Усовершенствование системы поддержания производственного штамма Burkholderia mallei 5584 (Маster seed), применяемого для изготовления сапных диагностикумов

ВВЕДЕНИЕ

Эпизоотическое благополучие по заразным и особо опасным инфекционным болезням, в частности по сапу, обеспечивается ветеринарной службой, которая проводит противоэпизоотические мероприятия, направленные на предупреждение заноса возбудителя на территорию Российской Федерации, посредством систематического контроля за благополучием поголовья лошадей (ослов, мулов), а также недопущения распространения заболевания и его ликвидации в случае появления [1].

Сап – это инфекционная болезнь непарнокопытных животных семейства лошадиных, вызываемая микробом, относящимся к роду Burkholderia, виду mallei, и протекающая в основном в хронической форме. В естественных условиях могут заражаться и хищники семейства кошачьих (при поедании мяса больных сапом животных), а также верблюды и человек [2-5]. Данный возбудитель относится к II группе патогенности (опасности), против сапа не разработаны средства специфической профилактики и лечения, в связи с чем заболевание занимает особое место в вопросах биологической безопасности Российской Федерации [6-7]. С конца 50-х годов прошлого столетия и до настоящего времени сап не регистрировался на территории России. Хотя в течение этого времени возникали случаи заболевания с подозрением на сап, но ни один из них не был подтвержден [8]. На сегодняшний день вспышка сапа зарегистрирована в Забайкальском крае с введением карантина по заболеванию (постановление губернатора Забайкальского края от 18.02.2023 № 8¹). Не исключена опасность возникновения новых случаев сапа в связи с неблагополучием по данному заболеванию государств, граничащих с территорией России (Монголия и Китай), где часто не соблюдаются требования ветеринарного законодательства, в частности имеются факты несанкционированного обмена/перемещения скота и импортируемого животноводческого сырья [1][9]. Кроме того, непредсказуемую эпизоотическую ситуацию по этому заболеванию могут создавать современные международные контакты, где задействованы животные, восприимчивые к сапу (торговля, гастроли цирков и театра зверей, конноспортивные соревнования, международные аукционы и др.).

В настоящее время сап часто регистрируется в Монголии, Турции, Иране, Ираке, странах Аравийского полуострова, Бразилии, Китае, Индии, на Филиппинах [9-14]. По данным Всемирной организации здравоохранения животных, Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН, Всемирной организации здравоохранения, в мире отмечается тенденция к увеличению случаев возникновения сапа у человека и животных, что относит его к возвращающимся инфекциям.

Для недопущения возникновения, завоза и проникновения этого заболевания в страну проводятся диагностические мероприятия с использованием сапных диагностикумов, выпускаемых ФГУП «Курская биофабрика – фирма «БИОК» (сыворотка сапная положительная для реакции связывания комплемента – РСК; антиген сапной для РСК; маллеин и антиген сапной цветной для пластинчатой реакции агглютинации – РА) из производственного штамма Burkholderia mallei 5584. Его получают один раз в 5 лет из Государственной коллекции штаммов – возбудителей особо опасных болезней, используемых в ветеринарии и животноводстве, которая занимается хранением штамма в нативном и лиофилизированном виде и поддержанием его биологических свойств. Полученные рядом авторов результаты показали, что хранение микроорганизмов в нативном виде не соответствует современным требованиям, так как в процессе многократных пересевов накапливаются мутации, которые приводят к изменению их изначальных биологических свойств [15-18]. Ввиду того что одним из направлений коллекционной деятельности является оптимизация существующих методов и разработка новых технологий консервации штаммов микроорганизмов, актуально проведение работ по усовершенствованию ранее разработанных методик сохранения аутентичности штаммов [19-22].

Исходя из вышесказанного, целью работы было усовершенствовать систему поддержания производственного штамма Burkholderia mallei 5584 (Маsterseed), используемую для сохранения его жизнеспособности и биологических свойств.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работу по поддержанию производственного штамма Burkholderia mallei 5584 (Маsterseed) проводили в отделе «Государственная коллекция микроорганизмов» ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

Штамм хранится в нативном виде на мясо-пептонном глицериновом агаре (МПГА) и пересевается каждые 30 дней с проверкой биологических свойств один раз в год и в лиофилизированном виде (криопротектор – обезжиренное молоко) с определением его жизнеспособности и аутентичности заявленным паспортным данным каждые 5 лет и пассажем через организм чувствительных моделей (золотистых хомячков) один раз в год.

