ОПТИМИЗАЦИЯ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОМА LISTERIA MONOCYTOGENES

Listeria monocytogenes – один из основных контаминантов пищевых продуктов, вызывающий заболевание, называемое листериоз. По количеству выявленных случаев он значительно уступает сальмонеллезам и кампилобактериозам, но превосходит их по тяжести клинического течения и проценту летальных исходов. Поэтому разработка видоспецифичных методов ПЦР для выявления генома L.monocytogenes является актуальной задачей. Оптимизирована методика выявления генома бактерий L. monocytogenes посредством полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Мишенью амплификации являлся высокоспецифичный и подходящий для точной качественной оценки всех штаммов ген iap, кодирующий поверхностный белок р60 L.monocytogenes. Подобрана оптимальная концентрация магния (6 мМ) и температура отжига праймеров (57 °С). Определены чувствительность и специфичность данной методики. Предел обнаружения составил 120 молекул-мишеней. Полученные результаты показывают, что оптимизированный вариант ПЦР-РВ, основанный на амплификации гена iap, позволяет выявлять L.monocytogenes в пробах продовольственного сырья животного происхождения и пищевых продуктов. Скрининговые исследования на основе оптимизированной ПЦР-РВ обеспечивают быстрые и надежные результаты.

ПЦР-РВ, Listeria monocytogenes, пищевые продукты животного происхождения

1. Бхуниа А. К. Патогенные микроорганизмы пищевых продуктов. – СПб.: Профессия, 2014. – 342 с.

2. Васильев Д. А., Ковалева Е. Н., Мастиленко А. В. Идентификация бактерий видов Listeria monocytogenes и Listeria ivanovii методом мультиплексной ПЦР в режиме «реального времени» // Биотика. – 2014. – № 1 (1). – С. 3–6.

3. Зайцева Е. А. Система анализа микробиологических и молекулярно-генетических маркеров для выявления высоковирулентных штаммов Listeria monocytogenes: дис. … д-ра мед. наук. – М., 2010. – 270 с.

4. Методические рекомендации по лабораторной диагностике листериоза животных и людей: утв. начальником ГУВ Госагропрома СССР А. Д. Третьяковым от 13 февраля 1987 г. – URL: http://www.libussr.ru/doc_ussr/usr_13807.htm (дата обращения: 05.02.18).

5. Методические указания по выявлению генома Listeria monocytogenes в пищевых продуктах с помощью ПЦР-РВ / А. В. Пискунов, О. В. Прунтова; ФГБУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2013. – 17 с.

6. Микробиологический анализ мяса, мяса птицы и яйцепродуктов: пер. с англ. / под ред. Дж. К. Мида. – СПб.: Профессия, 2008. – 384 с.

7. Новые методы идентификации Listeria monocytogenes / Т. И. Карпова, С. А. Ермолаева, И. В. Лопырев [и др.] // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2001. – Т. 3, № 3. – С. 266–273.

8. Продукты пищевые. Методы выявления бактерий Listeria monocytogenes: ГОСТ 32031-2012. – М.: Стандартинформ, 2014. – 47 с.

9. Рекомендации по постановке ПЦР / Евроген. – Вер. 18 сентября 2017 г. – URL: http://evrogen.ru/kit-user-manuals/Evrogen-PCRrecommendation.pdf (дата обращения: 05.02.18).

10. Тартаковский И. С., Малеев В. В., Ермолаева С. А. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. – М.: Медицина для всех, 2002. – 200 с.

11. A rapid differentiation of Listeria monocytogenes by use of PCR– SSCP in the listeriolysin O (hlyA) locus / A. Lehner, S. Loncarevic, M. Wagner [et al.] // J. Microbiol. Methods. – 1999. – Vol. 34, No. 3. – P. 165–171.

12. Application of 5’-nuclease PCR for quantitative detection of Listeria monocytogenes in pure cultures, water, skim milk, and unpasteurized whole milk / H. K. Nogva, K. Rudi, K. Naterstad [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2000. – Vol. 66, No. 10. – Р. 4266–4271; doi: 10.1128/AEM.66.10.42664271.2000.

13. Application of a multiplex polymerase chain reaction assay for the simultaneous confirmation of Listeria monocytogenes and other Listeria species in turkey sample surveillance / I. V. Wesley, K. M. Harmon, J. S. Dickson, A. R. Schwartz // J. Food Prot. – 2002. – Vol. 65, No. 5. – Р. 780–785.

14. Comparative analysis of 16S and 23S rRNA sequences of Listeria species / B. Sallen, A. Rajoharison, S. Desvarenne [et al.] // Int. J. Syst. Bacteriol. – 1996. – Vol. 46, No. 3. – P. 669–674; doi: 10.1099/00207713-46-3-669.

