Анализ инсектицидной устойчивости к пиретроидам, фосфорорганическим соединениям и карбаматам у Musca domestica L. методом ПЦР-ПДРФ

ВВЕДЕНИЕ

Значимым фактором в распространении различных заболеваний человека и животных являются насекомые [1][2], включая синантропных и зоофильных мух, к числу которых относится комнатная муха Musca domestica L. (Diptera: Muscidae) [3][4]. Способность взрослых особей M. domestica быть механическим переносчиком таких патогенов, как яйца гельминтов, простейшие, вирусы и бактерии, в том числе антибиотикорезистентные штаммы, продемонстрирована рядом исследований [4-7]. Так, бактерии Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida, Histophilus somni, вызывающие респираторные заболевания крупного рогатого скота, были выделены из особей M. domestica, собранных на откормочных площадках, где находились животные с симптомами данных заболеваний [5]. При исследовании гомогенатов, приготовленных из комнатных мух, населявших молочные и мясные фермы США, у выделенных бактерий идентифицировали гены устойчивости к тетрациклинам и флорфениколам с распространенностью от 5 до 95,8% [6]. В лабораторных условиях была показана способность вируса ньюкаслской болезни сохраняться в инфицирующей дозе в кишечнике мух в течение четырех дней после питания зараженным молоком и одного дня – куриным пометом [7], что повышает риск распространения данного заболевания при наличии мух в птицеводческих хозяйствах. Учитывая ветеринарное значение зоофильных мух, необходимо контролировать их численность.

Несмотря на большой интерес к биологическим методам борьбы с вредными насекомыми, химический метод, основанный на использовании синтетических инсектицидных средств, остается повсеместно применяемым. Для защиты животных от насекомых и дезинсекции животноводческих помещений как в России, так и за рубежом наиболее часто используют синтетические пиретроиды, неоникотиноиды, фосфорорганические соединения (ФОС), карбаматы [4][8]. Для M. domestica характерно достаточно быстрое развитие резистентности к инсектицидам при интенсивном их применении: например, в лабораторных условиях за 10–20 поколений выявлено более чем 20-кратное возрастание устойчивости к перметрину [9] и альфа-циперметрину [10]. Согласно ряду исследований, устойчивость к пиретроидам (дельтаметрину, перметрину, бета-цифлутрину, циперметрину) наблюдалась у природных популяций комнатной мухи в Китае [11][12], Пакистане [9], Иране [13], США [14], Саудовской Аравии [10][15], в Московской и Калужской областях нашей страны [8]. В Тюменской области также были зафиксированы толерантные и исключительно высокорезистентные к пиретроидам природные популяции [16][17]. Устойчивые к ФОС популяции комнатной мухи были обнаружены, например, в Китае [12], Иране [18], Саудовской Аравии [15][19]. Инсектицидная резистентность природных популяций M. domestica осложняет контроль их численности.

Молекулярной мишенью пиретроидов являются потенциалзависимые натриевые каналы (voltage-sensitive sodium channel, vssc), а маркером устойчивости к ним признано наличие мутаций в кодирующих данный белок генах – нокдаун-резистентность (knockdown resistant, kdr) [14, 20]. Из пяти известных аллелей, связанных с нечувствительностью мишени и, следовательно, c устойчивостью насекомых к пиретроидам, наиболее часто исследуют наличие kdr (L1014F) и kdr-his (L1014H) [13][14][20]. Нечувствительность мишени нередко сочетается с другим основным механизмом устойчивости к пиретроидам – усиленной детоксикацией инсектицидов посредством цитохром Р450-зависимых монооксигеназ (CYP). Подтвержденным молекулярным маркером данного типа резистентности является наличие вставки из 15 пар нуклеотидов (п. н.) в гене CYP6D1 [21][22]. Ацетилхолинэстераза (АХЭ), кодируемая геном ace, является ключевым ферментом холинергической системы и основной мишенью ФОС и карбаматных инсектицидов, которые блокируют передачу нервных импульсов в холинергических синапсах. Устойчивость к ФОС и карбаматам может быть обусловлена нечувствительностью АХЭ вследствие мутаций в гене ace либо вследствие мутаций в генах карбоксилэстеразы, приводящих к повышению гидролитической активности фермента по отношению к ФОС [20][23]. Известно, что у M. domestica присутствует только один ген, кодирующий АХЭ, – ace-2 [24] и подробно описаны шесть основных мутаций, связанных с устойчивостью к ФОС и карбаматам: V260L, A316S, G342A, G342V, F407Y и G445A [25-27].

