Кишечная микрофлора и бактериальные ассоциации на фоне гельминтозной инвазии при желудочно-кишечных заболеваниях у обезьян

ВВЕДЕНИЕ

Состояние микробиоты кишечника является одним из важных факторов здоровья животных и человека. Микроорганизмы попадают в пищеварительный тракт сразу после рождения животного и играют важную роль в его жизни. Как известно, основу нормофлоры кишечника составляют бифидо- и лактобактерии, кишечная палочка с нормальной ферментацией, энтерококки. Исследования показывают, что изменение количественного и качественного состава кишечной микрофлоры приводит к нарушению работы кишечника и возникновению заболеваний желудочно-кишечного тракта [1][2][3][4]. Этиологическими агентами кишечных инфекций могут быть бактерии, вирусы, простейшие, гельминты, грибы. Однако в развитии кишечных заболеваний значительную роль играет не только микробная концентрация, но и ассоциации разных видов микроорганизмов, в которых они вступают в симбиоз или антагонизм и экспрессируют факторы патогенности [5][6]. Гельминты также изменяют количественный и качественный состав микрофлоры кишечника, формируя микропаразитоценоз [7][8][9].

Обезьяны имеют анатомическое и физиологическое сходство с человеком, проявляют естественную восприимчивость ко многим инфекционным заболеваниям [10][11][12]. Наблюдениями установлено, что обезьяны и в местах естественного обитания, и в условиях неволи болеют разными болезнями, свойственными другим животным и человеку. В Адлерском питомнике ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицинской приматологии» (ныне Курчатовский комплекс медицинской приматологии НИЦ «Курчатовский институт») содержатся обезьяны разных видов. Согласно нашим ежегодным данным, гибель обезьян более чем в половине случаев происходит в результате заболеваний желудочно-кишечного тракта [13][14]. Кишечные заболевания обезьян представляют собой сложные инфекционные процессы, чаще всего протекающие по ассоциативному типу, с формированием разных бактериальных и паразитарных сочетаний [15][16]. Кишечные паразиты заражают различные виды обезьян как в дикой природе, так и в неволе, вызывая серьезные заболевания пищеварительного тракта, в некоторых случаях приводящие к смерти животных [17][18][19][20]. По данным зарубежных авторов, нематоды являются наиболее распространенными гельминтами у обезьян, содержащихся в зоопарках, и могут передаваться человеку [21][22]. В иностранной научной литературе имеются сведения о кишечных паразитах, выделенных у приматов, содержащихся в зоопарках и заповедниках либо у свободноживущих, но эти данные относятся к конкретным видам и небольшим группам обезьян [23][24][25]. Кроме того, в этих работах описываются только результаты паразитологических исследований.

Актуальность данной работы определяется тем, что заболевания желудочно-кишечного тракта представляют первую по значимости причину гибели обезьян в питомнике. В то же время кишечные паразитозы и бактериальные ассоциации, формирующие кишечные заболевания у обезьян, являются еще малоизученной проблемой. В предыдущих наших исследованиях показана циркуляция простейших и гельминтов среди обезьян питомника и приведены некоторые данные по сопутствующей микрофлоре [15][16]. В данной работе хотели бы акцентировать внимание на состоянии микробиоты кишечника обезьян, инвазированных нематодами, и особенностях бактериальных ассоциаций при ее формировании.

Новизна работы заключается в том, что наше исследование явилось первым, где сообщается о микробном пейзаже и бактериальных ассоциациях на фоне инвазии кишечными паразитами Trichocephalus trichiurus и Strongyloides sp. у низших приматов, содержащихся в условиях неволи.

Цель исследования – изучение структуры микробиоты кишечника обезьян, больных кишечными заболеваниями и погибших в результате желудочно-кишечной патологии на фоне гельминтозной инвазии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования явились 2386 обезьян 6 видов обоего пола в возрасте от 10 сут до 35 лет, содержащихся в питомнике. Из них 409 обезьян были больны кишечными заболеваниями и 1977 – погибшие (табл. 1, 2).

Материалом для исследования служили фекалии, взятые ректальным мазком у живых обезьян, у погибших животных – содержимое из трех отделов кишечника (тонкой, слепой, прямой кишки).

