Исследование методом проточной цитометрии динамики трансформации ДНК в культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH при репродукции вируса бешенства

ВВЕДЕНИЕ

Бешенство – остро протекающая болезнь теплокровных животных, характеризующаяся поражением центральной нервной системы. К заболеванию восприимчивы домашние и дикие животные всех видов, а также человек [1, 2, 3, 4, 5].

Цикл репродукции вируса включает его адсорбцию на поверхности клеток, проникновение в клетку, раздевание, транскрипцию, трансляцию, репликацию, сборку и почкование.

Для первичной транскрипции нет необходимости в синтезе структурных белков. Для вируса бешенства присущи 2 типа транскрипции: 1) с геномной РНК сначала транскрибируется лидерная РНК, затем последовательно 5 моноцистронных мРНК, с которых в цитоплазме транслируются белки N, P, M, L, а мРНК G-гена транслируется в полисомах, связанных с мембраной комплекса Гольджи; 2) транскрипция с геномной РНК антигеномных (позитивно-полярных) РНК, которые служат матрицами для синтеза новых генераций геномных РНК отрицательной полярности. В отличие от первичной транскрипции, репликация геномной РНК по описанному механизму может происходить только одновременно с трансляцией и синтезом структурных белков, в особенности N и Р, необходимых для инкапсидации РНК в нуклеокапсидные структуры. Если белки L, N и P контролируют главным образом транскрипцию и репликацию РНК, то М-белок занимает промежуточное положение между нуклеокапсидом и оболочкой вириона, участвуя в конденсации РНК. Кроме того, М-белок играет ключевую роль в регуляции синтеза РНК и почковании вируса [6, 7]. На финальной стадии сборки и почкования нуклеокапсиды «надевают» вирусную оболочку, представленную G-белком, который интегрирован в клеточную мембрану. Гликопротеин детерминирует нейровирулентность и нейроинвазивность вируса бешенства.

Место формирования вирусных частиц зависит от вируса и клеток хозяина. Для представителей рода Lyssavirus семейства Rhabdoviridae, к которому относится вирус бешенства, синтез и сборка нуклеокапсидов происходят в цитоплазме, а почкование – через плазматическую мембрану клетки, от которой вирион получает дополнительный липидный слой.

Вирус бешенства не вызывает в клетках характерные цитопатические изменения. Все события транскрипции и репликации происходят в цитоплазме внутри телец Бабеша – Негри. Данные структуры являются типичными при бешенстве и, таким образом, могут быть использованы в качестве патогномического симптома наличия инфекции [8].

Проточная цитометрия – это современная технология, обеспечивающая быстрый, качественный и мультипараметрический анализ клеток, которая получила широкое распространение в таких областях медицины, как иммунология, фармакология, цитология, онкология, гематология, генетика, инфектология [9-15].

Методом проточной цитометрии можно получить самые разные данные: определить содержание в клетке ДНК и РНК, суммарное количество белков и количество специфических белков, узнаваемых моноклональными антителами; исследовать клеточный метаболизм; изучить транспортировку ионов кальция и кинетику ферментативных реакций [15-20].

У каждой клетки есть период существования от момента ее образования путем деления материнской клетки до митоза или гибели, получивший название клеточного цикла. Он состоит из двух периодов: 1) период клеточного роста (интерфаза); 2) период клеточного деления – М-фаза (от греч. mitos – нить). В свою очередь, в каждом периоде выделяют несколько фаз. Обычно интерфаза занимает не меньше 90% времени всего клеточного цикла. Большая часть компонентов клетки синтезируется на протяжении всей интерфазы, это затрудняет выделение в ней отдельных стадий.

Интерфаза подразделяется на подфазы G1, S и G2. Период интерфазы, когда происходит репликация ДНК клеточного ядра, был назван «фаза S» (от греч. synthesis – синтез). Нужно отметить, что в интерфазе (в основном в фазе S) наблюдается не только репликация ДНК, но и основной биосинтез структурных и функциональных белков клетки. Период между фазой М и началом фазы S обозначен как фаза G1 (от англ. gap – промежуток), а период между концом фазы S и последующей фазой М – как фаза G2 [21].

