veterinaryВетеринария сегодняVeterinary Science Today2304-196X2658-6959"Veinard"10.29326/2304-196X-2018-3-26-63-68veterinary-377Research ArticleОБЩИЕ ВОПРОСЫGENERAL ISSUESОПТИМИЗАЦИЯ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОМА LISTERIA MONOCYTOGENESREAL-TIME PCR OPTIMIZATION FOR LISTERIA MONOCYTOGENES GENOME DETECTIONСкитовичГ. С.SkitovichG. S.

Старший научный сотрудник, кандидат биологических наук, 

г. Владимир

Senior Researcher, Candidate of Sciences (Biology),

Vladimir

skitovich@arriah.ruШадроваН. Б.ShadrovaN. B.

Заведующий лабораторией, кандидат биологических наук, 

г. Владимир

 Head of Laboratory, Candidate of Sciences (Biology), 

Vladimir

shadrova@arriah.ruПрунтоваО. В.PruntovaO. V.

Главный эксперт, доктор биологических наук, 

г. Владимир

Chief Expert, Doctor of Sciences (Biology), 

Vladimir

pruntova@arriah.ruСероваК. В.SerovaK. V.

Ведущий ветеринарный врач, 

г. Владимир

Leading Veterinarian,

Vladimir

serova@arriah.ruФГБУ «ВНИИЗЖ», г. ВладимирРоссияFGBI "ARRIAH", VladimirRussian Federation201803102018036368Copyright © Скитович Г.С., Шадрова Н.Б., Прунтова О.В., Серова К.В., 20182018Скитович Г.С., Шадрова Н.Б., Прунтова О.В., Серова К.В.Skitovich G.S., Shadrova N.B., Pruntova O.V., Serova K.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://veterinary.arriah.ru/jour/article/view/377

Listeria monocytogenes – один из основных контаминантов пищевых продуктов, вызывающий заболевание, называемое листериоз. По количеству выявленных случаев он значительно уступает сальмонеллезам и кампилобактериозам, но превосходит их по тяжести клинического течения и проценту летальных исходов. Поэтому разработка видоспецифичных методов ПЦР для выявления генома L.monocytogenes является актуальной задачей. Оптимизирована методика выявления генома бактерий L. monocytogenes посредством полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Мишенью амплификации являлся высокоспецифичный и подходящий для точной качественной оценки всех штаммов ген iap, кодирующий поверхностный белок р60 L.monocytogenes. Подобрана оптимальная концентрация магния (6 мМ) и температура отжига праймеров (57 °С). Определены чувствительность и специфичность данной методики. Предел обнаружения составил 120 молекул-мишеней. Полученные результаты показывают, что оптимизированный вариант ПЦР-РВ, основанный на амплификации гена iap, позволяет выявлять L.monocytogenes в пробах продовольственного сырья животного происхождения и пищевых продуктов. Скрининговые исследования на основе оптимизированной ПЦР-РВ обеспечивают быстрые и надежные результаты.

Listeria monocytogenes is one of the major food contaminants causing the illness, called Listeriosis. Listeriosis incidence is much less, than the number salmonellosis and campylobacteriosis cases, but the clinical disease is significantly more severe and has a higher mortality. That’s why the development of species-specific PCR techniques to detect L. monocytogenes genome is a topical task. L. monocytogenes bacteria genome detection technique using real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was improved. The amplification target was a highly specific and suitable for qualification of all strains iap gen, coding L. monocytogenes р60 surface protein. Optimum magnesium concentration (6 mM) and primer annealing temperature (57 °С) were selected. The sensitivity and specificity of the technique were identified. Detection threshold was 120 target molecules. The results obtained demonstrate that optimized qRT-PCR version, based on iap gen amplification, enables to detect L. monocytogenes in animal product and food samples. Optimized qRT-PCR-based screening tests ensure rapid and reliable results.