Бактериологические, биохимические и микроскопические исследования проводили общепринятыми на практике методами¹. Материал брали стерильно и доставляли в лабораторию, где осуществляли первоначальный посев на диагностические питательные среды: Эндо, Плоскирева, 5%-й кровяной агар, желточно-солевой агар, иерсиния-агар, хромогенный кандида-агар. Посевы культивировали в термостате при температуре 37 °С в течение суток, чашки с иерсиниозной средой – при 28 °С в течение 48 ч, чашки с кандида-агаром – при 24 °С в течение 48 ч. Выделение чистых культур и дальнейшую идентификацию проводили по общепринятым стандартам: изучение морфологических и тинкториальных свойств (окраска мазков по Граму), гемолитической и лецитиназной активности, исследование биохимических свойств. Для установления вида энтеробактерий также использовали бактериологический анализатор VITEK® 2 Compact (bioMérieux, Франция). Для определения сероваров выделенных штаммов Shigella, Salmonella, Yersinia применяли метод агглютинации на стекле с типовыми сыворотками.

Паразитологические исследования. Для установления паразитарной инвазии использовали общепринятый метод микроскопии нативных препаратов из фекалий². Для выявления яиц гельминтов небольшое количество фекалий из разных мест исследуемой порции растирали на предметном стекле в капле 50%-го раствора глицерина до получения равномерного прозрачного мазка, накрывали покровным стеклом и микроскопировали при увеличении 10 × 10 и 10 × 40. Экстенсивность гельминтозной инвазии определяли по числу инвазированных животных по отношению к общему числу обследованных.

При изучении постмортального материала использовали как микроскопию нативных препаратов, так и макроскопический метод исследования содержимого толстого кишечника, в результате которого обнаруживали половозрелые особи гельминтов.

Статистическую обработку и подсчет данных осуществляли при помощи программы GraphPad Prism 8. Для оценки достоверности различий по частоте обнаружения гельминтов и бактерий у разных видов обезьян в отдельных группах обследований использовали критерий согласия χ². Все различия интерпретировали как достоверные при р < 0,05. Для установления изменений частотных показателей в зависимости от года исследования применяли тренд-тест на основе критерия χ². Для определения статистической значимости между экстенсивностью гельминтозной инвазии и видом обезьян использовали точный тест Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В период с января 2017 по декабрь 2022 г. было обследовано 1977 погибших обезьян, у 1196 (60,5%) из которых при патолого-анатомическом исследовании установлены поражения желудочно-кишечного тракта – ЖКТ (табл. 3).

Желудочно-кишечные заболевания часто сопровождались пневмонией, признаками истощения, эксикоза, дистрофией внутренних органов. Анализ динамики гибели животных в течение 6 лет показал, что процент желудочно-кишечных заболеваний из года в год держится примерно на одном уровне. Как видно из таблицы 4, в 2022 г. наблюдалась тенденция к незначительному снижению числа обезьян, погибших от заболеваний ЖКТ.

Патолого-анатомические исследования погибших с желудочно-кишечными патологиями обезьян показали, что в 35,3% случаев имелось поражение ЖКТ в виде энтероколита (n = 422), в 62,5% – гастроэнтероколита (n = 748), в 0,6% – гастрита (n = 7). Также в 0,6% случаев заболевания кишечника были связаны с инфекционной патологией: иерсиниозом (n = 4), псевдотуберкулезом (n = 3); у 1,0% обезьян отмечены злокачественные новообразования: аденокарцинома желудка (n = 3), аденокарцинома кишечника (n = 9). Согласно полученным данным, в структуре заболеваний ЖКТ доминировали хронические атрофические гастроэнтероколиты в стадии обострения (53,9%), а также хронические формы энтероколитов. При поражении желудка у обезьян встречались только хронические атрофические гастриты (табл. 5).

