Подходы определения генетической последовательности РНК-содержащих вирусов из биологического материала с низкой копийностью на примере вирусов летучих мышей

Введение. Летучие мыши, являясь природным резервуаром множества вирусов, традиционно воспринимаются как источник биологической опасности. Активное развитие центров реабилитации рукокрылых входит в противоречие с их репутацией высокопотенциальных резервуаров зоонозных инфекций: концентрация животных в условиях центра без должного контроля способна искусственно усиливать циркуляцию патогенов. Разрешить это противоречие можно путем включения в протоколы работы центров предварительного вирусологического скрининга поступающих особей. Выявление носителей и их своевременная изоляция (карантин) защитят как остальных животных, так и персонал, а накопленные данные позволят создать систему раннего предупреждения о появлении новых генетических вариантов вирусов.

Цель исследования. Апробация комбинированного подхода к получению полногеномных последовательностей РНК-содержащих вирусов рукокрылых в условиях низкой копийности и фрагментации РНК-матрицы, включающего последовательное применение и модификацию методов ампликонного секвенирования и случайного прайминга (SMART-9N).

Материалы и методы. В качестве материала исследования были взяты образцы фекалий летучих мышей, содержащихся в условиях реабилитацион ного центра в г. Ростове-на-Дону в 2022–2023 гг. В статье описана последовательность действий от выделения нуклеиновых кислот до обработки и анализа данных. Также представлены три способа обогащения РНК-матрицы на основе реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции.

Результаты. При проведении исследования была разработана праймерная панель для выявления альфа-коронавирусов летучих мышей. В результате метагеномного анализа установлено присутствие вирусной РНК Bat bastrovirus (семейство Astroviridae) и разработаны диагностические праймеры для подтверждения. Получена полная генетическая последовательность вируса Loanvirus brunaense (семейство Hantaviridae) и 95% нуклеотидной последовательности вируса Alphacoronavirus (семейство Coronaviridae).

Заключение. Данные о генетических последовательностях вирусов играют важную роль в различных аспектах науки, медицины, ветеринарии и здравоохранения в целом. Результаты данного исследования могут быть использованы для разработки экспресс-диагностических тест-систем по обнаружению различных вирусов летучих мышей.

1. Nieto-Rabiela F., Wiratsudakul A., Suzán G., Rico-Chávez O. Viral networks and detection of potential zoonotic viruses in bats and rodents: a worldwide analysis. Zoonoses and Public Health. 2019; 66 (6): 655–666. https://doi.org/10.1111/zph.12618

2. Alvarez-Munoz S., Upegui-Porras N., Gomez A. P., Ramirez-Nieto G. Key factors that enable the pandemic potential of RNA viruses and inter species transmission: a systematic review. Viruses. 2021; 13 (4):537. https://doi.org/10.3390/v13040537

3. Letko M., Seifert S. N., Olival K. J., Plowright R. K., Munster V. J. Bat-borne virus diversity, spillover and emergence. Nature Reviews Microbiology. 2020; 18 (8): 461–471. https://doi.org/10.1038/s41579-020 0394-z

4. Yan X., Liu Y., Hu T., Huang Z., Li C., Guo L., et al. A compendium of 8,176 bat RNA viral metagenomes reveals ecological drivers and circulation dynamics. Nature Microbiology. 2025; 10 (2): 554–568. https://doi.org/10.1038/s41564-024-01884-7

5. Greninger A. L. The challenge of diagnostic metagenomics. Expert Review of Molecular Diagnostics. 2018; 18 (7): 605–615. https://doi.org/10.1 080/14737159.2018.1487292

6. Bergner L. M., Orton R. J., da Silva Filipe A., Shaw A. E., Becker D. J., Tello C., et al. Using noninvasive metagenomics to characterize viral communities from wildlife. Molecular Ecology Resources. 2019; 19 (1): 128 143. https://doi.org/10.1111/1755-0998.12946

