ОПТИМИЗАЦИЯ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОМА LISTERIA MONOCYTOGENES


https://doi.org/10.29326/2304-196X-2018-3-26-63-68

Полный текст:


Аннотация

Listeria monocytogenes – один из основных контаминантов пищевых продуктов, вызывающий заболевание, называемое листериоз. По количеству выявленных случаев он значительно уступает сальмонеллезам и кампилобактериозам, но превосходит их по тяжести клинического течения и проценту летальных исходов. Поэтому разработка видоспецифичных методов ПЦР для выявления генома L.monocytogenes является актуальной задачей. Оптимизирована методика выявления генома бактерий L. monocytogenes посредством полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Мишенью амплификации являлся высокоспецифичный и подходящий для точной качественной оценки всех штаммов ген iap, кодирующий поверхностный белок р60 L.monocytogenes. Подобрана оптимальная концентрация магния (6 мМ) и температура отжига праймеров (57 °С). Определены чувствительность и специфичность данной методики. Предел обнаружения составил 120 молекул-мишеней. Полученные результаты показывают, что оптимизированный вариант ПЦР-РВ, основанный на амплификации гена iap, позволяет выявлять L.monocytogenes в пробах продовольственного сырья животного происхождения и пищевых продуктов. Скрининговые исследования на основе оптимизированной ПЦР-РВ обеспечивают быстрые и надежные результаты.

Об авторах

Г. С. Скитович
ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир
Россия

Старший научный сотрудник, кандидат биологических наук, 

г. Владимир



Н. Б. Шадрова
ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир
Россия

Заведующий лабораторией, кандидат биологических наук, 

г. Владимир



О. В. Прунтова
ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир
Россия

Главный эксперт, доктор биологических наук, 

г. Владимир



К. В. Серова
ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир
Россия

Ведущий ветеринарный врач, 

г. Владимир



Список литературы

1. Бхуниа А. К. Патогенные микроорганизмы пищевых продуктов. – СПб.: Профессия, 2014. – 342 с.

2. Васильев Д. А., Ковалева Е. Н., Мастиленко А. В. Идентификация бактерий видов Listeria monocytogenes и Listeria ivanovii методом мультиплексной ПЦР в режиме «реального времени» // Биотика. – 2014. – № 1 (1). – С. 3–6.

3. Зайцева Е. А. Система анализа микробиологических и молекулярно-генетических маркеров для выявления высоковирулентных штаммов Listeria monocytogenes: дис. … д-ра мед. наук. – М., 2010. – 270 с.

4. Методические рекомендации по лабораторной диагностике листериоза животных и людей: утв. начальником ГУВ Госагропрома СССР А. Д. Третьяковым от 13 февраля 1987 г. – URL: http://www.libussr.ru/doc_ussr/usr_13807.htm (дата обращения: 05.02.18).

5. Методические указания по выявлению генома Listeria monocytogenes в пищевых продуктах с помощью ПЦР-РВ / А. В. Пискунов, О. В. Прунтова; ФГБУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2013. – 17 с.

6. Микробиологический анализ мяса, мяса птицы и яйцепродуктов: пер. с англ. / под ред. Дж. К. Мида. – СПб.: Профессия, 2008. – 384 с.

7. Новые методы идентификации Listeria monocytogenes / Т. И. Карпова, С. А. Ермолаева, И. В. Лопырев [и др.] // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2001. – Т. 3, № 3. – С. 266–273.

8. Продукты пищевые. Методы выявления бактерий Listeria monocytogenes: ГОСТ 32031-2012. – М.: Стандартинформ, 2014. – 47 с.

9. Рекомендации по постановке ПЦР / Евроген. – Вер. 18 сентября 2017 г. – URL: http://evrogen.ru/kit-user-manuals/Evrogen-PCRrecommendation.pdf (дата обращения: 05.02.18).

10. Тартаковский И. С., Малеев В. В., Ермолаева С. А. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. – М.: Медицина для всех, 2002. – 200 с.

11. A rapid differentiation of Listeria monocytogenes by use of PCR– SSCP in the listeriolysin O (hlyA) locus / A. Lehner, S. Loncarevic, M. Wagner [et al.] // J. Microbiol. Methods. – 1999. – Vol. 34, No. 3. – P. 165–171.

12. Application of 5’-nuclease PCR for quantitative detection of Listeria monocytogenes in pure cultures, water, skim milk, and unpasteurized whole milk / H. K. Nogva, K. Rudi, K. Naterstad [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2000. – Vol. 66, No. 10. – Р. 4266–4271; doi: 10.1128/AEM.66.10.42664271.2000.

13. Application of a multiplex polymerase chain reaction assay for the simultaneous confirmation of Listeria monocytogenes and other Listeria species in turkey sample surveillance / I. V. Wesley, K. M. Harmon, J. S. Dickson, A. R. Schwartz // J. Food Prot. – 2002. – Vol. 65, No. 5. – Р. 780–785.

14. Comparative analysis of 16S and 23S rRNA sequences of Listeria species / B. Sallen, A. Rajoharison, S. Desvarenne [et al.] // Int. J. Syst. Bacteriol. – 1996. – Vol. 46, No. 3. – P. 669–674; doi: 10.1099/00207713-46-3-669.

15. Detection and differentiation of Listeria spp. by a single reaction based on multiplex PCR / A. Bubert, I. Hein, M. Rauch [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 1999. – Vol. 65, No. 10. – P. 4688–4692.