ПЦР-РВListeria monocytogenesпищевые продукты животного происхожденияqRT-PCRListeria monocytogenesfood products of animal originReferencesБхуниа А. К. Патогенные микроорганизмы пищевых продуктов. – СПб.: Профессия, 2014. – 342 с.Bkhunia A. K. Pathogenic Microorganisms of Food Products. SPb.: Professia, 2014 (in Russian).Васильев Д. А., Ковалева Е. Н., Мастиленко А. В. Идентификация бактерий видов Listeria monocytogenes и Listeria ivanovii методом мультиплексной ПЦР в режиме «реального времени» // Биотика. – 2014. – № 1 (1). – С. 3–6.Vasiliev D. A., Kovaleva Ye. N., Mastilenko A. V. Identification of Listeria monocytogenes and Listeria ivanovii bacteria species by multiplex realtime PCR. Biotika. 2014; 1 (1): 3–6 (in Russian).Зайцева Е. А. Система анализа микробиологических и молекулярно-генетических маркеров для выявления высоковирулентных штаммов Listeria monocytogenes: дис. … д-ра мед. наук. – М., 2010. – 270 с.Zaitseva Ye. A. Microbiological and molecular and genetic marker analysis system for detection of highly virulent Listeria monocytogenes strains: Doctorate thesis (Medical Science). M., 2010 (in Russian).Методические рекомендации по лабораторной диагностике листериоза животных и людей: утв. начальником ГУВ Госагропрома СССР А. Д. Третьяковым от 13 февраля 1987 г. – URL: http://www.libussr.ru/doc_ussr/usr_13807.htm (дата обращения: 05.02.18).Guidelines on laboratory diagnostics of human and animal listeriosis: Approved by Head of Main Veterinary Department of the USSR Gosagroprom A. D. Tretyakov on February 13, 1987. URL: http://www.libussr.ru/doc_ussr/usr_13807.htm (request date: 05.02.18) (in Russian).Методические указания по выявлению генома Listeria monocytogenes в пищевых продуктах с помощью ПЦР-РВ / А. В. Пискунов, О. В. Прунтова; ФГБУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2013. – 17 с.Guidelines on Listeria monocytogenes genome detection in foodstuffs by qRT-PCR. А. V. Piskunov, O. V. Pruntova; FGBI “ARRIAH”. Vladimir, 2013 (in Russian).Микробиологический анализ мяса, мяса птицы и яйцепродуктов: пер. с англ. / под ред. Дж. К. Мида. – СПб.: Профессия, 2008. – 384 с.Microbiological analysis of red meat, poultry and eggs: Translation from English. Ed. G. C. Mead. SPb.: Professia, 2008 (in Russian).Новые методы идентификации Listeria monocytogenes / Т. И. Карпова, С. А. Ермолаева, И. В. Лопырев [и др.] // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2001. – Т. 3, № 3. – С. 266–273.New techniques of Listeria monocytogenes identification. T. I. Karpova, S. A. Yermolayeva, I. V. Lopyrev [et al.]. Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy. 2001; 3 (3): 266–273 (in Russian).Продукты пищевые. Методы выявления бактерий Listeria monocytogenes: ГОСТ 32031-2012. – М.: Стандартинформ, 2014. – 47 с.Food Products. Listeria monocytogenes Bacteria Detection Techniques: GOST 32031-2012. М.: Standartinform, 2014 (in Russian).Рекомендации по постановке ПЦР / Евроген. – Вер. 18 сентября 2017 г. – URL: http://evrogen.ru/kit-user-manuals/Evrogen-PCRrecommendation.pdf (дата обращения: 05.02.18).PCR Design Recommendations. Evrogen. – September 18, 2017. – URL: http://evrogen.ru/kit-user-manuals/Evrogen-PCR-recommendation. pdf (request date: 05.02.18) (in Russian).Тартаковский И. С., Малеев В. В., Ермолаева С. А. