Анализ распространения антибиотикорезистентности среди изолятов бактерий группы кишечной палочки, выделенных из пищевой продукции

ВВЕДЕНИЕ

Одним из важнейших изобретений человечества является разработка в 1928 г. британским бактериологом Александром Флемингом первого антибиотика – пенициллина [1][2][3]. Уже к середине XX в. были открыты и другие антибактериальные препараты, такие как эритромицин, стрептомицин, тетрациклин [4][5]. С момента изобретения и по настоящее время антибиотики находят широкое применение, а именно: в медицине, производстве, животноводстве [6][7][8][9][10].

Уже в 1940 г., в самом начале применения пенициллина, стали появляться первые сообщения о том, что некоторые микроорганизмы способны вырабатывать устойчивость к этому антибиотику [2][5]. С каждым годом количество бактерий, резистентных к ранее созданным антимикробным препаратам (АМП), возрастает [7][9][10][11][12]. Наблюдается тенденция к росту числа заболеваний, в том числе и пищевых токсикоинфекций, вызванных микроорганизмами, проявляющими устойчивость к антибактериальным препаратам [13][14][15][16][17].

В 2024 г. Всемирная организация здравоохранения опубликовала обновленный список микроорганизмов, представляющих наибольшую опасность для жизни и здоровья населения. Данный список включает в себя три категории бактерий согласно степени представляемой угрозы. В первую категорию, включающую микроорганизмы с высоким уровнем приоритетности, отнесены бактерии, обладающие способностью проявлять множественную устойчивость к антимикробным лекарственным средствам. Именно к этой категории отнесли бактерии семейства Enterobacteriaceaе из-за их устойчивости к карбапенемам и цефалоспоринам III поколения [18].

В настоящее время реализуются меры по сокращению объема использования антибиотиков [19]. Всемирная организация здравоохранения разработала план действий, направленный на оптимизацию применения АМП с целью обеспечения их рационального использования [18]. В Российской Федерации в рамках противодействия распространению антибиотикорезистентности бактерий был принят ряд документов, регламентирующих использование АМП, а также реализацию мер, направленных на борьбу с устойчивостью бактерий к АМП [19]. Так, Указом Президента РФ от 11.03.2019 № 97 были утверждены «Основы государственной политики Российской Федерации в области обеспечения химической и биологической безопасности на период до 2025 года и дальнейшую перспективу». В ноябре 2021 г. издан приказ Минсельхоза России «Об утверждении перечня лекарственных препаратов, предназначенных для лечения инфекционных и паразитарных болезней животных, вызываемых патогенными микроорганизмами и условно-патогенными микроорганизмами, в отношении которых вводится ограничение на применение в лечебных целях, в том числе для лечения сельскохозяйственных животных». Распоряжением Правительства РФ от 16.08.2024 № 2214-р был утвержден «План мероприятий на 2025–2030 годы по реализации Стратегии предупреждения распространения антимикробной резистентности в Российской Федерации на период до 2030 года», одним из направлений которой является системный мониторинг распространения антибиотикорезистентности микроорганизмов. Непрерывный контроль антибиотикорезистентности позволяет отслеживать изменения в показателях устойчивости бактерий к антибактериальным препаратам [20][21]. Согласно данным, представленным в аналитическом отчете о состоянии антибиотикорезистентности бактериальных возбудителей инфекций в РФ от 28.12.2024, за период с 2019 по 2024 г. представители семейства Enterobacteriaceaе составляют 55,6% среди всех выявляемых возбудителей бактериальных инфекций. В анализируемый период наиболее распространенными в стране являлись следующие представители бактерий группы кишечной палочки (БГКП): Klebsiella pneumoniae (45,4%), Escherichia coli (37,47%), Proteus mirabilis (4,15%), Enterobacter cloacae (3,02%) и Klebsiella oxytoca (2,04%) [22].

Вышеизложенные данные свидетельствуют об актуальности определения антибиотикорезистентности микроорганизмов, выявляемых в продукции животного происхождения, пищевом сырье и продуктах питания.

Частота устойчивости к антибиотикам в целом у представителей семейства Enterobacteriaceaе, выделенных от заболевших пациентов, составила: к ампициллину – 86,34%, амоксициллину/клавулановой кислоте – 66,62%, пиперациллину/тазобактаму – 43,71%, цефалоспоринам (цефотаксиму, цефтазидиму и цефепиму) – 60,54, 52,6 и 49,08% соответственно, азтреонаму – 54,15%, цефтазидиму/авибактаму и азтреонаму/авибактаму – 15,84 и 1,24% соответственно, карбапенемам (эртапенему, имипенему и меропенему) – 33,97, 21,78 и 23,02% соответственно, имипенему/релебактаму – 21,34%, фторхинолонам (ципрофлоксацину) – 55,88%, аминогликозидам (амикацину и гентамицину) – 21,16 и 34,88% соответственно, триметоприму/сульфаметоксазолу – 52,07%, хлорамфениколу – 37,2%, колистину – 10,91% [22][23][24][25][26].