В результате паразитологических исследований у 22,0% больных и 30,2% погибших обезьян выявлена гельминтозная инвазия (табл. 6). Были обнаружены два вида кишечных паразитов – Trichocephalus trichiurus и Strongyloides sp. Частота обнаружения Trichocephalus trichiurus составила 93,3% у больных (n = 84) и 99,7% у погибших (n = 360) обезьян. Strongyloides sp. выявлены у 11 (12,2%) больных и 12 (3,3%) погибших животных. Установлено, что Strongyloides sp. в виде моноинвазии обнаружены у 6 (6,7%) больных и 1 (0,3%) погибшей обезьяны, в остальных случаях гельминты находились в полиинвазиях.

Как показано в таблице 6, у больных кишечными заболеваниями макаков яванских частота обнаружения гельминтов выше, чем у погибших. Trichocephalus trichiurus у павианов анубисов несколько чаще выявляли в кишечнике погибших животных. Частота заражения данными паразитами у больных и погибших макаков-резусов была практически одинакова. Такая же ситуация наблюдается и у павианов гамадрилов. За шестилетний период обследовано небольшое количество макаков лапундеров и мартышек зеленых, однако из полученных данных видно, что у больных животных этих видов гельминты выявлялись чаще, чем у погибших. Отмечено, что Strongyloides sp. обнаружены только у трех видов: макаков-резусов, мартышек зеленых и павианов гамадрилов. Таким образом, результаты работы показали, что Trichocephalus trichiurus часто заражают низших приматов, а это совпадает с данными зарубежных исследований [26][27][28].

За 2017–2022 гг. в результате бактериологических исследований фекалий больных и кишечного содержимого погибших обезьян было обнаружено 1468 микроорганизмов, при этом выделенная микрофлора характеризовалась видовым разнообразием. Из фекалий больных обезьян изолировали 242 микроорганизма. Доля грамотрицательной микрофлоры составила 80,6% (n = 195), грамположительной – 18,6% (n = 45), дрожжеподобных грибов – 0,8% (n = 2). У 43,5% больных животных были обнаружены представители семейства Enterobacteriaceae, при этом патогенные энтеробактерии выделены у 1,9% обезьян (n = 8), условно-патогенные – у 41,6% (n = 170). Кокковая микрофлора, выявленная у 9,1% животных, включала Staphylococcus spp. (6,6%), гемолитические Enterococcus spp. (2,2%), грамположительные диплококки (0,3%). У погибших обезьян выделено 1226 микроорганизмов, из которых к грамотрицательной микрофлоре принадлежало 95,4% (n = 1170), к грамположительной – 2,8% (n = 34), доля дрожжеподобных грибов составила 1,8% (n = 22). У 96,0% погибших животных в структуре изолированной микрофлоры преобладали энтеробактерии (n = 1148), из которых доля патогенных составила 7,2% (n = 83), а условно-патогенных – 92,8% (n = 1065). Грамположительные кокки обнаружены в кишечнике у 1,5% погибших обезьян (n = 18), при этом у 0,7% животных выявлены Staphylococcus spp., у 0,3% – гемолитические Enterococcus spp., у 0,5% – грамположительные диплококки. У 282 погибших и 220 больных обезьян патогенная и условно-патогенная микрофлора не обнаружена (23,6 и 53,8% соответственно). При бактериологическом посеве образцов от 3 больных обезьян рост на питательных средах отсутствовал (0,7%).

Как показали исследования, из кишечной микрофлоры доминировали представители рода Proteus, однако у погибших животных они обнаруживались в 3 раза чаще, чем у больных (55,0 и 16,4% соответственно).

У больных животных чаще выделяли Klebsiella spp., Staphylococcus spp., гемолитические Enterococcus spp., Enterobacter spp., Pseudomonas aeruginosa. У погибших с заболеваниями ЖКТ чаще обнаруживали Providencia spp., Enterobacter spp., Shigella flexneri, Morganella morganii, Klebsiella spp., Citrobacter spp. (рис. 1).

Анализ состава бактериальной микрофлоры кишечника обезьян показал (рис. 2), что у неинвазированных гельминтами животных с наибольшей частотой обнаружены Klebsiella spp. (7,8% – у больных, 5,5% – у погибших) и Enterobacter spp. (5,0% – у больных, 7,6% – у погибших). В то же время у больных обезьян без паразитарной инвазии чаще выделяли Staphylococcus spp. (6,9%), гемолитические Escherichia coli (6,0%), Pseudomonas aeruginosa (4,4%), а у погибших – Providencia spp. (5,6%), Citrobacter spp. (5,2%), Morganella morganii (4,4%). При гельминтозной инвазии у больных обезьян чаще обнаруживали Staphylococcus spp. (5,6%), Klebsiella spp. (4,5%), Bacillus spp. (4,5%), а у погибших – Providencia spp. (16,9%), Morganella morganii (6,7%).