7. Eby P., Peel A. J., Hoegh A., Madden W., Giles J. R., Hudson P. J., Plowright R. K. Pathogen spillover driven by rapid changes in bat ecology. Nature. 2023; 613 (7943): 340–344. https://doi.org/10.1038/s41586-022-05506-2

8. Wang J., Pan Y. F., Yang L. F., Yang W. H., Lv K., Luo C. M., et al. Individual bat virome analysis reveals co-infection and spillover among bats and virus zoonotic potential. Nature Communications. 2023; 14 (1):4079. https://doi.org/10.1038/s41467-023-39835-1

9. Tsai V., Lai Y.-C., Contreras G. P., Yeh T.-Y. Impact of anthropogenic activities on the ecosystem and emergence of bat-borne zoonotic diseases. Virology. 2026; 617:110811. https://doi.org/10.1016/j.virol.2026.110811

10. Hayman D. T. S., Bowen R. A., Cryan P. M., McCracken G. F., O’Shea T. J., Peel A. J., et al. Ecology of zoonotic infectious diseases in bats: current knowledge and future directions. Zoonoses and Public Health. 2013; 60 (1): 2–21. https://doi.org/10.1111/zph.12000

11. Hassani A., Khan G. Human-animal interaction and the emergence of SARS-CoV-2. JMIR Public Health and Surveillance. 2020; 6 (4):e22117. https://doi.org/10.2196/22117

12. Berthinussen A., Richardson O. C., Altringham J. D. Bat Conservation: Global evidence for the effects of interventions. Conservation Evidence Series Synopses. Cambridge: University of Cambridge; 2021; 266–269. https://www.conservationevidence.com/synopsis/pdf/32

13. Kelly A., Goodwin S., Grogan A., Mathews F. Post-release survival of hand-reared pipistrelle bats (Pipistrellus spp.). Animal Welfare. 2008; 17 (4): 375–382. https://doi.org/10.1017/S0962728600027871

14. Serangeli M. T., Cistrone L., Ancillotto L., Tomassini A., Russo D. The post-release fate of hand-reared orphaned bats: survivaland habitat selection. Animal Welfare. 2012; 21 (1): 9–18. https://doi.org/10.7120/096272812799129510

15. Apoorva, Singh S. K. A tale of endurance: bats, viruses and immune dynamics. Future Microbiology. 2024; 19 (9): 841–856. https://doi.org/10.2217/fmb-2023-0233

16. Calisher C. H., Childs J. E., Field H. E., Holmes K. V., Schountz T. Bats: important reservoir hosts of emerging viruses. Clinical Microbiology Reviews. 2006; 19 (3): 531–545. https://doi.org/10.1128/CMR.00017-06

17. Harazim M., Perrot J., Varet H., Bourhy H., Lannoy J., Pikula J., et al. Transcriptomic responses of bat cells to European bat lyssavirus 1 infection under conditions simulating euthermia and hibernation. BMC Immunology. 2023; 24 (1):7. https://doi.org/10.1186/s12865-023-00542-7

18. Williams E. P., Spruill-Harrell B. M., Taylor M. K., Lee J., Nywening A. V., Yang Z., et al. Common themes in zoonotic spillover and disease emergence: lessons learned from bat- and rodent-borne RNA viruses. Viruses. 2021; 13 (8):1509. https://doi.org/10.3390/v13081509

19. Aguilar Rangel M., Dolan P. T., Taguwa S., Xiao Y., Andino R., Frydman J. High-resolution mapping reveals the mechanism and contribution of genome insertions and deletions to RNA virus evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2023; 120 (31):e2304667120. https://doi.org/10.1073/pnas.2304667120

20. Becker D. J., Crowley D. E., Washburne A. D., Plowright R. K. Temporal and spatial limitations in global surveillance for bat filoviruses and henipaviruses. Biology Letters. 2019; 15 (12):20190423. https://doi.org/10.1098/rsbl.2019.0423

