Вирус гриппа D у крупного рогатого скота (обзор)

ВВЕДЕНИЕ

Комплекс респираторных болезней крупного рогатого скота является одним из наиболее экономически значимых многофакторных заболеваний, поражающих преимущественно молодняк крупного рогатого скота (КРС) во всем мире. Патогенами, наиболее часто вызывающими респираторные патологии, являются вирусы инфекционного ринотрахеита, вирусной диареи – болезни слизистых оболочек, респираторно-синцитиальной инфекции, парагриппа-3, коронавирусной инфекции КРС, бактерии Pasteurella multocida (P. multocida), Mannheimia haemolytica (M. haemolytica), Mycoplasma bovis (M. bovis), Histophilus somni (H. somni) [1-4].

Крупный рогатый скот считался невосприимчивым к вирусам гриппа до открытия вируса гриппа D (Influenza D virus, IDV). Этот вид был идентифицирован как новый этиологический агент комплекса респираторных заболеваний КРС [3]. Интерес к IDV растет, что подчеркивает необходимость изучения глобального воздействия, которое может иметь этот новый вирус, поражающий в основном КРС, хотя существует широкий спектр других видов, которые могут выступать в качестве хозяев.

Возбудители гриппа – РНК-содержащие вирусы, относящиеся к семейству Orthomyxoviridae, в котором выделяют четыре монотипных рода, классифицирующиеся на основе антигенных различий между их нуклеопротеиновыми (NP) и матриксными (М) белками: Alphainfluenzavirus, Betainfluenzavirus, Gammainfluenzavirus и Deltainfluenzavirus, каждый из которых имеет по одному виду – Influenza A virus (IAV), Influenza В virus (IBV), Influenza С virus (ICV) и Influenza D virus (IDV). Известно, что вирусы гриппа A, B и C вызывают респираторные заболевания у человека [5].

В отличие от других типов вируса гриппа, поражающих широкий спектр млекопитающих и птиц и вызывающих эпидемии и пандемии, резервуаром возбудителя гриппа D служит КРС, однако не исключена его циркуляция среди других видов млекопитающих [3][6-9].

Впервые IDV выделили в 2011 г. от больной свиньи с тяжелыми респираторными симптомами в штате Оклахома (США), примерно на 50% он был идентичен человеческому ICV, поэтому сначала его считали новым подтипом этого вируса [10]. Впоследствии были установлены генетические, антигенные и биологические различия [11]. В августе 2016 г. Международный комитет по таксономии вирусов (ICTV) классифицировал этот вирус как вид Influenza D virus нового рода Deltainfluenzavirus семейства Orthomyxoviridae. Дальнейшие исследования показали, что основным резервуаром IDV является КРС [11][12]. Специфические антитела к вирусу были также обнаружены у лошадей, мелких жвачных животных, диких свиней, буйволов, верблюдов и людей, особенно у тех, кто контактировал с КРС [10][13-16], что не исключает широкого спектра хозяев и распространение от КРС к человеку или другим видам животных.

В данном обзоре представлена информация о последних достижениях в изучении IDV, распространенности вируса и его роли в комплексе респираторных заболеваний КРС.

ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСА ГРИППА D

Вирус гриппа D – оболочечный вирус с сегментированным геномом, состоящим из одноцепочечной отрицательно заряженной РНК, разделенной на семь фрагментов. У IDV, также как и у ICV, отсутствует нейраминидаза. Вирионы имеют диаметр 80–120 нанометров [17]. Сегментированный геном IDV кодирует девять белков [18]. Три самых меньших сегмента содержат полимеразы PB2, PB1 и P3, которые необходимы для репликации и синтеза вирусной мРНК. Четвертый сегмент кодирует гликопротеин слияния гемагглютининэстеразу (hemagglutinin-esterase-fusion, HEF), который способствует проникновению вируса в клетки, а также является основной мишенью для вируснейтрализующих антител. Более широкий клеточный тропизм вируса гриппа D по сравнению с вирусом гриппа С обусловлен наличием у белка HEF IDV рецепторсвязывающего кармана, что позволяет связываться с различными молекулами клеточной поверхности [19][20]. Пятый сегмент кодирует нуклеопротеин (NP), который образует вирусный рибонуклеопротеиновый комплекс [19]. Шестой сегмент кодирует матриксные белки M1 и M2, выстилающие вирусную мембрану изнутри и формирующие ионные каналы [21]. Седьмой сегмент содержит неструктурные белки NS1 и NS2, которые участвуют в нейтрализации клеточного иммунного ответа, активированного интерфероном, и опосредуют ядерный экспорт рибонуклеопротеина [22].