Отмечено, что у инвазированных гельминтами больных животных патогенные энтеробактерии не обнаружены, в то время как у обезьян без инвазии Shigella flexneri выделены в 2,5% случаев (n = 8). У погибших обезьян, не имеющих гельминтозной инвазии, частота обнаружения патогенных энтеробактерий (Shigella flexneri, Salmonella редких групп, Yersinia spp.) в 2 раза выше, чем у инвазированных животных – 8,3% (n = 69) и 3,9% (n = 14) соответственно. Вследствие этого предполагаем, что присутствие кишечных гельминтов может уменьшать количество бактериальных патогенов, занимая их нишу в кишечном биоценозе.

При анализе частоты выделения бактерий кишечной микрофлоры в динамике за 6 лет установлен ежегодный стабильно высокий процент обнаружения Proteus spp. (табл. 7).

Мониторинг выделения патогенных и условно-патогенных бактерий у обезьян в течение 2017–2022 гг. показал снижение частоты обнаружения Klebsiella spp., Morganella morganii, Shigella spp., Pseudomonas spp., гемолитических Enterococcus spp. и возрастание частоты выделения гемолитических Escherichia coli, Enterobacter spp., Providencia spp., Serratia spp., Yersinia spp., дрожжеподобных грибов рода Candida. Возможно, снижение частоты выявления Klebsiella spp. и Shigella flexneri связано с применением в лечении животных клебсиеллезного фага и интестифага. Наибольший процент обнаружения Citrobacter spp., Klebsiella spp., Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus spp., Bacillus spp., по сравнению с другими годами, зафиксирован в 2019 г.

Микроорганизмы были выделены как в моноинфекциях, так и в ассоциациях. Чаще выявляли сочетания представителей нормофлоры с Proteus spp. Так, у больных обезьян, инвазированных гельминтами, ассоциации Escherichia coli + Proteus spp. наблюдали в 10,0% случаев, Escherichia coli + Enterococcus + Proteus spp. – в 4,5%, Escherichia coli + Enterobacter spp. + Staphylococcus spp. – в 2,2%. Также наибольший процент случаев одновременного выявления Escherichia coli + Proteus spp. установлен и у больных неинвазированных гельминтами обезьян (9,4%). У 4,1% животных отмечены сочетания Escherichia coli + Enterococcus spp. + Proteus spp.; бактериальные ассоциации нормофлоры в составе Escherichia coli + Enterococcus spp. + Klebsiella spp. и Escherichia coli + Enterococcus spp. + Staphylococcus spp. обнаружены у 3,5% обезьян. Сочетания гемолитических Escherichia coli с Enterococcus spp. наблюдали в 2,5%, нормофлоры с Enterobacter spp. – в 2,2% случаев. У 1,9% обследованных больных обезьян обнаружены ассоциации Escherichia coli + Serratia spp., Escherichia coli + Klebsiella spp., Escherichia coli + Enterococcus spp. + Pseudomonas aeruginosa. Остальные варианты микробных ассоциаций выявлены в единичных случаях.

У погибших обезьян бактериальные ассоциации были более разнообразны. Так, двухкомпонентные ассоциации обнаружены в 53,0% случаев, трехкомпонентные – в 36,7%, четырехкомпонентные – в 6,7%, пятикомпонентные – в 2,5% и шестикомпонентные – в 0,3% случаев. Так же как и у больных, у погибших обезьян наиболее часто выявляли Proteus spp. одновременно с нормофлорой (39%). Сочетания, включающие нормофлору с другими условно-патогенными бактериями, встречались гораздо реже. Так, Escherichia coli и Enterococcus spp. в 3,5% случаев высевались с Providencia spp., в 2,9% – с Enterobacter spp., в 2,4% – с Shigella flexneri, в 2,0% – с Citrobacter spp., в 1,8% – с Morganella morganii, в 1,3% – с Klebsiella spp. Из кишечника погибших животных в единичных случаях Proteus spp. выделялся с Citrobacter spp., Enterobacter spp., Yersinia spp. при отсутствии нормофлоры. Доля одновременного обнаружения Proteus spp. + Enterococcus spp. составила 1,0%.