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. – М.: Медицина для всех, 2002. – 200 с.Tartakovsky I. S., Maleyev V. V., Yermolayeva S. A. Listeria: Role in human infectious pathology and laboratory diagnostics. М.: Meditsina dlya vseh, 2002 (in Russian).A rapid differentiation of Listeria monocytogenes by use of PCR– SSCP in the listeriolysin O (hlyA) locus / A. Lehner, S. Loncarevic, M. Wagner [et al.] // J. Microbiol. Methods. – 1999. – Vol. 34, No. 3. – P. 165–171.A rapid differentiation of Listeria monocytogenes by use of PCR– SSCP in the listeriolysin O (hlyA) locus. A. Lehner, S. Loncarevic, M. Wagner [et al.]. J. Microbiol. Methods. 1999; 34 (3): 165–171.Application of 5’-nuclease PCR for quantitative detection of Listeria monocytogenes in pure cultures, water, skim milk, and unpasteurized whole milk / H. K. Nogva, K. Rudi, K. Naterstad [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2000. – Vol. 66, No. 10. – Р. 4266–4271; doi: 10.1128/AEM.66.10.42664271.2000.Application of 5’-nuclease PCR for quantitative detection of Listeria monocytogenes in pure cultures, water, skim milk, and unpasteurized whole milk. H. K. Nogva, K. Rudi, K. Naterstad [et al.]. Appl. Environ. Microbiol. 2000; 66 (10): 4266–4271; doi: 10.1128/AEM.66.10.4266-4271.2000.Application of a multiplex polymerase chain reaction assay for the simultaneous confirmation of Listeria monocytogenes and other Listeria species in turkey sample surveillance / I. V. Wesley, K. M. Harmon, J. S. Dickson, A. R. Schwartz // J. Food Prot. – 2002. – Vol. 65, No. 5. – Р. 780–785.Application of a multiplex polymerase chain reaction assay for the simultaneous confirmation of Listeria monocytogenes and other Listeria species in turkey sample surveillance. I. V. Wesley, K. M. Harmon, J. S. Dickson, A. R. Schwartz. J. Food Prot. 2002; 65 (5): 780–785.Comparative analysis of 16S and 23S rRNA sequences of Listeria species / B. Sallen, A. Rajoharison, S. Desvarenne [et al.] // Int. J. Syst. Bacteriol. – 1996. – Vol. 46, No. 3. – P. 669–674; doi: 10.1099/00207713-46-3-669.Comparative analysis of 16S and 23S rRNA sequences of Listeria species. B. Sallen, A. Rajoharison, S. Desvarenne [et al.]. Int. J. Syst. Bacteriol. 1996; 46 (3): 669–674; doi: 10.1099/00207713-46-3-669.Detection and differentiation of Listeria spp. by a single reaction based on multiplex PCR / A. Bubert, I. Hein, M. Rauch [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 1999. – Vol. 65, No. 10. – P. 4688–4692.Detection and differentiation of Listeria spp. by a single reaction based on multiplex PCR. A. Bubert, I. Hein, M. Rauch [et al.]. Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65 (10): 4688–4692.Detection and quantification of the iap gene of Listeria monocytogenes and Listeria innocua by a new real-time quantitative PCR assay / I. Hein, D. Klein, A. Lehner [et al.] // Res. Microbiol. – 2001. – Vol. 152, No. 1. – Р. 37–46; https://doi.org/10.1016/S0923-2508(00)01166-9.Detection and quantification of the iap gene of Listeria monocytogenes and Listeria innocua by a new real-time quantitative PCR assay. I. Hein, D. Klein, A. Lehner [et al.]. Res. Microbiol. 2001; 152 (1): 37–46; https://doi.org/10.1016/S0923-2508(00)01166-9.Differentiation of the major Listeria monocytogenes serovars by multiplex PCR / M. Doumith, C. Buchrieser, P. Glaser [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 2004. – Vol. 42, No. 8. – P. 3819–3822; doi: 10.1128/JCM.42.8.38193822.2004.Differentiation of the major Listeria monocytogenes serovars by multiplex PCR. M. Doumith, C. Buchrieser, P. Glaser [et al.]