Вирусы гриппа выработали различные стратегии продуцирования вирусных белков для максимального использования потенциала кодирования генома. Сплайсинг был продемонстрирован в сегментах NS и/или M вирусов гриппа. Все типы вирусов гриппа обладают сходным механизмом генерации белков NS1 и NS2. Однако каждый тип вирусов использует уникальную стратегию для продуцирования белков M1 и/или M2. При этом IDV демонстрирует новую стратегию при продуцировании белка M1 в сравнении с ICV. Он использует стратегию протеолитического расщепления, аналогичную стратегии ICV, для получения белка M2 из белка P42, в то время как в отличие от сегмента ICVM, генерирующего белок M1 посредством сплайсинга, который вводит только терминирующий кодон, сплайсинг сегмента IDVM продуцирует дополнительный 4-аминокислотный пептид в предыдущий экзон [11].

Исследования J. Yu et al. показали, что IDV обладает устойчивостью к высоким температурам и кислотности среды благодаря роли белка HEF и считается наиболее стабильным из четырех вирусов гриппа [17]. IDV сохраняет инфекционную активность даже после воздействия температуры 53 °C в течение 2 ч. Кроме того, агент теряет только 20% инфекционной активности при рН 3,0 в течение 30 мин, в то время как все остальные типы вирусов гриппа полностью инактивируются. Стабильность HEF при чрезвычайно низком рН подчеркивает новый аспект репликации IDV, который требует дальнейшего изучения [23].

ПАТОГЕНЕЗ

Возбудитель гриппа D обладает тропизмом к эпителию верхних и нижних дыхательных путей и может вызывать легкую или умеренную интерстициальную/бронхоинтерстициальную пневмонию. Вирус также обнаруживали в слизистых оболочках носа, трахеи, бронхиолах и тканях легких через 8 дней после заражения телят. Его выявляли в трахеобронхиальных и медиастинальных лимфатических узлах [3]. Наибольшая концентрация вируса наблюдалась в полости носа. Высокие концентрации РНК IDV были также обнаружены в обонятельных луковицах и миндалинах животных, инфицированных аэрозольно, но тропизм IDV к этим тканям не был подтвержден с помощью методов иммуногистохимии и выделения вируса [24].

Salem E. et al. [3], Ferguson L. et al. [18] показали, что IDV вызывает легкое респираторное заболевание у телят в экспериментах с прямым заражением. IDV-инфекция может изменять структурную целостность респираторного эпителия и, как следствие, вызывать значительное повышение количества нейтрофилов в трахее животных [18]. Этот патологический эффект, по-видимому, предполагает этиологическую роль IDV в комплексе респираторных заболеваний КРС. Дальнейшее изучение патогенеза гриппа у телят показало, что инфекция приводит к возникновению умеренной бронхопневмонии с ограниченным поражением интерстиция и значительной активацией рецепторов распознавания патогена и хемокинов CCL2, CCL3 и CCL4 [3]. Сигнальный путь, опосредованный интерфероном I типа, практически не активировался в клетках нижних дыхательных путей телят, инфицированных IDV [25].

Выявление генома IDV в образцах сыворотки крови тяжелобольного КРС позволило предположить, что вирус способен вызывать временную виремию и распространяться на другие органы. IDV был обнаружен с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в фекалиях на 5-й день и в тощей кишке на 6-й день после заражения, что соответствует времени максимальной репликации вирусной РНК в дыхательных путях. Yu J. et al. предположили, что IDV может размножаться в кишечном тракте аналогично IAV и IBV. Этот возможный энтеральный тропизм IDV может быть связан с его высокой кислотоустойчивостью [17]. Высокая термическая и кислотная стабильность вируса означает, что IDV обладает большим потенциалом резистентности, объясняющим высокую эффективность его передачи [3].

Рядом исследователей продемонстрировано, что экспериментальная инфекция гриппа D у морских свинок и хорьков протекает бессимптомно [10][26]. У морских свинок вирус был обнаружен как в верхних, так и в нижних дыхательных путях. В легких наблюдались обширные макроскопические изменения в альвеолярном пространстве с инфильтрацией клетками воспалительного происхождения, периваскулярным сужением и разрушением бронхиолярного эпителия с экссудацией [26]. У животных регистрировали также апоптоз эпителиальных клеток легких. У хорьков IDV реплицировался в клетках носовых раковин и в легких не выявлялся [10]. Инфицированные мыши также не имели клинических признаков болезни. Репликация IDV у мышей наблюдалась главным образом в верхних дыхательных путях, реже – в нижних. Вирус в низких титрах был обнаружен в кишечнике животных [27]. У инфицированных мышей наблюдалось значительное увеличение количества нейтрофилов и лимфоцитов в тканях легких [28]. Репликация IDV у мышей приводила к активации провоспалительных генов, включая гамма-интерферон (IFN-γ) и хемокин CCL2 [27].