Благодаря использованию в исследованиях проточных цитометров определены важные данные, касающиеся принадлежности клеток к фазам репродуктивного цикла, а также получены результаты, позволяющие оценить продолжительность и доминирование соответствующих фаз клеточного цикла G1, S, G2 + M на разных этапах культивирования [18-23]. С учетом вышеизложенного можно сделать вывод, что характер изменений клеточного цикла при репликации в клетке вируса является важным для понимания процесса его репродукции, но малоизученным фактом.

Целью работы было изучение методом проточной цитометрии динамики трансформации ДНК в культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH при репродукции вируса бешенства.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточная линия. В работе использовали суспензионную перевиваемую культуру клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH [24]. Клетки выращивали согласно «Промышленному регламенту на производство вакцины против ящура различных типов», утвержденному директором ФГБУ «ВНИИЗЖ», в культиваторах металлических с рабочим объемом до 1800 дм³.

Вирус бешенства. Для заражения клеток применяли производственный штамм «ВНИИЗЖ» вируса бешенства.

Питательная среда для выращивания клеток. Использовали среду Игла с добавлением 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота фирмы Serana (Германия) и 0,25%-го гидролизата белков крови (Россия).

Культивирование вируса бешенства. Репродукцию вируса бешенства проводили на протяжении 48 ч во флаконах объемом 0,5 дм³, используя фильтры к флакону Minisart® RC25 Syringe Filters 17764-ACK Ø 25 mm (Sartorius, Германия).

Кратность прироста высчитывали как отношение конечной (через 48 ч) и исходной концентрации клеток в пределах одного пассажа.

Заражение клеток вирусом бешенства. Культуральный вирус бешенства инокулировали в суспензионную культуру клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH в дозе 0,1 ККИД₅₀/кл. Образцы с инфицированными клетками обозначали как опытные, не зараженные вирусом клетки служили контролем и культивировали в аналогичных условиях.

Определение стадий клеточного цикла осуществляли на проточном цитометре Accuri^TM С6 с помощью набора для работы с цитометром BD Cycletest^TM, а также набора реактивов для анализа количества ДНК в клетках С6 Flow Cytometer Fluid Kit (Becton Dickinson and Company, США).

Определение титра инфекционной активности вируса бешенства проводили согласно «Методическим рекомендациям по опосредованному определению титра инфекционной активности культурального вируса бешенства штамма «ВНИИЗЖ» в сырье для вакцины методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ)»¹.

Пробы отбирали каждые 3 ч в течение всего времени репродукции вируса бешенства. Концентрацию клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии определяли с помощью камеры Горяева для счета форменных элементов крови dА0.000.851, которая соответствует ТУ 64-1-816-84. К 1 см³ клеточной взвеси добавляли равный объем 0,2%-го раствора трипановой сини, тщательно перемешивали и заправляли камеру. Количество клеток в 1 см³ суспензии рассчитывали по формуле [21]:

где Х – количество клеток в 1 см³; А – общее количество клеток в камере; В – разведение суспензии.

Подсчет проводили при 10-кратном увеличении микроскопа.

Статистическая обработка данных. Цифровой материал статистически обрабатывали на персональном компьютере общепринятыми методами вариационной статистики с использованием программы Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Динамику репродукции вируса оценивали по следующим показателям:

– зависимость титра инфекционной активности вируса от времени репродукции;

– изменения апоптоза и дебриса;

– изменения стадий клеточного цикла (G1, S, G2 + M).

При культивировании водородный показатель (рН) суспензии контролировали каждые 3 ч.

На рисунке 1 отображена динамика уровня инфекционной активности вируса бешенства при репродукции в культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Отмечено, что титр инфекционной активности вируса увеличивался от (3,2 ± 0,2) lg ККИД₅₀/см³ при инокуляции до (7,63 ± 0,3) lg ККИД₅₀/см³ через 48 ч репродукции, но более интенсивно он рос первые 24 ч (до 6,76 ККИД₅₀/см³).