. J. Clin. Microbiol. 2004; 42 (8): 3819–3822; doi: 10.1128/JCM.42.8.3819-3822.2004.Gallagher D. L., Ebel E. D., Kause J. R. Draft FSIS Risk Assessment for Listeria in Ready-to-eat Meat and Poultry Products. – Washington, 2003. – URL: http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.198.7563 &rep=rep1&type=pdf (дата обращения: 05.02.18).Gallagher D. L., Ebel E. D., Kause J. R. Draft FSIS Risk Assessment for Listeria in Ready-to-eat Meat and Poultry Products. Washington, 2003. URL: http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.198.7563 &rep=rep1&type=pdf (дата обращения: 05.02.18).Lawrence L. M., Gilmour A. Incidence of Listeria spp. and Listeria monocytogenes in a poultry processing environment and in poultry products and their rapid confirmation by multiplex PCR // Appl. Environ. Microbiol. – 1994. – Vol. 60, No. 12. – Р. 4600–4604.Lawrence L. M., Gilmour A. Incidence of Listeria spp. and Listeria monocytogenes in a poultry processing environment and in poultry products and their rapid confirmation by multiplex PCR. Appl. Environ. Microbiol. 1994; 60 (12): 4600–4604.Multilocus sequence typing of Listeria monocytogenes by use of hypervariable genes reveals clonal and recombination histories of three lineages / R. Meinersmann, R. W. Phillips, M. Wiedmann, M. E. Berrang // Appl. Environ. Microbiol. – 2004. – Vol. 70, No. 4. – P. 2193–2203; doi: 10.1128/AEM.70.4.2193-2203.2004.Multilocus sequence typing of Listeria monocytogenes by use of hypervariable genes reveals clonal and recombination histories of three lineages. R. Meinersmann, R. W. Phillips, M. Wiedmann, M. E. Berrang. Appl. Environ. Microbiol. 2004; 70 (4): 2193–2203; doi: 10.1128/AEM.70.4.21932203.2004.Multiplex PCR assay for the routine detection of Listeria in food / N. S. Bansal, F. H. McDonell, A. Smith [et al.] // Int. J. Food Microbiol. – 1996. – Vol. 33, No. 2–3. – Р. 293–300; https://doi.org/10.1016/0168-1605(96)01161-0.Multiplex PCR assay for the routine detection of Listeria in food. N. S. Bansal, F. H. McDonell, A. Smith [et al.]. Int. J. Food Microbiol. 1996; 33 (2–3): 293–300; https://doi.org/10.1016/0168-1605(96)01161-0.Nightingale K., Windham K., Wiedmann M. Evolution and molecular phylogeny of Listeria monocytogenes isolated from human and animal listeriosis cases and foods // J. Bacteriol. – 2005. – Vol. 187, No. 16. – P. 5537– 5551; doi: 10.1128/JB.187.16.5537-5551.2005.Nightingale K., Windham K., Wiedmann M. Evolution and molecular phylogeny of Listeria monocytogenes isolated from human and animal listeriosis cases and foods. J. Bacteriol. 2005; 187 (16): 5537–5551; doi: 10.1128/JB.187.16.5537-5551.2005.Norton D. M. Polimerase chain reaction-based methods for detection of Listeria monocytogenes: Toward real-time screening for food and environmental samples // J. AOAC Int. – 2002. – Vol. 85, No. 2. – Р. 505–515.Norton D. M. Polimerase chain reaction-based methods for detection of Listeria monocytogenes: Toward real-time screening for food and environmental samples. J. AOAC Int. 2002; 85 (2): 505–515.Paoli G. C., Bhunia A. K., Bayles D. O. Listeria monocytogenes // Foodborne Pathogens: Microbiology and Molecular