Ростовые свойства и морфологию клеток штамма, хранящегося в нативном и лиофилизированном виде, изучали на культурах второй генерации, выросших после посева на МПГА, мясо-пептонном глицериновом бульоне (МПГБ) и картофельной среде Павловского. Изучение тинкториальных свойств проводили микроскопией мазков, окрашенных по Граму; подвижность определяли методом висячей капли с помощью световой микроскопии. Ферментативные свойства изучали путем посева на среды Гисса и обезжиренное молоко, а также по образованию сероводорода на МПГА и индола на среде Строгова, засеянных культурой, с использованием индикаторных бумажек (в первом случае пропитанной ацетатом свинца, во втором – щавелевой кислотой), прикрепленных пробкой над поверхностью среды. Тест на наличие каталазы проводили нанесением 3%-го раствора перекиси водорода на поверхность выросшей культуры².

Патогенность штамма определяли заражением чувствительных лабораторных животных (золотистых хомячков) с последующей оценкой развития характерных клинических признаков сапа, патолого-анатомической картины поражения легких, печени, селезенки и выделением чистой культуры возбудителя.

С целью изучения агглютинабельных свойств из штамма Burkholderia mallei 5584 (Маster seed) изготавливали антиген и сыворотку к нему, которые испытывали в пластинчатой РА. Сыворотку получали путем трехкратной гипериммунизации кроликов инактивированными клетками штамма Burkholderia mallei 5584 (Маster seed) в концентрации 2 × 10⁹ м. к./см3 инъекцией в краевую ушную вену с интервалом в три дня: первое введение – 0,5 см3, второе введение – 1,0 см3, третье введение – 2,0 см3. Тотальное обескровливание кроликов проводили на 7-й день после последнего введения антигена.

Сыворотку исследовали по антигенным свойствам (в пластинчатой и пробирочной РА и пробирочной РСК).

Для определения специфичности брали близкородственные в антигенном отношении штаммы возбудителей мелиоидоза и Alcaligenes faecalis [23]. Для этого осуществляли посев на МПГА и мясо-пептонный агар (МПА), инкубировали при 37 °С в течение 48 ч, смывали 0,85%-м раствором NaCl и использовали для постановки РА и РСК в соответствии с СанПиН 3.3686-21³.

Поддержание биологических свойств производственного штамма в соответствии с заявленными паспортными данными осуществляли посредством пассажей на золотистых хомячках, которых заражали подкожно в область затылка.

Вся экспериментальная часть работы с лабораторными животными проводилась в соответствии с основными этическими принципами проведения экспериментов на животных, изложенных в «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Страсбург, 18 марта 1986 г.). Эксперименты были научно обоснованы и утверждены Комиссией по биоэтике ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (протокол № 10 от 11.09.2023).

Для получения антигена производственный штамм Burkholderia mallei 5584 (Маster seed) инактивировали гамма-лучами на установке «Исследователь» (Россия) по ранее определенной дозе облучения 30 кГр в отделе радиобиологии⁴.

При отработке режима инактивации применяли дозы 15, 20, 25, 30, 35 кГр. Для этого готовили клеточные взвеси с концентрацией 109 м. к./см3 на стерильном 0,85%-м растворе NaCl. Полноту инактивации определяли посевом клеток на питательную среду (МПГА и МПГБ) с последующим инкубированием в течение 10 дней при температуре 37 °С.

Режим лиофилизации штамма отрабатывали на лиофильной установке LZ-9 (Frigera, Чехия). В качестве криопротекторных сред применяли обезжиренное молоко и сахарозо-желатиновую среду.

