Изучение воздействия вакцинации в отношении Staphylococcus aureus, вызывающего маститы и эндометриты у коров

ВВЕДЕНИЕ

Заболевания стафилококковой этиологии занимают одно из ведущих мест в патологии животных и требуют высококвалифицированного, длительного и дорогостоящего лечения [1][2]. Стафилококки способны поражать любую ткань или орган и вызывать более 100 различных заболеваний – маститы, эндометриты, дерматиты, пневмонии, артриты, гнойные и раневые инфекции, пищевые отравления, сепсис и др. За счет продуцирования большого количества энтеротоксинов стафилококки оказывают сложное воздействие на иммунную систему организма животного, приводящее к его низкой сопротивляемости. Все стафилококковые энтеротоксины представляют собой белки с относительно небольшой молекулярной массой: от 26 900 до 29 600 Да. К классическим относятся пять основных типов стафилококковых энтеротоксинов: A, B, C, D и E (SEA-SEE), которые, как полагают, отвечают за 95% всех стафилококковых отравлений. Профилактика пищевых отравлений зависит от эффективности их ранней диагностики, то есть обнаружения энтеротоксигенных стафилококков в молоке, молочных и других пищевых продуктах [3][4].

Основным возбудителем стафилококкозов у крупного рогатого скота считается Staphylococcus aureus, который выделяется в количестве до 69,5% в общей структуре стафилококкоза [5]. В пробах биологического материала, отобранного от коров с признаками мастита и эндометрита, чаще всего обнаруживают бактерии вида S. аureus [6-8]. По сообщениям исследователей, S. аureus выделяли из 8,8% образцов молока здоровых коров, от 59,3 до 62,8% случаев выявления данного патогена приходилось на пробы молока коров, больных субклиническим маститом. Из секрета вымени коров с клинической формой мастита и сборного молока возбудитель изолировали в 28,8 и 18% случаев соответственно [6][9]. При проведении бактериологических исследований смывов из влагалища коров учеными было установлено, что одним из доминирующих видов патогенных микроорганизмов при послеродовых эндометритах являлись S. аureus – 15,3% от общего количества исследуемых культур [10].

Заболевания, вызванные S. aureus, характеризуются низкой частотой успешного выздоровления по сравнению с другими возбудителями, что объясняется приобретением резистентности к противомикробным препаратам и способностью этих бактерий к биопленкообразованию [11][12].

В последние годы S. аureus, изолированные от животных, становятся все более устойчивы к антибиотикам, в том числе за счет продуцирования фермента β-лактамазы, способной расщеплять пенициллины и цефалоспорины [13-17]. Почти в 90% больших ферм и комплексов, где используют антибиотики, регистрируется стафилококковый мастит, вызванный резистентными штаммами S. aureus [3][18-20]. Особенно часто встречаются устойчивые к пенициллину штаммы S. aureus, что называют первой волной устойчивости, и к метициллину – вторая волна устойчивости. В своих исследованиях О. А. Артемьева и соавт. установили, что наивысшая степень резистентности изолятов S. aureus в условиях in vitro наблюдалась к эритромицину (82,5%) и фузидину (75,7%). Только у 7 выделенных штаммов (6,8%) выявили чувствительность ко всем исследуемым антибиотикам, тогда как 96 изолятов оказались устойчивы по крайней мере к одному из них [21]. По данным И. С. Абдиной и соавт., резистентность S. aureus к антибиотикам значительно варьировала, при этом самая высокая устойчивость зарегистрирована к ампициллину (до 57%), бензилпенициллину (до 45%), доксициклину (до 38%), оксациллину (до 48%), стрептомицину (до 55%) и тетрациклину (до 45%) [22]. Другие исследователи определили, что из 64 выделенных штаммов S. aureus 60 (93,7%) проявляли резистентность к одному и более антимикробным препаратам. У изучаемых микроорганизмов S. aureus наблюдали множественную лекарственную устойчивость [11].