16. Detection and quantification of the iap gene of Listeria monocytogenes and Listeria innocua by a new real-time quantitative PCR assay / I. Hein, D. Klein, A. Lehner [et al.] // Res. Microbiol. – 2001. – Vol. 152, No. 1. – Р. 37–46; https://doi.org/10.1016/S0923-2508(00)01166-9.

17. Differentiation of the major Listeria monocytogenes serovars by multiplex PCR / M. Doumith, C. Buchrieser, P. Glaser [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 2004. – Vol. 42, No. 8. – P. 3819–3822; doi: 10.1128/JCM.42.8.38193822.2004.

18. Gallagher D. L., Ebel E. D., Kause J. R. Draft FSIS Risk Assessment for Listeria in Ready-to-eat Meat and Poultry Products. – Washington, 2003. – URL: http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.198.7563 &rep=rep1&type=pdf (дата обращения: 05.02.18).

19. Lawrence L. M., Gilmour A. Incidence of Listeria spp. and Listeria monocytogenes in a poultry processing environment and in poultry products and their rapid confirmation by multiplex PCR // Appl. Environ. Microbiol. – 1994. – Vol. 60, No. 12. – Р. 4600–4604.

20. Multilocus sequence typing of Listeria monocytogenes by use of hypervariable genes reveals clonal and recombination histories of three lineages / R. Meinersmann, R. W. Phillips, M. Wiedmann, M. E. Berrang // Appl. Environ. Microbiol. – 2004. – Vol. 70, No. 4. – P. 2193–2203; doi: 10.1128/AEM.70.4.2193-2203.2004.

21. Multiplex PCR assay for the routine detection of Listeria in food / N. S. Bansal, F. H. McDonell, A. Smith [et al.] // Int. J. Food Microbiol. – 1996. – Vol. 33, No. 2–3. – Р. 293–300; https://doi.org/10.1016/0168-1605(96)01161-0.

22. Nightingale K., Windham K., Wiedmann M. Evolution and molecular phylogeny of Listeria monocytogenes isolated from human and animal listeriosis cases and foods // J. Bacteriol. – 2005. – Vol. 187, No. 16. – P. 5537– 5551; doi: 10.1128/JB.187.16.5537-5551.2005.

23. Norton D. M. Polimerase chain reaction-based methods for detection of Listeria monocytogenes: Toward real-time screening for food and environmental samples // J. AOAC Int. – 2002. – Vol. 85, No. 2. – Р. 505–515.

24. Paoli G. C., Bhunia A. K., Bayles D. O. Listeria monocytogenes // Foodborne Pathogens: Microbiology and Molecular Biology / ed. P. M. Fratamico, A. K. Bhunia, J. L. Smith. – Norfolk: Caister Academic, 2005. – P. 295–325.

25. Quantitative detection of Listeria monocytogenes and Listeria innocua by real-time PCR: Assessment of hly, iap, and lin02483 targets and AmpliFluor technology / D. Rodrígues-Lázaro, M. Hernández, M. Scortti [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2004. – Vol. 70, No. 3. – P. 1366–1377; doi: 10.1128/AEM.70.3.1366-1377.2004.

26. Rapid enumeration of Listeria monocytogenes in artificially contaminated cabbage using real-time polymerase chain reaction / A. J. Hough, S. A. Harbison, M. G. Savill [et al.] // J. Food Prot. – 2002. – Vol. 65, No. 8. – Р. 1329–1332.

27. Rijpens N. P., Herman L. M. Molecular methods for identification and detection of bacterial food pathogens // J. AOAC Int. – 2002. – Vol. 85, No. 4. – Р. 984–995.

28. Rodrígues-Lázaro D., Hernández M., Pla M. Simultaneous quantitative detection of Listeria spp. and Listeria monocytogenes using a duplex real-time PCR-based assay // FEMS Microbiol. Lett. – 2004. – Vol. 233, No. 2. – P. 257–267; https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2004.tb09490.x.

29. The gene coding for protein p60 of Listeria monocytogenes and its use as a specific probe for Listeria monocytogenes / S. Köhler, M. LeimeisterWächter, T. Chakraborty [et al.] // Infect. Immun. – 1990. – Vol. 58, No. 6. – Р. 1943–1650.

30. σB -dependent gene induction and expression in Listeria monocytogenes during osmotic and acid stress conditions simulating the intestinal environment / D. Sue, D. Fink, M. Wiedmann, K. J. Boor // Microbiology. – 2004. – Vol. 150 (Pt. 11). – P. 3843–3855; doi: 10.1099/mic.0.27257-0.


Дополнительные файлы

Для цитирования: Скитович Г.С., Шадрова Н.Б., Прунтова О.В., Серова К.В. ОПТИМИЗАЦИЯ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОМА LISTERIA MONOCYTOGENES. Ветеринария сегодня. 2018;(3):63-68. https://doi.org/10.29326/2304-196X-2018-3-26-63-68

For citation: Skitovich G.S., Shadrova N.B., Pruntova O.V., Serova K.V. REAL-TIME PCR OPTIMIZATION FOR LISTERIA MONOCYTOGENES GENOME DETECTION. Veterinary Science Today. 2018;(3):63-68. (In Russ.) https://doi.org/10.29326/2304-196X-2018-3-26-63-68

Просмотров: 150

Обратные ссылки

  • Обратные ссылки не определены.


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 2304-196X (Print)
ISSN 2658-6959 (Online)