15. Detection and differentiation of Listeria spp. by a single reaction based on multiplex PCR / A. Bubert, I. Hein, M. Rauch [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 1999. – Vol. 65, No. 10. – P. 4688–4692.

16. Detection and quantification of the iap gene of Listeria monocytogenes and Listeria innocua by a new real-time quantitative PCR assay / I. Hein, D. Klein, A. Lehner [et al.] // Res. Microbiol. – 2001. – Vol. 152, No. 1. – Р. 37–46; https://doi.org/10.1016/S0923-2508(00)01166-9.

17. Differentiation of the major Listeria monocytogenes serovars by multiplex PCR / M. Doumith, C. Buchrieser, P. Glaser [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 2004. – Vol. 42, No. 8. – P. 3819–3822; doi: 10.1128/JCM.42.8.38193822.2004.

18. Gallagher D. L., Ebel E. D., Kause J. R. Draft FSIS Risk Assessment for Listeria in Ready-to-eat Meat and Poultry Products. – Washington, 2003. – URL: http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.198.7563 &rep=rep1&type=pdf (дата обращения: 05.02.18).

19. Lawrence L. M., Gilmour A. Incidence of Listeria spp. and Listeria monocytogenes in a poultry processing environment and in poultry products and their rapid confirmation by multiplex PCR // Appl. Environ. Microbiol. – 1994. – Vol. 60, No. 12. – Р. 4600–4604.

20. Multilocus sequence typing of Listeria monocytogenes by use of hypervariable genes reveals clonal and recombination histories of three lineages / R. Meinersmann, R. W. Phillips, M. Wiedmann, M. E. Berrang // Appl. Environ. Microbiol. – 2004. – Vol. 70, No. 4. – P. 2193–2203; doi: 10.1128/AEM.70.4.2193-2203.2004.

21. Multiplex PCR assay for the routine detection of Listeria in food / N. S. Bansal, F. H. McDonell, A. Smith [et al.] // Int. J. Food Microbiol. – 1996. – Vol. 33, No. 2–3. – Р. 293–300; https://doi.org/10.1016/0168-1605(96)01161-0.

22. Nightingale K., Windham K., Wiedmann M. Evolution and molecular phylogeny of Listeria monocytogenes isolated from human and animal listeriosis cases and foods // J. Bacteriol. – 2005. – Vol. 187, No. 16. – P. 5537– 5551; doi: 10.1128/JB.187.16.5537-5551.2005.

23. Norton D. M. Polimerase chain reaction-based methods for detection of Listeria monocytogenes: Toward real-time screening for food and environmental samples // J. AOAC Int. – 2002. – Vol. 85, No. 2. – Р. 505–515.

24. Paoli G. C., Bhunia A. K., Bayles D. O. Listeria monocytogenes // Foodborne Pathogens: Microbiology and Molecular Biology / ed. P. M. Fratamico, A. K. Bhunia, J. L. Smith. – Norfolk: Caister Academic, 2005. – P. 295–325.

25. Quantitative detection of Listeria monocytogenes and Listeria innocua by real-time PCR: Assessment of hly, iap, and lin02483 targets and AmpliFluor technology / D. Rodrígues-Lázaro, M. Hernández, M. Scortti [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2004. – Vol. 70, No. 3. – P. 1366–1377; doi: 10.1128/AEM.70.3.1366-1377.2004.

26. Rapid enumeration of Listeria monocytogenes in artificially contaminated cabbage using real-time polymerase chain reaction / A. J. Hough, S. A. Harbison, M. G. Savill [et al.] // J. Food Prot. – 2002. – Vol. 65, No. 8. – Р. 1329–1332.

27. Rijpens N. P., Herman L. M. Molecular methods for identification and detection of bacterial food pathogens // J. AOAC Int. – 2002. – Vol. 85, No. 4. – Р. 984–995.

28. Rodrígues-Lázaro D., Hernández M., Pla M. Simultaneous quantitative detection of Listeria spp. and Listeria monocytogenes using a duplex real-time PCR-based assay // FEMS Microbiol. Lett. – 2004. – Vol. 233, No. 2. – P. 257–267; https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2004.tb09490.x.

29. The gene coding for protein p60 of Listeria monocytogenes and its use as a specific probe for Listeria monocytogenes / S. Köhler, M. LeimeisterWächter, T. Chakraborty [et al.] // Infect. Immun. – 1990. – Vol. 58, No. 6. – Р. 1943–1650.

30. σB -dependent gene induction and expression in Listeria monocytogenes during osmotic and acid stress conditions simulating the intestinal environment / D. Sue, D. Fink, M. Wiedmann, K. J. Boor // Microbiology. – 2004. – Vol. 150 (Pt. 11). – P. 3843–3855; doi: 10.1099/mic.0.27257-0.