Ассоциации дрожжеподобных грибов рода Candida в кишечнике погибших обезьян с одним представителем условно-патогенной микрофлоры выявляли чаще, чем с двумя (13 и 4 случая соответственно). Частота встречаемости Candida spp. в ассоциации с Proteus spp. (у 11 обезьян) была выше, чем с Klebsiella spp. (у 3 особей) и Pseudomonas aeruginosa (у 2 животных). Таким образом, сочетания патогенных и условно-патогенных бактерий с дрожжеподобными грибами у инвазированных гельминтами обезьян могут утяжелять течение желудочно-кишечных заболеваний вследствие одновременного включения в развитие инфекционного процесса факторов патогенности различных микроорганизмов и паразитов.

Что касается видового состава микрофлоры, то у обезьян были выделены следующие виды энтеробактерий: Citrobacter freundii, C. diversus, C. amalonaticus, Enterobacter aerogenes, E. agglomerans, E. cloacae, E. gergoviae, Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, K. ozaenae, Proteus vulgaris, Pr. mirabilis, Pr. penneri, Providencia stuartii, P. rettgeri, P. alcalifaciens, Serratia marcescens, S. odorifera; энтерококков: Enterococcus faecalis, E. faecium; стафилококков: Staphylococcus aureus, S. haemolyticus; дрожжеподобных грибов: Candida krusei, C. glabrata, C. tropicalis.

В заключение можно отметить, что в развитии заболеваний ЖКТ у обезьян важную роль также играет снижение иммунитета организма под воздействием различных внешних факторов, в том числе стресса, вследствие несоблюдения ветеринарно-санитарных, зоотехнических и зоогигиенических правил кормления и содержания обезьян, что приводит к нарушению состава нормальной и активации условно-патогенной кишечной микрофлоры. Таким образом, желудочно-кишечные заболевания гельминто-бактериальной этиологии у обезьян требуют комплексной терапии. При содержании обезьян в условиях неволи вследствие контакта человека с животным имеется риск передачи паразитов и патогенных микроорганизмов обслуживающему персоналу. Обнаруженные нами Trichocephalus trichiurus и Strongyloides sp. опасны для человека, поэтому необходимо выполнять требования безопасности при работе с больными обезьянами (проводить регулярно дегельминтизацию животных, ежедневно чистить клетки и вольеры и, конечно, соблюдать правила личной гигиены). Знания о паразитарных и бактериальных возбудителях спонтанной кишечной инфекции обезьян необходимы для правильного и безопасного разведения и содержания этих редких животных в условиях неволи и для практического использования обезьян в биомедицинских исследованиях.

ВЫВОДЫ

По результатам проведенного исследования сделаны следующие выводы:

1. Trichocephalustrichiurus распространены среди низших приматов, содержащихся в питомнике.
2. В этиологии желудочно-кишечных заболеваний у обезьян участвуют различные ассоциации бактерий, имеющие разнообразный состав, но в основном это представители семейства Enterobacteriaceae.
3. Доминирующим микроорганизмом являлся Proteusspp., выделенный у больных желудочно-кишечными заболеваниями обезьян в 16,4%, у погибших – в 55,0% случаев.
4. Процент выявления патогенных энтеробактерий низкий (у больных обезьян – 1,9%, у погибших – 7,2%), но среди них лидирует Shigellaflexneri.
5. У неинвазированных гельминтами обезьян частота обнаружения патогенных энтеробактерий выше, чем у инвазированных.
6. Ассоциативные желудочно-кишечные заболевания у обезьян гельминто-бактериальной этиологии требуют комплексной терапии животных.
7. При содержании обезьян в условиях неволи при контакте человека с животным имеется риск передачи паразитов и патогенных микроорганизмов обслуживающему персоналу.