Несмотря на большой рост заболеваемости животных стафилококковыми инфекциями, до сих пор не разработаны эффективные препараты для их лечения. Распространение штаммов S. aureus со множественной лекарственной устойчивостью затрудняет борьбу с болезнями [23]. Даже при успешном лечении животных антибиотиками существует опасность попадания их в организм человека. Высокая контагиозность стафилококковых инфекций и появление антибиотикоустойчивых штаммов микроорганизмов является наиболее серьезной угрозой современности, а также немаловажной проблемой для отрасли и наносят скотоводству огромный экономический ущерб, выражающийся в недополучении молока, ухудшении его санитарных и технологических качеств, увеличении затрат на лекарства и ветеринарные расходы, ранней выбраковке коров и снижении их воспроизводительной функции. В связи с этим необходимо осуществлять поиск альтернативных вариантов, основанных на принципах подавления стафилококков, снижения применения антибиотиков и минимизации их негативного воздействия на организм. Одним из таких вариантов являются средства специфической профилактики – вакцины, которые обеспечивают надежную защиту животных от инфекционных болезней, что приводит к сокращению использования антибиотиков и предотвращению устойчивости микроорганизмов к ним [24][25]. Учеными доказана эффективность вакцин, содержащих в своем составе антиген S. aureus, при маститах и эндометритах коров. Так, исследования показали, что иммунизация животных против мастита оказывает положительное действие: через 6 мес. с момента применения первой вакцинации животных в племенном репродукторе и заводе количество случаев мастита снизилось на 16,6 и 7,3% соответственно, а уровень соматических клеток в молоке высокопродуктивных коров – на 26,5 и 10,7%. Эффективность иммунизации сохранялась и спустя 12 мес. с момента введения вакцины [26]. При применении вакцины «Комбовак-Эндомаст» (ООО «Ветбиохим», Россия) произошло снижение количества случаев клинически выраженных маститов в 7,8 раза, субклинических – в 5,4 раза, эндометритов – в 3,7 раза [27]. При проведении опыта с вакциной Mastivak в Испании специалистами компании Laboratorios Ovejero S. A. установлено, что в опытной группе, по сравнению с контролем, клинические случаи мастита сократились на 32% [9].

Цель – изучить влияние иммунизации в отношении S. aureus, вызывающего маститы и эндометриты у коров.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили с 2021 г. в условиях крестьянско-фермерского хозяйства Республики Мордовия. Для опытной и контрольной групп отобраны взрослые стельные коровы черно-пестрой породы по 10 гол. в каждой. При проведении исследований животные подбирались по принципу аналогов, то есть у всех особей обеих групп были стандартные параметры массы тела, возраст, состояние здоровья, условия содержания. Животным опытной группы вакцину вводили подкожно в область средней трети шеи двукратно. Первую дозу в объеме 3 см³ вводили за 55–70 дней до отела, вторую – за 25–30 дней до предполагаемого отела в том же объеме. Вакцина содержит в одной иммунизирующей дозе штаммы: Escherichia coli УР-10, Streptococcus agalactiae УР-7, Streptococcus dysgalactiae УР-16, Streptococcus uberis ОБ-5, Streptococcus pyogenes ОБ-4, Staphylococcus aureus ОБ-И4, Klebsiella pneumoniae К-2 (не менее 3,5 × 10⁹ КОЕ каждого), инактивированные формалином (0,3%-й раствор) и адсорбированные на геле карбомера (10% от объема). Вакцина предназначена для профилактики маститов и эндометритов коров. Животным контрольной группы подкожно вводили стерильный физиологический раствор в сопоставимом объеме и с тем же интервалом.

Предварительно, перед началом опыта, у 20 больных клинической формой мастита коров, не входящих в опытную и контрольную группы, проведено микробиологическое исследование проб молока на присутствие изолятов S. aureus, а также серологическое исследование крови на наличие антител в отношении S. aureus.

У животных обеих групп отбирали кровь для изучения антигенной активности вакцины в отношении S. aureus и пробы молока для проведения бактериологического исследования. Забор крови в опытной группе производили через 14–16 сут после двукратной иммунизации, в контрольной группе – через 14–16 сут после двукратного введения животным стерильного физиологического раствора (препарат плацебо).

Все манипуляции с животными проводились с соблюдением этических стандартов, принятых Европейской конвенцией ETS № 123.

