Разработка ПЦР-тест-систем для оценки распространенности генов антибиотикорезистентности у клостридий

Введение. Актуальность данной работы обусловлена ростом антибиотикорезистентности у патогенных клостридий в агропромышленном комплексе Уральского федерального округа, что приводит к снижению эффективности терапии, увеличению экономических потерь от инфекционных заболеваний и создает угрозу межвидового переноса генов резистентности, подчеркивая необходимость разработки современных инструментов для молекулярного мониторинга в рамках реализации национальных стратегий по сдерживанию устойчивости к противомикробным препаратам.

Цель исследования. Разработка и апробация ПЦР-тест-систем для детекции генов антибиотикорезистентности (tetM/B, ermB/Q, bcrA/B/D/R) у Clostridium perfringens и Clostridium difficile.

Материалы и методы. Исследовали 472 пробы биологического материала (фекалии и раневое отделяемое от животных, корма, объекты окружающей среды), отобранные в 2023–2024 гг. на 32 молочно-товарных предприятях региона. Видовую принадлежность выделенных изолятов подтверждали методом MALDI-ToF-масс-спектрометрии, а фенотипическую устойчивость к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом в соответствии со стандартами EUCAST. С помощью ПЦР был сформирован банк ДНК, выделенной из поступивших проб биологического материала и изолятов клостридий, коллекционных штаммов различных видов спорообразующих анаэробов.

Результаты. В результате была создана и валидирована эффективная ПЦР-панель для детекции генов антимикробной резистентности у клостридий. Скрининг 123 проб, содержащих ДНК целевых патогенов, позволил выявить распространение генов антимикробной резистентности: доминирующим у Clostridium difficile являлся ген ermB (95,1%), у Clostridium perfringens – гены ermB (90,0%) и ermQ (67,1%). Ген tetМ обнаруживали в 52,4 и 60,0% проб соответственно, гены bcrA/B/D/R – у 27,1–39,8% изолятов. Фенотипические исследования показали формирование у клостридий множественной лекарственной устойчивости.

Заключение. Разработанная тест-система стала надежным инструментом для молекулярного мониторинга антимикробной резистентности, полученные данные свидетельствуют о массовой циркуляции клостридий с генетическим потенциалом резистентности к клинически значимым антибиотикам.

1. Судоргина Т. Е., Глотова Т. И., Нефедченко А. В., Котенева С. В., Велькер Д. А., Глотов А. Г. Частота выделения бактерий Clostridium spp. и их ассоциаций при различных формах клостридиоза крупного рогатого скота. Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2024; 54 (3): 55–62. https://doi.org/10.26898/0370-8799-2024-3-6

2. Нефедченко А. В., Глотова Т. И., Судоргина Т. Е. Видовой состав и токсигенные свойства клостридий крупного рогатого скота в Западно- Сибирском регионе и разработка тест-системы для их выявления. Ин новационные достижения ветеринарной науки и практики: материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 85-летию доктора ветеринарных наук, профессора, заслуженного деятеля науки Российской Федерации Тарнуева Юрия Абогоевича (Улан-Удэ, 14–16 июля 2024 г.). Улан-Удэ: Бурятская ГСХА им. В. Р. Филиппова; 2024; 145–151. https://elibrary.ru/yvltlw

3. Нефедченко А. В., Судоргина Т. Е., Глотова Т. И., Котенева С. В., Глотов А. Г. Видовая идентификация бактерий рода Clostridium, вы деленных от крупного рогатого скота, при помощи мультиплексной ПЦР в режиме реального времени. Siberian Journal of Life Sciences and Agriculture. 2025; 17 (2): 315–333. https://doi.org/10.12731/2658-6649-2025-17-2-1178

4. Безбородова Н. А., Соколова О. В., Кожуховская В. B., Томских О. Г., Печура Е. В., Суздальцева М. А. Патогенные виды клостридий и их устойчивость к антибиотикам, факторы вирулентности и геномные особенности. Инновации и продовольственная безопасность. 2023; (3): 39–51. https://doi.org/10.31677/2311-0651-2023-41-3-39-51

5. Безбородова Н. А., Порываева А. П., Шилова Е. Н., Кожуховская В. В., Соколова О. В., Яцентюк С. П. Оценка эффективности вакцин против клостридиозов крупного рогатого скота, с учетом доминирующих анаэробных возбудителей на территории Свердловской области. Ветеринария Кубани. 2025; (1): 4–7. https://elibrary.ru/jugmez

6. Андреева С. В., Шадрова Н. Б., Скитович Г. С. Методические рекомендации по идентификации микроорганизмов с применением масс-спектрометра MALDI-ToF Autof MS 1000: утв. ФГБУ «ВНИИЗЖ» 23.06.2023 № 44-23. Владимир; 2023. 43 с.