Таким образом, по результатам экспериментальных заражений КРС можно сделать вывод, что IDV является возбудителем легких и умеренных форм респираторных заболеваний КРС и действует как кофактор в патогенезе комплекса респираторных болезней КРС.

РАСПРОСТРАНЕНИЕ IDV В МИРЕ

Вирус гриппа D широко распространен среди КРС в Северной и Южной Америке [14][18][29-32], Европе [33-37], Азии [38-40] и Африке [41][42].

Исследования образцов сыворотки крови показали, что IDV присутствовал в стадах КРС в США (Миссисипи и Небраска) еще в 2003 г. [12][29]. При проведении в США общенационального серологического обследования на грипп D установили, что общий уровень серопозитивности КРС в 2014–2015 гг. составил 77,5%, при этом показатели распространенности варьировали от 47,7 до 84,6% по разным регионам. Положительные пробы сыворотки крови выявили в 41 из 42 обследованных штатов [30]. Два исследования, проведенных с использованием метагеномного секвенирования образцов мазков из носовой полости КРС, собранных на откормочных площадках в США, Канаде и Мексике, показали связь IDV с респираторными болезнями [43][44]. В Северной Америке антитела к IDV были выявлены также у овец и коз в 5,2 и 8,8% образцов сыворотки крови соответственно [13]. Лошади также оказались носителями IDV – 15,7% (n = 364) проб сыворотки крови содержали специфические антитела к вирусу [15]. Исследование по оценке серопревалентности к IDV диких свиней показало, что 57 из 256 (19,1%) животных были IDV-серопозитивными, что указывает на то, что дикие свиньи могут играть определенную роль в экологии IDV [14].

В 85 (73%) из 116 обследованных ферм в Аргентине было обнаружено хотя бы одно положительное животное, при этом из 165 образцов сыворотки крови быков 112 (68%) оказались серопозитивными к IDV [31]. Во время вспышки респираторного заболевания КРС в Бразилии выявляли РНК IDV [32].

Вирус гриппа D широко распространен в странах Европы, включая Францию, Италию, Люксембург, Ирландию и Великобританию.

Во Франции в 2015 г. геном IDV был обнаружен методом ПЦР в 6 (4,5%) пробах биоматериала (легкие, мазок из носа), отобранного от здоровых и клинически больных телят. В четырех из шести образцов, положительных на IDV, установили коинфицирование такими патогенами, как P. multocida, M. haemolytica, H. somni, а также вирусами РСИ КРС и/или ИРТ КРС. В двух других пробах тестируемые агенты, кроме IDV, выявлены не были [33]. При исследовании сыворотки крови КРС (n = 3326), собранной с 2014 по 2018 г. в пяти регионах Франции, общая серопозитивность животных составила 47,2%, при этом результаты варьировали в зависимости от географического региона (31,0–70,0%) [34].

В Италии в 2014–2016 гг. в мазках из носа и в образцах тканей легких, отобранных от КРС с признаками респираторных болезней, геном IDV выявили в 8,0% случаев, а в пробах от клинически здоровых животных – в 3,4% случаев. Из 48 IDV-положительных образцов, полученных от КРС при вспышках респираторных заболеваний, в 62,5% случаев IDV был единственным вирусным агентом, что подтверждает гипотезу о том, что IDV может играть основную роль в возникновении комплекса респираторных инфекций. В остальных 37,5% образцов IDV обнаруживали вместе с другими респираторными патогенами, но в большинстве случаев с коронавирусом КРС. РНК IDV чаще выявляли в мазках из носа (9,4%), чем в тканях легких (3,4%), что подтверждает вывод, сделанный по результатам воспроизведения на лабораторных моделях экспериментальной IDV-инфекции, о том, что верхние дыхательные пути являются предпочтительным местом для репликации этого вируса. Серологические исследования, проведенные в Италии в 2015 г., показали высокую распространенность IDV (92,4%) на молочных фермах [2]. В Люксембурге серопозитивность обследованных в 2012–2016 гг. животных составила 80,2% [35]. В Ирландии в период с 2014 по 2016 г. методом ОТ-ПЦР исследовали 320 проб носовых выделений животных. В результате РНК вируса выявили в 18 образцах (5,6%), полученных с 10 ферм (11,9%) [36].