Концентрация клеток за 48 ч изменилась с 0,5 до 1,9 млн/см³, то есть выросла в 3,8 раза (рис. 2).

На следующем этапе были проведены опыты по исследованию изменения титра инфекционной активности вируса бешенства в клетках ВНК-21/SUSP/ARRIAH, имеющих разную исходную концентрацию: (0,77 ± 0,1); (3,0 ± 0,2) и (1,1 ± 0,1) млн/см³. Установлено, что накопление цельных вирусных частиц в зараженных клетках разных концентраций происходило в первые 12 ч репродукции (рис. 3). В дальнейшем в культуре с исходной концентрацией клеток (0,77 ± 0,1) млн/см³ вирус накапливался в 1,1–1,2 раза интенсивнее. Вероятно, это связано с ограниченным количеством питательных веществ для размножения и роста клеток с большей концентрацией.

Провели исследование, направленное на изучение изменений фаз клеточного цикла при культивировании вируса бешенства в клетках суспензионной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH. В стандартных оптимальных условиях интактные популяции распределяются по фазам клеточного цикла следующим образом: G1 – 30–75%, G2 + M – 2–18%, S – 2–33%, полиплоиды – до 4% и дебрис – 1–20% [23].

Отмечено, что динамика изменений популяции клеток, находящихся в апоптозе, в контроле и опыте была аналогичной в течение 36 ч культивирования (наблюдали небольшой временной сдвиг в 3 ч между опытом и контролем через 9 и 12 ч репродукции). После 36 ч культивирования инфицированных клеток в стадии апоптоза было на 28–42% больше по сравнению с таковыми в контроле (рис. 4).

Доля клеток, находящихся в стадии фазы G1, через 9 ч в опытных образцах увеличилась на 11,7%, а в контрольных, наоборот, уменьшилась на 16,6%. В дальнейшем количество клеток в G1-фазе и в контроле, и в опыте изменялось одинаково: через 15–18 ч отмечалось уменьшение на 40%, далее – ростовой скачок на 45–46%, затем опять снижение на 39–40%, после чего вновь наблюдалось увеличение. После 33 ч репродукции и до окончания культивирования доля инфицированных клеток, находящихся в фазе G1, была значительно больше (на 12–21%), чем контрольных.

При сравнении количества клеток, находящихся в апоптозе + дебрисе и фазе G1, установили некоторую синхронность между этими фазами: через 9 ч культивирования вируса фаза G1 увеличилась на 10–12%, в то же время уменьшился на 10–11% апоптоз, после чего пошло снижение процента клеток в фазе G1 и увеличение доли клеток в апоптозе и дебрисе. Более выраженную зеркальность данных фаз клеточного цикла наблюдали после 24 ч культивирования. Аналогичная закономерность была замечена и при исследовании клеточного цикла при репродукции вируса ящура [22].

В клеточном цикле интактной популяции ВНК-21/SUSP/ARRIAH также преобладала диплоидная фаза клеточного цикла (G1), во время которой начинался синтез мРНК, структурных белков, других клеточных компонентов. На эту фазу приходилось от 30 до 75% клеток в зависимости от условий культивирования, что отражено в более ранних исследованиях [23].

Известно, что в период G1-фазы клетки начинают увеличиваться в размерах, активируется мРНК и ферменты, необходимые для будущей репликации ДНК [21].

Клетки, находящиеся в фазе G1, в суспензионной культуре поддерживались на уровне 37–70% на протяжении всего времени репродукции вируса, то есть инфицированные вирусом клетки служили источником энергии и материалом для синтеза вирусных компонентов, а также для сборки цельных вирионов.