Антигенную активность вакцины оценивали по нарастанию титра антител в отношении S. aureus в реакции агглютинации. Для постановки реакции сыворотки крови разводили стерильным физиологическим раствором от 1:2 до 1:4096 и к 0,5 см³ каждого разведения сыворотки добавляли по 0,5 см³ антигена S. aureus ОБ-И4 с концентрацией ~5 × 10⁸ КОЕ/мл. Смесь сыворотки с антигеном тщательно перемешивали, помещали в термостат и выдерживали в течение 16–18 ч при температуре (37 ± 1) °C, а затем еще 3–4 ч при комнатной температуре. После чего просматривали на наличие агглютинации. Реакцию учитывали под агглютиноскопом и оценивали в крестах по четырехбалльной системе: 4 креста – агглютинировано 100% клеток (полное просветление жидкости); 3 креста – агглютинировано 75% клеток (легкое помутнение жидкости); 2 креста – агглютинировано 50% клеток (среднее помутнение жидкости); 1 крест – агглютинировано 25% клеток (сильное помутнение жидкости); отрицательная реакция – агглютинация отсутствует (гомогенная взвесь бактерий).

Молоко собирали в объединенные пробы из всех четырех долей вымени, но при этом пробы молока от разных животных исследовались отдельно, то есть не подвергались объединению. Бактериологическое исследование молока проводили в первый месяц лактации коров после отела в соответствии с «Методическими указаниями по бактериологическому исследованию молока и секрета вымени коров»¹. Идентификацию S. aureus осуществляли согласно ГОСТ 30347-2016 «Молоко и молочная продукция. Методы определения Staphylococcus aureus»², а также методом масс-спектрометрии (MALDI-ToF)³.

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методиками с использованием программ Microsoft Office Excel 2010, Stat Plus 2009.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

По результатам серологических исследований установлено, что в опытной группе коров после вакцинации титр антител к S. aureus колебался от 4,01 до 4,61 lg, его среднее значение составило (4,34 ± 0,06) lg. В контрольной группе животных средние значения титра антител к S. aureus были в 5,8 раза ниже и составили (0,75 ± 0,09) lg с колебаниями от 0,3 до 1,2 lg (табл.).

Как показали полученные данные, иммунизация способствовала росту антител в отношении S. aureus у коров опытной группы, что подтверждает высокую иммуногенность вакцины. Кроме того, в крови животных при предварительном серологическом исследовании титр антител к S. aureus был практически идентичен титру в контрольной группе коров и составил (0,70 ± 0,05) lg.

Лоскутова И. В. и соавт. также определяли, что у клинически здоровых коров, иммунизированных вакциной Mastivak (Laboratorios Ovejero S. A., Испания), содержащей в своем составе S. aureus, в сыворотке крови образуются антитела к энтеротоксинам S. aureus, что свидетельствует о способности препарата вызывать иммунный ответ организма животного к указанному антигену [12]. Hadimli H. H. et al. в своих исследованиях оценивали эффективность стафилококковой вакцины по увеличению титра антител против S. aureus у вакцинированных животных [28].

На следующем этапе выполняли бактериологическое исследование молока на наличие в нем S. aureus.

При проведении предварительного исследования молока от 20 коров, больных клинической формой мастита, S. aureus обнаружили в 11 пробах, что составило 55% от общего количества исследованных проб. В контрольной группе S. aureus выделили в половине исследуемых проб молока – возбудитель выявлен в 5 из 10 образцов (50%). В молоке коров из опытной группы S. aureus обнаружили в 20% случаев (в 2 пробах), что в 2,7 и в 2,5 раза ниже по сравнению с группой коров до проведения опыта и контрольной группой соответственно.

На рисунке видно, что доля выделения S. aureus у невакцинированных животных (контрольная группа и группа коров, больных клинической формой мастита) практически одинакова, у иммунизированных коров она была значительно ниже.

Эффективность вакцинации в отношении S. aureus при маститах коров устанавливали и другие исследователи, которые в пробах молока до вакцинации изолировали золотистый стафилококк в 73,3% случаев, а через 6 мес. после первой иммунизации животных выделение возбудителя снизилось до 26,6%, то есть в 2,7 раза [29].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, было установлено, что при двукратной иммунизации вакциной в крови животных повышается уровень антител к S. aureus – средние значения титра в опытной группе были в 5,8 раза выше, чем в контрольной. В пробах молока, полученных от вакцинированных животных, снижалось выделение патогена S. aureus в 2,7 и в 2,5 раза по сравнению с группами неиммунизированных животных. Полученные результаты свидетельствуют о том, что применение вакцины способствует формированию иммунного ответа организма животного в отношении S. aureus.