В данной работе использовалась система поддержания производственного штамма Burkholderia mallei 5584 (Маster seed) [22], которая была дополнена новыми этапами, отвечающими современным требованиям хранения коллекционных штаммов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для повышения качества и стандартности производственных, референтных и вакцинных штаммов необходимо тщательное изучение стабильности их биологических свойств с характерными для возбудителя генетически закрепленными признаками: морфологическими, биохимическими, антигенными и другими [17][24][25]. Работа по определению жизнеспособности и изучению биологических свойств производственного штамма Burkholderia mallei 5584 (Маster seed) была проведена с использованием разработанной ранее и дополненной нами системы поддержания данного штамма возбудителя сапа, применяемого для изготовления диагностикумов, в соответствии с современными требованиями к хранению микроорганизмов [8, 22, 26].

Полученные результаты исследований показали, что штамм на МПГА давал рост в виде полупрозрачных гладких колоний с перламутровым оттенком, сливающихся на 3–5-е сут после посева в сплошной налет на поверхности среды (рис. 1А). Культура бактерий на МПГБ на 3–5-е сут вызывала помутнение среды, на ее поверхности образовывалась нежная пленка и пристеночное кольцо (рис. 1В), а также наблюдался вязкий осадок, поднимающийся со дна пробирки штопором и разбивающийся при встряхивании.

На картофельной среде Павловского 2-суточная культура росла в виде медообразного налета яркожелтого цвета (рис. 2А), 5-суточная культура – в виде слизистого налета с более темной окраской (рис. 2В).

В препарате «висячая капля» клетки были неподвижны, но наблюдали броуновское движение. Мазок штамма Burkholderia mallei 5584 (Маster seed), приготовленный из 2-суточной культуры и окрашенный по Граму, при микроскопии в иммерсионной системе представлял собой зернистые палочки с закругленными концами. Бактерии – грамотрицательные, окрашивались в розовый цвет, вызывали свертывание молока без дальнейшей пептонизации (рис. 3А). При росте в бульоне наблюдали изменение цвета индикаторной бумажной полоски, что указывало на образование бактериями сероводорода (рис. 3В). Не разжижали 12%-й желатин (рис. 3С), не образовывали индол (цвет индикатора не изменялся) и каталазу.

Культура штамма Burkholderia mallei 5584 (Маster seed) не вызывала изменения окраски сред Гисса на желтый цвет и образования пузырьков газа в поплавках, так как не ферментировала сахара.

Для безопасной работы с возбудителями I–II групп патогенности (опасности), в частности при получении антигенов и гипериммунных сывороток к ним, проводят их инактивацию различными методами (физическими, механическими, химическими и др.). Предыдущая схема поддержания штамма включала инактивацию клеток автоклавированием при температуре 120 °С в течение 15 мин, что приводило к полному их разрушению. Поэтому был проведен подбор дозы гамма-облучения для штамма Burkholderia mallei 5584 (Маster seed), результаты которого приведены в таблице 1.

Установлено, что облучение в дозе 30 и 35 кГр полностью инактивировало штамм, поэтому в дальнейшей работе использовалась доза 30 кГр.

Проверка агглютинабельных свойств сапной сыворотки, полученной на гамма-облученный антиген, в РА на стекле показала положительную реакцию в виде мелкозернистого агглютината, образовавшегося в течение 1–2 мин.

Патогенность штамма определяли заражением золотистых хомячков путем введения 2-суточной культуры, выращенной на МПГА при температуре 37 °С в течение 48 ч, смытой физиологическим раствором в дозе 1 × 10⁹ м. к./см3 подкожно в область затылка, что вызывало гибель животных на 5–10-е сут. При вскрытии наблюдали следующую патолого-анатомическую картину, характерную для данного возбудителя: на месте введения имелась гнойно-некротическая язва, множественные некротические узелки диаметром 2–3 мм во внутренних органах (печени, селезенке, легких). Из посевов, сделанных из внутренних органов, крови из сердца и места введения, выделена чистая культура возбудителя сапа.

Проверка антигенных свойств штамма Burkholderia mallei 5584 (Маster seed) с сывороткой, полученной на его введение лабораторным животным, показала, что в пробирочной РА титр составил 1:1600, в РСК – 1:320, в пластинчатой РА – 1:120.