Переход от диплоидной фазы G1 в синтетическую (S-фазу) является одной из контрольных точек клеточного цикла. В зависимости от количества питательных веществ и энергии, а также от внешних факторов культивирования клетка «принимает решение» вступать в клеточный цикл или же перейти в неделящееся состояние покоя, известное как G0-фаза, которая переходит в апоптоз. Основным событием S-фазы является репликация ДНК, которая имеет свои особенности [21].

В наших исследованиях процент клеток в S-фазе в опыте и контроле в первые сутки репродукции вируса был одинаковым, при этом наблюдали резкое его увеличение в виде скачков через 15 и 24 ч в 3,4 и 2,4 раза соответственно (рис. 5). Через 24 ч между инфицированными и контрольными клетками начали проявляться различия, которые постепенно возрастали с 8 до 137% к окончанию репродукции. Можно предположить, что клетки, находящиеся в этой фазе, также участвовали в репродукции вируса.

В фазе G2 – последней из трех последовательных фаз интерфазной стадии клеточного цикла – и М-фазе образовывалась тетраплоидная популяция. В интактных и инфицированных вирусом бешенства клетках линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH на фазу подготовки к митозу и сам митоз приходилось от 2 до 20% всей популяции. Через 30 ч репродукции количество клеток опытных образцов в данных фазах начинало уменьшаться на 17–28% по сравнению с контрольными (рис. 6). Вероятно, это было связано с тем, что ингибировались общий биосинтез и функции клетки-хозяина в результате биосинтеза компонентов вируса бешенства, поэтому уменьшался процент клеток, находящихся в фазе G2 + M.

Количество полиплоидных клеток в опыте было примерно равным на протяжении 45 ч, только в последние часы репродукции вируса наблюдали их резкий скачок в 2,0–2,5 раза, в то время как в контрольных клетках плоидность популяции имела скачкообразный характер: увеличение через 9, 21, 42 и 48 ч в 2,06; 2,7; 1,56 и 3,18 раза соответственно. Можно предположить, что имелась частичная резистентность полиплоидных клеток к вирусу. Данный факт уже был отмечен раньше при исследовании репродукции ящура в клетках ВНК-21 [22].

ДНК-гистограммы клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH при репродукции в них вируса бешенства через 24 ч после начала заражения и через 42 ч культивирования (рис. 7) обобщают графики, представленные на рисунках 4–6.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследованы фазы клеточного цикла при репродукции в клетке-хозяине вируса бешенства, получены результаты, позволяющие оценить продолжительность и доминирование соответствующих фаз клеточного цикла G1, S, G2 + M на разных этапах культивирования.

При изучении динамики изменений, происходящих в ДНК инфицированных вирусом бешенства клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, замечено, что через 24 ч культивирования вируса росло количество клеток в фазе G1 по сравнению с контролем (на 12–21%). Так как в фазе G1 идет синтез мРНК, структурных белков, других клеточных компонентов, которые необходимы и для сборки вирионов возбудителя бешенства, то рост клеток в данной фазе цикла можно считать закономерным.

Обнаружено, что поскольку главным событием фазы S является репликация ДНК, то линейное уменьшение фазы S при культивировании вируса бешенства после 24 ч репродукции также может указывать на перестройку клетки на синтез вирусной РНК, а не репликацию клеточной ДНК.

Выявлено, что фаза G2 и фаза M (постсинтетическая, или премитотическая, и сам митоз) жизненного цикла клеток опытных образцов относительно уменьшались (на 17–28%) по отношению к контрольным, то есть инфицированные клетки находились в стадии деления меньше, чем неинфицированные. Вероятно, это было связано с тем, что ингибировались общий биосинтез и функции клетки-хозяина в результате биосинтеза компонентов вируса бешенства.

Определено, что полиплоидные клетки, которые образовывались в процессе культивирования клеток и вируса, были частично резистентны к возбудителю бешенства и, вероятно, обладали наименьшей чувствительностью.

Установлено, что перестройка клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH на синтез полных частиц вируса бешенства наступала через 24 ч репродукции, о чем свидетельствуют изменения в фазах клеточного цикла клетки-хозяина, замедление прироста самой популяции клеток.