Biology / ed. P. M. Fratamico, A. K. Bhunia, J. L. Smith. – Norfolk: Caister Academic, 2005. – P. 295–325.Paoli G. C., Bhunia A. K., Bayles D. O. Listeria monocytogenes // Foodborne Pathogens: Microbiology and Molecular Biology. Ed. P. M. Fratamico, A. K. Bhunia, J. L. Smith. Norfolk: Caister Academic, 2005: 295–325.Quantitative detection of Listeria monocytogenes and Listeria innocua by real-time PCR: Assessment of hly, iap, and lin02483 targets and AmpliFluor technology / D. Rodrígues-Lázaro, M. Hernández, M. Scortti [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2004. – Vol. 70, No. 3. – P. 1366–1377; doi: 10.1128/AEM.70.3.1366-1377.2004.Quantitative detection of Listeria monocytogenes and Listeria innocua by real-time PCR: Assessment of hly, iap, and lin02483 targets and AmpliFluor technology. D. Rodrígues-Lázaro, M. Hernández, M. Scortti [et al.]. Appl. Environ. Microbiol. 2004; 70 (3): 1366–1377; doi: 10.1128/ AEM.70.3.1366-1377.2004.Rapid enumeration of Listeria monocytogenes in artificially contaminated cabbage using real-time polymerase chain reaction / A. J. Hough, S. A. Harbison, M. G. Savill [et al.] // J. Food Prot. – 2002. – Vol. 65, No. 8. – Р. 1329–1332.Rapid enumeration of Listeria monocytogenes in artificially contaminated cabbage using real-time polymerase chain reaction. A. J. Hough, S. A. Harbison, M. G. Savill [et al.]. J. Food Prot. 2002; 65 (8): 1329–1332.Rijpens N. P., Herman L. M. Molecular methods for identification and detection of bacterial food pathogens // J. AOAC Int. – 2002. – Vol. 85, No. 4. – Р. 984–995.Rijpens N. P., Herman L. M. Molecular methods for identification and detection of bacterial food pathogens. J. AOAC Int. 2002; 85 (4): 984–995.Rodrígues-Lázaro D., Hernández M., Pla M. Simultaneous quantitative detection of Listeria spp. and Listeria monocytogenes using a duplex real-time PCR-based assay // FEMS Microbiol. Lett. – 2004. – Vol. 233, No. 2. – P. 257–267; https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2004.tb09490.x.Rodrígues-Lázaro D., Hernández M., Pla M. Simultaneous quantitative detection of Listeria spp. and Listeria monocytogenes using a duplexreal-time PCR-based assay. FEMS Microbiol. Lett. 2004; 233 (2): 257–267; https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2004.tb09490.x.The gene coding for protein p60 of Listeria monocytogenes and its use as a specific probe for Listeria monocytogenes / S. Köhler, M. LeimeisterWächter, T. Chakraborty [et al.] // Infect. Immun. – 1990. – Vol. 58, No. 6. – Р. 1943–1650.The gene coding for protein p60 of Listeria monocytogenes and its use as a specific probe for Listeria monocytogenes. S. Köhler, M. LeimeisterWächter, T. Chakraborty [et al.]. Infect. Immun. 1990; 58 (6): 1943–1650.σB -dependent gene induction and expression in Listeria monocytogenes during osmotic and acid stress conditions simulating the intestinal environment / D. Sue, D. Fink, M. Wiedmann, K. J. Boor // Microbiology. – 2004. – Vol. 150 (Pt. 11). – P. 3843–3855; doi: 10.1099/mic.0.27257-0.σB -dependent gene induction and expression in Listeria monocytogenes during osmotic and acid stress conditions simulating the intestinal environment. D. Sue, D. Fink, M. Wiedmann, K. J. Boor. Microbiology. 2004; 150 (Pt. 11): 3843–3855; doi: 10.1099/mic.0.27257-0.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.