может служить эффективным инструментом в ветеринарной лабораторной практике для выявления ДНК M. dispar в пробах биологического материала от КРС.