Анализ резистентности к инсектицидам у природных популяций M. domestica в России традиционно проводится с помощью токсикологических методов [8][17][28], которые позволяют установить наличие устойчивого фенотипа и уровень резистентности и не дают представления о механизмах, лежащих в основе инсектицидной устойчивости [29]. Установление механизмов, обеспечивающих резистентность, и оценка потенциала ее формирования выполняются с помощью биохимических и молекулярных методов [30] и имеют критическое значение для обоснованного выбора инсектицидных средств и разработки схемы их применения. По сравнению с традиционными токсикологическими методами молекулярные исследования дают более полную информацию о структуре популяции, а сочетание токсикологических и молекулярных методов позволяет объективно оценить уровень адаптации популяции к инсектицидной нагрузке [31]. Среди молекулярных методов выявления мутаций, ассоциированных с инсектицидной устойчивостью, находит применение ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция с детекцией мутаций с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов) [32]. Метод ПЦР-ПДРФ является экономичным, простым в реализации и требует только базового молекулярно-генетического оборудования, он широко доступен и является достойной альтернативой секвенированию.

Цель исследования заключалась в тестировании методом ПЦР-ПДРФ особей Musca domestica трех природных популяций Тюменской области на наличие мутаций в генах CYP, vssc и ace-2, ассоциированных с устойчивостью к пиретроидам, ФОС и карбаматам.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили мухи M. domestica трех природных популяций, собранных в 2021–2023 гг. в животноводческих помещениях Тюменской области: Nov (56.53700°, 65.24238°), Cha (56.781583°, 65.96014°), Nik (55.55352°, 70.62864°). В условиях инсектария от собранных насекомых каждой популяции было получено первое поколение (F1), взрослые особи которого в возрасте 3–5 сут были заморожены и до исследования хранились при температуре –80 °С.

Из имаго мух (по 5 самок и самцов каждой популяции) ДНК выделяли методом щелочного лизиса [33]. Процесс амплификации выполняли на приборе GeneExplorer GE-96G (Bioer, Китай) с использованием индивидуальной пары праймеров для каждого гена. Для генотипирования мутаций в гене vssc были использованы праймеры Р1, Р2, Р3, Р4, а для гена ace-2 – праймеры AceF и AceR, заимствованные из исследования X. Qiu et al. [32]. Для генотипирования мутации в гене CYP6D1 были использованы праймеры (S35 и AS2) и рестриктаза в соответствии с исследованием F. D. Rinkevich et al. [34]. Условия амплификации были идентичными, за исключением температуры отжига праймеров (табл. 1): 95 °С – 5 мин, затем 95 °С – 20 с, 62–53 °С – 30 с, 72 °С – 30 c (5 циклов), 95 °С – 20 с, 60–51 °С – 30 с, 72 °С – 30 c (35 циклов), 72 °С – 10 мин. Реакционная смесь для ПЦР включала: 1 µL тотальной ДНК; 4 µL готовой смеси для ПЦР 5X ScreenMix-HS (Евроген, Россия); 0,3 µL каждого праймера (25 мкМ); 14,4 µL очищенной стерильной воды (18,2 мкСм/см). Ферменты рестрикции с условиями реакции указаны в таблице 1. Визуализацию результатов рестрикции осуществляли при помощи 2%-го агарозного гель-электрофореза с добавлением красителя этидиум бромид.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Степень распространения и частота мутаций, ассоциированных с устойчивостью к пиретроидам и ФОС, были исследованы у природных популяций M. domestica в Дании [35], Турции [36], Иране [26][37], США [14][34], Казахстане [22], Объединенных Арабских Эмиратах (ОАЭ) [38] и других странах. В отношении российских популяций M. domestica оценка устойчивости к пиретроидам и другим инсектицидам ранее проводилась в основном с помощью токсикологических методов [8][17][28]. Данные о результатах молекулярных исследований природных популяций комнатной мухи и генетическом потенциале формирования инсектицидной устойчивости в локальных популяциях Российской Федерации в открытой печати не представлены.

Для генотипирования vssc методом ПЦР-ПДРФ используются рестриктазы Sse9I и Fat I. Рестриктаза Sse9I в случае наличия мутации L1014F разрезает ампликон размером 156 п. н. на 2 фрагмента с длинами 96 и 60 п. н. соответственно. Мутация L1014H выявляется с помощью фермента Fat I, который при наличии мутации разрезает ампликон 220 п. н. на фрагменты размерами 170 и 50 п. н. соответственно [22]. Объединив результаты двух анализов, нами были получены следующие генотипы (рис. 1): 1014 (L/L), 1014 (L/F), 1014 (F/F). Мутация L1014F была обнаружена у 70% исследованных особей популяции Nov и Cha и у 40% особей популяции Nik (табл. 2).