Новизна данной работы состоит в выделении новых антибиотикорезистентных энтеробактерий, демонстрирующих множественную лекарственную устойчивость, и анализе видов пищевых продуктов как источников распространения антимикробной резистентности.

Целью исследования является выделение изолятов БГКП из образцов пищевой продукции и воды, изучение их устойчивости к АМП и анализ распространенности резистентности к антибиотикам среди выделенных изолятов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объектов исследования были использованы 134 изолята БГКП, выделенные из пищевой продукции и воды в отделе микробиологических исследований Владимирской испытательной лаборатории ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2024 г. Анализ проб проводили в соответствии с нормативными документами: ГОСТ 31747-2012 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)»; ГОСТ 30726-2001 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli»; ГОСТ 31955.1-2013 «Вода питьевая. Обнаружение и количественный учет Escherichia coli и колиформных бактерий. Часть 1. Метод мембранной фильтрации».

Питательные среды, реактивы и тест-системы. В ходе проведения исследования для первичного посева образцов использовали среду Кесслера (ФБУН ГНЦ ПМБ, Россия). Для дифференциации БГКП применяли агар Chromocult Coliform Agar (Merck, Германия). Для идентификации изолированные колонии высевали на триптон-соевый агар (ФБУН ГНЦ ПМБ, Россия). Для определения чувствительности к АМП изоляты БГКП пересевали на агар Мюллера – Хинтона (HiMedia, Индия).

Идентификацию полученных микроорганизмов по биохимическим свойствам осуществляли с использованием набора API 20 E (bioMérieux, Франция).

Масс-спектрометрический анализ проводили на масс-спектрометре MALDI Autof MS 1000 (Autobio Diagnostics Co., Ltd., Китай). Параметры анализа оптимизировали для диапазона масс от 2000 до 20 150 m/z (масса/время), записывали спектр, полученный в результате суммирования 20 одиночных спектров. Для записи, обработки и статистического анализа полученных масс-спектров использовали программное обеспечение Autof Acquirer v2.0.130 (Autobio Diagnostics Co., Ltd., Китай).

Определение чувствительности к АМП проводили диско-диффузионным методом согласно российским рекомендациям «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» (МАКМАХ) и МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». В ходе работы использовали бумажные диски с антибиотиками (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Россия) следующих групп:

1) пенициллины с ингибиторами β-лактамаз: ампициллин/сульбактам (10/10 мкг в диске), амоксициллин/клавуланат (20/10 мкг в диске), тикарциллин/клавуланат (75/10 мкг в диске);

2) цефалоспорины I поколения: цефалотин (30 мкг в диске), цефазолин (30 мкг в диске);

3) цефалоспорины II поколения: цефаклор (30 мкг в диске), цефуроксим (30 мкг в диске), цефокситин (30 мкг в диске), цефамандол (30 мкг в диске);

4) цефалоспорины III поколения: цефтриаксон (30 мкг в диске), цефтазидим (30 мкг в диске), цефотаксим (30 мкг в диске);

5) цефалоспорины IV поколения: цефепим (30 мкг в диске);

6) карбапенемы: имипенем (10 мкг в диске), меропенем (10 мкг в диске);

7) аминогликозиды: канамицин (30 мкг в диске), гентамицин (10 мкг в диске), амикацин (30 мкг в диске);

8) хинолоны: налидиксовая кислота (30 мкг в диске);

9) фторхинолоны: офлоксацин (5 мкг в диске), ципрофлоксацин (5 мкг в диске), левофлоксацин (5 мкг в диске);

10) тетрациклины: тетрациклин (30 мкг в диске), доксициклин (30 мкг в диске);

11) амфениколы: хлорамфеникол, или левомицетин (30 мкг в диске);

12) сульфаниламиды: триметоприм/сульфаметоксазол, или ко-тримоксазол (1,25/23,75 мкг в диске).

Для определения антибиотикорезистентности бактериальную суспензию (0,5 по стандарту мутности МакФарланда) равномерно распределяли на поверхности агара. Диски с антибиотиками наносили на поверхность инокулированного исследуемой культурой агара (не более 4 диска на 1 чашку). После аппликации дисков чашки Петри помещали в термостат кверху дном и инкубировали при температуре 35 °С в течение 18–24 ч.