В Великобритании IDV обнаружили в 8,7% проб биоматериала от телят с признаками респираторных инфекций. Возбудитель гриппа во всех случаях выявляли в сочетании с бактериальными агентами и в некоторых – в составе вирусно-бактериальных ассоциаций. Вирусная РНК присутствовала как в верхних, так и в нижних дыхательных путях, а патологические изменения в тканях легких наблюдали наряду с признаками сопутствующих бактериальных инфекций. При секвенировании одного изолята из Великобритании установили его сходство со штаммами из Ирландии и Италии [37].

Первые сообщения о выявлении IDV в Китае появились в 2014 г., где геном вируса был обнаружен в 0,7% проб, отобранных от клинически здорового КРС [38]. Предположительно, IDV циркулирует среди азиатского КРС с 2011 г. В 2016–2017 гг. установили, что IDV широко распространен среди КРС, буйволов, свиней, овец и коз на юге Китая [39].

В Японии вирус был выявлен у КРС в 2016 г., при этом он обладал высокой контагиозностью [25]. Ретроспективный анализ проб сыворотки крови, собранной в 2009–2018 гг., показал, что серопозитивность животных в среднем составляла 57%. Доказана циркуляция вируса японской линии в стране с 2010 г. [40]. Первое сообщение о регистрации заражения КРС IDV в Турции было опубликовано в 2020 г. [45].

Bailey E. S. et al. [46] сообщали о выявлении генома IDV в образцах биоаэрозолей, отобранных на птицефабриках в Юго-Восточной Азии. Частичное секвенирование М-сегмента генома показало, что IDV, обнаруженный в птицеводческих хозяйствах, отличается от штаммов вируса, циркулирующих среди КРС в Северной Америке. Отсутствие информации о последовательности полного генома, особенно последовательности HEF, не позволило установить, к какой генетической линии принадлежит выявленный IDV. Для выяснения наличия IDV-инфекции у домашней птицы требуются дальнейшие исследования по изучению восприимчивости данного вида к заражению.

В Африке циркуляция вируса среди КРС установлена с 2012 г. Антитела к вирусу выявлены у КРС и мелких жвачных животных в Марокко, Того, Кот-д’Ивуаре, Бенине и Кении. Высокий уровень серопозитивности (99,0%) был обнаружен у верблюдов-дромадеров в Кении, что указывает на то, что этот вид животных может быть новым хозяином IDV [41]. Эти результаты были подтверждены другим серологическим исследованием, проведенным в Эфиопии, где также наблюдалась высокая серопозитивность верблюдов-дромадеров к IDV [42]. Инфекция среди молодняка КРС в африканских странах распространена в меньшей степени, по-видимому, это связано с менее интенсивным типом ведения животноводства.

Способность IDV вызывать заболевание у людей в настоящее время недостаточно изучена, и неясно, может ли этот возбудитель передаваться от человека к человеку. Передача и репликация вируса при прямом контакте у хорьков и морских свинок, которые используются при моделировании человеческого гриппа, может косвенно свидетельствовать об этом [10][26]. Holwerda M. et al. доказали, что IDV эффективно реплицируется in vitro в суррогатной модели респираторного эпителия при температурах окружающей среды, соответствующих температуре верхних и нижних дыхательных путей человека. Также авторы продемонстрировали, что вирус способен размножаться в культурах высокодифференцированных эпителиальных клеток дыхательных путей человека (hAEC) при 33 и 37 °C [47].

Проведенное в США ретроспективное исследование сывороток крови, собранных во время вспышек сезонного гриппа в 2007–2009 гг., показало наличие специфических антител к IDV у людей в 1,3% проб [10]. В связи с этим считается, что IDV может представлять потенциальную угрозу для персонала, непосредственно контактирующего с КРС. Так, высокий уровень серопозитивности к IDV у работников ферм установлен в США (91%) [48] и Италии (46%) [16]. Выявление антител к IDV у людей означает, что вирус может инфицировать человека и стать проблемой для общественного здравоохранения.

Геном IDV был обнаружен с помощью ОТ-ПЦР в образце смыва из полости носа у рабочего свинофермы в Малайзии [49]. В ходе другого исследования, проведенного в США, генетический материал IDV выявили в пробах биоаэрозолей, собранных в отделении неотложной помощи больницы в Северной Каролине [50] и международном аэропорту Роли-Дарем [51]. Эти результаты показывают, что IDV обладает зоонозным потенциалом. В целом у людей к этому новому вирусу гриппа иммунитет отсутствует.