7. Bendary M. M., Abd El-Hamid M. I., El-Tarabili R. M., Hefny A. A., Algendy R. M., Elzohairy N. A., et al. Clostridium perfringens associated with foodborne infections of animal origins: insights into prevalence, antimicrobial resistance, toxin genes profiles, and toxinotypes. Biology. 2022; 11 (4):551. https://doi.org/10.3390/biology11040551

8. Hassani S., Pakbin B., Brück W. M., Mahmoudi R., Mousavi S. Prevalence, antibiotic resistance, toxin-typing and genotyping of Clostridium perfringens in raw beef meats obtained from Qazvin City, Iran. Antibiotics. 2022; 11 (3):340. https://doi.org/10.3390/antibiotics11030340

9. МУК 4.2.1890-04 Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: методические указания. М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России; 2004. 91 с. 10. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 10.0. 2020. https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_10.0_Breakpoint_Tables.pdf

10. Adams V., Han X., Lyras D., Rood J. I. Antibiotic resistance plasmids and mobile genetic elements of Clostridium perfringens. Plasmid. 2018; 99: 32–39. https://doi.org/10.1016/j.plasmid.2018.07.002

11. Anju K., Karthik K., Divya V., Mala Priyadharshini M. L., Sharma R. K., Manoharan S. Toxinotyping and molecular characterization of antimicrobial resistance in Clostridium perfringens isolated from different sources of livestock and poultry. Anaerobe. 2021; 67:102298. https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2020.102298

12. Holt H. M., Danielsen T. K., Justesen U. S. Routine disc diffusion antimicrobial susceptibility testing of Clostridium difficile and association with PCR ribotype 027. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 2015; 34 (11): 2243–2246. https://doi.org/10.1007/s10096-015-2475-x

13. Huang H., Weintraub A., Fang H., Wu S., Zhang Y., Nord C. E. Antimicrobial susceptibility and heteroresistance in Chinese Clostridium difficile strains. Anaerobe. 2010; 16 (6): 633–635. https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2010.09.002

14. Imwattana K., Rodríguez C., Riley T. V., Knight D. R. A species-wide genetic atlas of antimicrobial resistance in Clostridioides difficile. Microbial Genomics. 2021; 7 (11):000696. https://doi.org/10.1099/mgen.0.000696

15. Untergasser A., Cutcutache I., Koressaar T., Ye J., Faircloth B. C., Remm M., Rozen S. G. Primer3 – new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 2012; 40 (15):e115. https://doi.org/10.1093/nar/gks596

16. Rodríguez A., Rodríguez M., Córdoba J. J., Andrade M. J. Design of Primers and Probes for Quantitative Real-Time PCR Methods. In: PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology Methods in Molecular Biology. Vol. 1275. Ed. by C. Basu. New York: Humana Press; 2015; Chapter 3: 31–56. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2365-6_3

17. Schmidt C., Löffler B., Ackermann G. Antimicrobial phenotypes and molecular basis in clinical strains of Clostridium difficile. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2007; 59 (1): 1–5. https://doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2007.03.009

18. Spigaglia P., Mastrantonio P. Comparative analysis of Clostridium difficile clinical isolates belonging to different genetic lineages and time periods. Journal of Medical Microbiology. 2004; 53 (11): 1129–1136. https://doi.org/10.1099/jmm.0.45682-0

19. Bendary M. M., Abd El-Hamid M. I., El-Tarabili R. M., Hefny A. A., Algendy R. M., Elzohairy N. A., et al. Clostridium perfringens associated with foodborne infections of animal origins: insights into prevalence, antimicrobial resistance, toxin genes profiles, and toxinotypes. Biology. 2022; 11 (4):551. https://doi.org/10.3390/biology11040551

20. Kartalidis P., Skoulakis A., Tsilipounidaki K., Florou Z., Petinaki E., Fthenakis G. C. Clostridioides difficile as a dynamic vehicle for the dissemination of antimicrobial-resistance determinants: review and in silico analysis. Microorganisms. 2021; 9 (7):1383. https://doi.org/10.3390/microorganisms9071383

21. Pannullo A. G., Zbylicki B. R., Ellermeier C. D. Identification of DraRS in Clostridioides difficile, a two-component regulatory system that responds to lipid II-interacting antibiotics. Journal of Bacteriology. 2023; 205 (10):e00164-23. https://doi.org/10.1128/jb.00164-23

22. Ho T. D., Ellermeier C. D. PrsW is required for colonization, resistance to antimicrobial peptides, and expression of extracytoplasmic function σ factors in Clostridium difficile. Infection and Immunity. 2011; 79 (8): 3229 3238. https://doi.org/10.1128/iai.00019-11

23. Kather E. J., Marks S. L., Foley J. E. Determination of the prevalence of antimicrobial resistance genes in canine Clostridium perfringens isolates. Veterinary Microbiology. 2006; 113 (1–2): 97–101. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2005.10.021