Полученная сыворотка дает перекрестные реакции в РА и РСК со штаммами возбудителей мелиоидоза – 1:1600 и Alcaligenesfaecalis – 1:40.

В целях сохранения чистоты уникальных производственных и эталонных штаммов микроорганизмов проводят их пассирование через организм чувствительных лабораторных животных [15][27-29]. В связи с этим для поддержания биологических свойств производственного штамма Burkholderia mallei 5584 (Маster seed) согласно паспортным данным осуществлено его пассирование на золотистых хомячках. При этом была выделена чистая культура штамма, которую проверили на аутентичность и заложили на дальнейшее хранение в нативном виде, с последующими пересевами на МПГА каждые 30 дней.

Предыдущая система поддержания штамма Burkholderia mallei 5584 (Маster seed) предусматривала его хранение в нативном виде, что способствовало накоплению генетических мутаций и, как следствие, изменению свойств бактериальной клетки [22]. Так как первостепенной задачей коллекций микроорганизмов является сохранение штаммов в неизменном состоянии в течение длительного времени, внесли в систему этап лиофилизации, которую проводили по следующему режиму:

• замораживание культуры в течение 12 ч;
• перенос культуры в морозильную установку, охлаждение плиты до –52 °C;
• включение вакуума;
• лиофилизация в автоматическом режиме в течение 12 ч;
• включение обогрева (р) через 17 ч с момента загрузки культуры при следующих параметрах: температура плиты +10 °C, температура среды 0 °C;
• включение обогрева (р + 1) через 18 ч при следующих параметрах: температура плиты +20 °C, температура среды +5 °C, вакуум 0,5 trr;
• окончание сушки через 24 ч: температура плиты +32 °C, температура среды +25 °C, вакуум 0,05 trr.

После сушки бактерии проверяли на жизнеспособность и сохранность аутентичности заявленным паспортным данным, затем закладывали на хранение в лиофилизированном виде при температуре +4 °C и через 5 лет определяли жизнеспособность и сохранность биологических свойств [30].

Параллельно поддерживали культуру штамма в нативном виде с пересевами через 28–30 дней на МПГА и сравнительной проверкой биологических свойств один раз в год.

В результате проведенной работы по хранению штамма Burkholderia mallei 5584 (Маsterseed) в течение 5 лет с использованием усовершенствованной системы его поддержания было установлено, что он сохраняет свою жизнеспособность, при этом исключается утрата или изменение его морфологических, биохимических, серологических и вирулентных свойств.

Таким образом, усовершенствованная система поддержания производственного штамма Burkholderia mallei 5584 (Маster seed) включает этапы, представленные в таблице 2.

Применение метода лиофилизации позволило увеличить сроки хранения штамма Burkholderia mallei 5584 (Маster seed) и обеспечить стабильность его биологических свойств в течение всего срока хранения.

Кроме того, сублимационная сушка позволила проводить пассаж штамма на чувствительных лабораторных животных один раз в 5 лет, что более выгодно и безопасно с экономической и биологической точек зрения.

Вся работа, проводимая со штаммами возбудителей I–II групп патогенности (опасности), представляет собой угрозу потенциального выделения патогенного биологического агента в воздух производственной зоны, среду обитания человека и заражения персонала. Для этого должны быть разработаны надежные методы их инактивации. В нашем случае был применен метод гамма-облучения. При этом определили оптимальную дозу, составившую 30 кГр, которая позволила надежно инактивировать штамм и сохранить структурную целостность бактериальных клеток, являющихся антигеном для получения гипериммунных сывороток и постановки серологических реакций.

Таким образом, усовершенствованная система поддержания штамма Burkholderia mallei 5584 (Маsterseed) отвечает современным требованиям, предъявляемым к хранению коллекционного фонда возбудителей особо опасных болезней в течение длительного времени.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной работы была усовершенствована система поддержания производственного штамма Burkholderia mallei 5584 (Маster seed), обеспечивающая сохранение его биологических свойств, необходимых для производства качественных сапных диагностикумов, используемых при проведении ежегодных диагностических исследований для своевременного выявления больных животных.