Для генотипирования CYP методом ПЦР-ПДРФ применяют рестриктазу Hpy 188III. Для резистентного аллеля CYP6D1v1 характерна вставка в 15 п. н., которая нарушает последовательность распознавания фермента Hpy 188III. В результате после рестрикции фрагменты с длинами 432 и 279 п. н. будут характерны для генотипа дикого типа, а 732 п. н. – для несущего мутацию генотипа [34]. При исследовании не выявлен резистентный аллель СYP6D1v1, однако на рисунке 2 видно, что у некоторых особей бэнд в 432 п. н. дополнительно разрезается ферментом Hpy 188III.

ПЦР-ПДРФ-анализ гена ace-2 был выполнен с использованием ферментов Mh1 I и Aco I. Рестриктаза Mh1 I имеет сайт рестрикции (GGC), который характерен для генотипа дикого типа – 342G. После рестрикции обнаружение двух фрагментов 361 и 248 п. н. на электрофореграмме свидетельствует о присутствии дикого типа, а фрагмент 609 п. н. – о наличии мутации G342A или G342V. Рестриктаза Aco I распознает наличие мутации G342A и разрезает ампликон на 2 фрагмента длиной 361 и 248 п. н. Таким образом, объединение двух анализов позволяет выявить 6 различных генотипов [32]. В нашем исследовании удалось обнаружить 3 различных генотипа (рис. 3). В популяции Nov мутации G342A или G342V не выявлены. В популяции Nik доля особей с мутациями G342A и G342V составила 10 и 40% соответственно. В популяции Cha обнаружена только мутация G342A у 60% особей (табл. 2).

В совокупности при проведении исследования методом ПЦР-ПДРФ было выявлено 3 мутации из 5 исследованных – L1014F, G342A, G342V. Частоты распределения резистентных аллелей по трем популяциям представлены в таблице 2. Мутация kdr (L1014F) обнаружена в гетеро- и гомозиготном состоянии у 7 из 10 особей популяций Nov и Cha, у 4 из 10 особей популяции Nik. Мутация kdr-his (L1014H) не была выявлена ни в одной из трех популяций. По результатам исследования особей природных популяций M. domestica в Турции частота аллелей kdr и kdr-his составила 8 и 20% соответственно [36]. Обследование шести природных популяций комнатной мухи Казахстана показало наличие аллеля kdr в одной из популяций с частотой 5% и аллеля kdr-his в другой популяции с частотой 14,3% в гетерозиготном состоянии [22]. Интересно, что в иранской популяции M. domestica мутация L1014F не была зафиксирована, а процент полиморфизма kdr-his (L1014H) был невелик и составил 4,7% [37]. Напротив, в США мутация kdr (L1014F) присутствовала во всех шести исследованных популяциях комнатной мухи, обитающих на птицеводческих и животноводческих фермах, а kdr-his (L1014H) – в пяти. При этом частота аллелей kdr-his и kdr в популяциях варьировалась в широком диапазоне: 12,5–28,1% и 7,1–76,6% соответственно [14]. В недавно опубликованной работе сообщается об обнаружении kdr-аллеля у особей M. domestica из Объединенных Арабских Эмиратов с частотой от 9,4 до 46,9% [38]. По частоте резистентного аллеля kdr (30–55%) популяции комнатной мухи Тюменской области сопоставимы с популяциями из США и ОАЭ.

Согласно литературным данным, нокдаун-резистентность впервые была зарегистрирована у комнатной мухи в 1950-х гг. как нечувствительность натриевых каналов к действию дихлордифенилтрихлорэтана (ДДТ). Позднее было установлено, что такая устойчивость связана с нуклеотидной заменой (цитозина на тимин) в гене vssc, приводящей к замене лейцина на фенилаланин в позиции 1014 (L1014F) альфа-субъединицы натриевого канала [39]. В результате происходят структурные изменения белковой молекулы, влияющие на взаимодействие инсектицида с мишенью. Данная мутация приводит также к формированию устойчивости к пиретроидам, поскольку они имеют схожий с ДДТ механизм действия. Мутация L1014F, помимо M. domestica, была обнаружена у других двукрылых насекомых (например, комаров родов Culex и Anopheles, жигалок рода Haematobia), рыжего таракана (Blattella germanica), кошачьей блохи (Ctenocephalides felis), крысиной блохи (Xenopsylla cheopis), триатомовых клопов (например, Triatoma infestans) и других членистоногих [39][40].