21. Sarabeev V., Shvydka S., Lisitsyna O., Oros M., Miterpáková M., Ždímalová M. The sample size matters: evaluating minimum and reasonable values in prevalence studies. International Journal for Parasitology. 2025; 55 (13): 683–693. https://doi.org/10.1016/j.ijpara.2025.05.003

22. Martínez-Puchol S., Tarradas-Alemany M., Mejías-Molina C., Itarte M., Rusiñol M., Baliellas J., et al. Target enrichment metaviromics enables comprehensive surveillance of coronaviruses in environmental and animal samples. Heliyon. 2024; 10 (11):e31556. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2024.e31556

23. Greninger A. L. A decade of RNA virus metagenomics is (not) enough. Virus Research. 2018; 244: 218–229. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2017.10.014

24. Ohlopkova O. V., Popov Ig. V., Popov Il. V., Stolbunova K. A., Stepanyuk M. A., Moshkin A. D., et al. Detection and phylogenetic analysis of alphacoronaviruses in bat populations of Rostov and Novosibirsk Regions of Russia, 2021–2023. Microbiology Research. 2025; 16 (1):3. https://doi.org/10.3390/microbiolres16010003

25. Ohlopkova O. V., Stolbunova K. A., Popov Il. V., Popov Ig. V., Kabwe E., Davidyuk Y. N., et al. Detection of Brno loanvirus (Loanvirus brunaense) in common noctule bats (Nyctalus noctula) in Southern Russia. Brazilian Journal of Microbiology. 2025; 56 (1): 675–682. https://doi.org/10.1007/s42770-024-01587-5

26. Claro I. M., Ramundo M. S., Coletti T. M., da Silva C. A. M., Valenca I. N., Candido D. S., et al. Rapid viral metagenomics using SMART-9N amplification and nanopore sequencing. Wellcome Open Research. 2023; 6:241. https://doi.org/10.12688/wellcomeopenres.17170.2

27. Oude Munnink B. B., Cotten M., Canuti M., Deijs M., Jebbink M. F., van Hemert F. J., et al. A novel astrovirus-like RNA virus detected in human stool. Virus Evolution. 2016; 2 (1):vew005. https://doi.org/10.1093/ve/vew005

28. Роев Г. В., Борисова Н. И., Чистякова Н. В., Выходцева А. В., Акимкин В. Г., Хафизов К. Ф. Бастровирусы (Astroviridae): генетическое разнообразие и потенциальное влияние на здоровье человека и животных. Вопросы вирусологии. 2023; 68 (6): 505–512. https://doi.org/10.36233/0507-4088-192

29. Jones B. D., Kaufman E. J., Peel A. J. Viral co-infection in bats: a systematic review. Viruses. 2023; 15 (9):1860. https://doi.org/10.3390/v15091860

30. Takemae N., Kuba Y., Oba K., Kageyama T. Direct genome sequencing of respiratory viruses from low viral load clinical specimens using the target capture sequencing technology. Microbiology Spectrum. 2024; 12 (11):e0098624. https://doi.org/10.1128/spectrum.00986-24

31. Cerro-Monje A., Buenestado-Serrano S., Palomino-Cabrera R., Molero-Salinas A., Herranz M., Alonso R., et al. A solution to achieve sequencing from SARS-CoV-2 specimens with low viral loads: concatenation of reads from independent reactions. Virology Journal. 2024; 21 (1):121. https://doi.org/10.1186/s12985-024-02347-5

32. Marcolungo L., Beltrami C., Degli Esposti C., Lopatriello G., Piubelli C., Mori A., et al. ACoRE: accurate SARS-CoV-2 genome reconstruction for the characterization of intra-host and inter-host viral diversity in clinical samples and for the evaluation of re-infections. Genomics. 2021; 113 (4): 1628–1638. https://doi.org/10.1016/j.ygeno.2021.04.008