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ IDV

С 2011 г. в США, Франции, Италии, Ирландии, Японии и Китае были секвенированы полные геномы более 50 штаммов IDV, выделенных от КРС, и 5 штаммов от свиней. Согласно последним исследованиям, вирусы гриппа D можно разделить на пять генетических групп (линий) на основе гена HEF [52]:

1) D/ОК – обнаружен в Европе (Франция, Италия и Ирландия), Америке (США и Мексика) и Азии (Китай);

2) D/660 – обнаружен в Европе (Италия) и Америке (США и Мексика);

3) D/Yama2016 – обнаружен в Азии (Япония);

4) D/Yama2019 – обнаружен в Азии (Япония и Китай);

5) D/CA2019 – обнаружен в Америке (США).

Вирусы, относящиеся к линиям D/OK и D/660 и совместно циркулирующие в настоящее время в популяциях КРС США и Европы, способны к рекомбинации и проявляют перекрестную реактивность, что может привести к образованию новых антигенных вариантов, которые смогут преодолеть ранее существовавший коллективный иммунитет и представлять дальнейшую угрозу здоровью сельскохозяйственных животных [17]. Китайские штаммы вируса гриппа D, принадлежащие к группе D/OK, отличаются от штаммов этой же генетической линии из США и Италии и подразделяются в каждой стране на сублинии. Штаммы линии D/OK, выделенные от свиней и КРС в США и Италии, сгруппированы в один кластер, что говорит о более широком распространении данной генетической линии в мире и передаче возбудителя между этими видами животных. Результаты молекулярно-генетического анализа изолятов IDV линии D/OK, выделенных от молочных коров, свиней и коз в китайской провинции Гуандун, показали очень низкое генетическое разнообразие. Штаммы линии D/660 из Франции и США отличались друг от друга в большей степени, чем штаммы внутри каждой страны, это позволяет предположить, что эта линия также разделилась на сублинии в разных странах. Интересно, что изоляты линий D/Yama2016 и D/Yama2019 до недавнего времени выявлялись только в Японии, при этом они имеют низкий уровень гомологии с вирусами линий D/OK и D/660, циркулирующими в других странах. Но в 2022 г. IDV, идентичный вирусу генетической линии D/Yama2019, был обнаружен в Китае. Недавно во время вспышки респираторного заболевания КРС в Южной Америке зарегистрирован первый случай выявления IDV и установлено, что циркулирующий в бразильских стадах вирус филогенетически отличается от известных IDV из Северной Америки, Европы и Азии [32]. Кроме того, сообщалось о появлении новой генетический линии вируса в Турции (D/Bursa2013) [53] и нового реассортанта в Намибии [54]. Эти результаты подчеркивают необходимость проведения мониторинга распространенности IDV для лучшего понимания эпизоотологии и эволюции вируса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ литературных данных показывает глобальное распространение IDV среди животных во всем мире. Крупный рогатый скот – основной резервуар вируса – играет значимую роль в распространении возбудителя. Вирус гриппа D является важным кофактором в развитии комплекса респираторных заболеваний КРС, так как способен самостоятельно вызывать респираторную патологию легкой и средней степени тяжести с высокой скоростью передачи и может усиливать эффекты других респираторных патогенов за счет синергетического эффекта. Увеличивающееся число вспышек IDV-инфекции у свиней и КРС в последнее время может быть связано не только с возрастающим вниманием к этому новому патогену, но и с повышением вирулентности возбудителя. IDV обладает потенциалом преодоления межвидового барьера и адаптации к человеку и, если произойдет резкое изменение патогенности вируса для человека, может стать серьезной проблемой здравоохранения.

Особенностью IDV является относительная стабильность в сравнении с остальными типами вируса гриппа, поэтому его эволюция идет медленно. В настоящее время средств специфической профилактики или методов лечения гриппа D не существует.

В России исследования по распространению IDV на территории страны и изучению его роли в комплексе респираторных заболеваний КРС не проводились. Международная торговля скотом влечет за собой риски завоза вируса на территорию нашей страны, что при отсутствии контроля будет способствовать распространению новой инфекции среди животных и представлять потенциальную угрозу здоровью людей. Поэтому изучение циркуляции IDV в разных регионах Российской Федерации представляет большой интерес в отношении благополучия животных и человека.