Одним из в достаточной мере описанных механизмов резистентности к пиретроидам у насекомых является усиление детоксикации, опосредованной CYP [41]. Такой тип инсектицидной устойчивости M. domestica связан с повышенной экспрессией гена CYP6D1 при наличии вставки в 15 п. н. (аллель CYP6D1v1) [34]. В США резистентный аллель CYP6D1v1 обнаруживали с частотой > 75% в 5 исследованных популяциях M. domestica [14]. По данным V. Taşkın et al., в турецкой популяции комнатной мухи частота CYP6D1v1 составила 39% [36]. В Казахстане данный аллель присутствовал в 3 из 6 популяций M. domestica с гораздо меньшей частотой: 4,4–6,3% [22]. В нашем исследовании ПЦР-ПДРФ-анализ не выявил характерной для резистентного аллеля CYP6D1v вставки в 15 п. н., однако у особей популяций Nov и Cha была обнаружена мутация, описанная ранее для лабораторной культуры M. domestica [42]. В работе J. C. Freeman et al. справедливо отмечено, что CYP6D1v1 только частично ответственен за увеличение уровня экспрессии CYP6D1 [14]. В силу высокой эволюционной пластичности CYPs другие их представители или другие еще не описанные мутации могут быть вовлечены в формирование устойчивости к инсектицидам в целом и пиретроидам в частности в локальных популяциях M. domestica.

Выявление достаточно большого процента особей с мутацией kdr среди M. domestica трех исследованных нами природных популяций не удивительно, поскольку, согласно проведенным опросам, в животноводческих хозяйствах, где были собраны насекомые, на протяжении нескольких сезонов для дезинсекции помещений и защиты животных от назойливых насекомых использовали пиретроиды (в основном дельтаметрин и цифлутрин). Применение этих инсектицидов в данном случае послужило фактором отбора, который, по-видимому, позволил мутации kdr (L1014F) закрепиться в исследованных популяциях. Считается, что в случае наличия мутации kdr (L1014F) формируется более высокий уровень резистентности к пиретроидам, чем при наличии мутации kdr-his (L1014H) [36][37]. Для того чтобы замедлить появление высокорезистентных к пиретроидам популяций, в исследованных животноводческих хозяйствах целесообразно заменить пиретроиды на инсектициды с отличающимся механизмом действия (например, пирролы, оксадиазины, регуляторы развития насекомых и др.).

Высшие двукрылые имеют только один ген, кодирующий АХЭ, и, соответственно, у данной группы насекомых мутации, обеспечивающие устойчивость к ФОС и карбаматам, обнаружены только в гене ace-2. Такие мутации по отдельности или в комбинации приводят к аминокислотным заменам близко к каталитической триаде активного центра фермента, влияя на ориентацию аминокислот триады и ограничивая доступ и/или связывание объемных инсектицидов (ингибиторов фермента) в субстратном центре белка [25]. Для M. domestica подробно описаны шесть таких мутаций: V260L, A316S, G342A, G342V, F407Y и G445A [25][28]. Известно, что, помимо M. domestica, устойчивость к ФОС и карбаматам по сходному механизму формируется у других видов насекомых, например, зеленой мясной мухи Lucilia cuprina [43], Drosophila melanogaster [44][45] и мух из семейства пестрокрылок Bactrocera oleae [46] и Bactrocera dorsalis [47]. В работе S. Başkurt et al. [48] указаны эквивалентные замены аминокислотных остатков в молекуле АХЭ для M. domestica и D. melanogaster. Литературные данные свидетельствуют о широкой распространенности по всему миру мутаций, лежащих в основе устойчивости комнатной мухи к ФОС и карбаматам. Так, резистентные аллели G342A и G342V были обнаружены у особей природных популяций M. domestica США, Китая, Ирана, Казахстана [14][22][26][49]. У казахстанских популяций комнатной мухи резистентные аллели G342A и G342V встречались с частотой 27–48 и 0–20% соответственно [22]. Мутации G342A и G342V были выявлены у 30 и 40% иранских особей M. domestica соответственно [26]. В нашем исследовании резистентный аллель G342V был представлен только в популяции Nik (мутация присутствовала у 40% особей) с частотой 25%, аллель G342A в популяциях Nik (у 10% особей) и Cha (у 60% особей) с частотой 5 и 30% соответственно, а в популяции Nov данные мутации не обнаружены. Предполагается, что аллель с мутацией G342V играет более значимую роль в нечувствительности АХЭ и формировании высокого уровня устойчивости к отдельным инсектицидам в сравнении с G342A [14][25][49].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данном исследовании анализ ПЦР-ПДРФ позволил выявить присутствие аллеля kdr (L1014F), ответственного за формирование устойчивости к пиретроидам, с частотой 30–55% и аллелей G342A/V, связанных с устойчивостью к ФОС и карбаматам, с частотой 5–30% у особей соответственно трех и двух природных популяций M. domestica Тюменской области. Представленные данные свидетельствуют о потенциале формирования устойчивости к пиретроидам, ФОС и карбаматам в исследованных популяциях. На основании полученных результатов можно рекомендовать замену данных инсектицидов при проведении дезинсекции животноводческих помещений препаратами из других групп с целью сдерживания распространения резистентных аллелей в локальных популяциях M. domestica. Для более полной оценки ситуации по резистентности к пиретроидам, ФОС и карбаматам и потенциале ее формирования у M. domestica в России необходимы дальнейшие молекулярные исследования насекомых из разных регионов страны.