Оценку результатов, в соответствии с рекомендациями МУК 4.2.1890-04, проводили по наличию зон задержки роста микроорганизмов вокруг дисков. Диаметр зон задержки роста с учетом диаметра самого диска измеряли с точностью до 1 мм.

Интерпретация и анализ результатов. Изоляты бактерий разделяли по отношению к антибиотикам на следующие группы: чувствительные, промежуточные, резистентные (устойчивые) к одному и двум антибиотикам, полирезистентные – устойчивые к трем и более антибиотикам. В группе полирезистентных изолятов выделяли экстремально резистентные, которые были устойчивы к 10 и более АМП.

Распределение изолятов на чувствительные (Ч), промежуточные (П) и резистентные (Р) группы проводили согласно МУК 4.2.1890-04 (табл. 1).

Для статистической обработки данных использовали приложение Microsoft Excel и стандартные статистические приемы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В 2024 г. в отделе микробиологических исследований Владимирской испытательной лаборатории ФГБУ «ВНИИЗЖ» было проведено 2667 исследований по показателю БГКП. Было выделено 134 изолята БГКП, из них: 11 – из образцов воды, 22 – из молочной продукции, 94 – из мяса и мясной продукции, 3 – из рыбной продукции, 2 – из кулинарных изделий, 1 – из специй и 1 – из яичного меланжа. Процент выявлений БГКП в различных группах пищевой продукции составил от 0,5% в специях до 13,1% в воде (рис. 1).

Для первичного посева проб пищевой продукции использовали среду Кесслера. Из пробирок, в которых наблюдали газообразование и/или помутнение среды, выполняли посев на среду Chromocult Coliform Agar. После инкубации в течение 24 ч при 37 °С для идентификации отбирали колонии розового (красного) и синего (фиолетового) цветов. В процессе изучения микроорганизмов с применением наборов для биохимической идентификации API 20 E было установлено, что выделенные изоляты относятся к семейству Enterobacteriaceaе. Среди выделенных культур были идентифицированы E. coli – 81,3%, Citrobacter spp. – 6,0%, Enterobacter spp. – 5,2%, Cronobacter spp. – 2,2%, Raoultella spp. – 2,2%, Leclercia adecarboxylata – 1,5%, Serratia spp. – 0,7%, Klebsiella spp. – 0,7%.

Результаты биохимической идентификации показали, что все изоляты E. coli ферментировали глюкозу и маннит, не обладали уреазной активностью, не утилизировали цитраты, не продуцировали сероводород, не ферментировали триптофандеаминазу и желатиназу, не сбраживали инозит и амигдалин. Ферментировали β-галактозидазу, а также не продуцировали ацетоин 99,1% изолятов, образовывали индол 95,4% изолятов. Сорбит, рамнозу, мелибиозу и арабинозу сбраживали более 91% изолятов. Не ферментировали аргининдигидролазу 85,3% изолятов, орнитиндекарбоксилазу 54,1% изолятов. Не сбраживали сахарозу 51,4% изолятов. Ферментировали лизиндекарбоксилазу 84,4% изолятов E. coli.

Результаты биохимической идентификации E. coli и других представителей БГКП соответствовали данным, представленным в систематическом справочнике Берджи по бактериологии.

Дополнительно идентификацию выделенных культур осуществляли методом времяпролетной масс-спектрометрии. Было установлено совпадение в идентификации изолятов бактерий масс-спектро-метрическим и биохимическим (с применением набора API 20 E) методами в 100% случаях. Все изоляты БГКП были идентифицированы на масс-спектрометре MALDI Autof MS 1000 с коэффициентом точности от 9,0 до 9,72, что свидетельствует о высокой достоверности идентификации.

При определении чувствительности изолятов БГКП к АМП обнаружили (рис. 2), что 100% изолятов проявили чувствительность к карбапенемам (меропенему, имипенему), 94% изолятов – к тикарциллину/клавуланату и амикацину, 92,5% изолятов – к цефаклору, 91,8% – к цефепиму и гентамицину, 88,8% – к цефтазидиму, 85,1% – к цефтриаксону, 83,6% – к цефотаксиму, 82,8% – к цефуроксиму.

Наибольшую устойчивость изоляты БГКП показали к налидиксовой кислоте (45,5% изолятов), левофлоксацину (38,1% изолятов), цефалотину (резистентны 37,3%, промежуточную чувствительность имеют 20,1% изолятов), ципрофлоксацину (резистентны 36,6% изолятов), тетрациклину (резистентны 34,3%, промежуточную чувствительность имеют 29,1% изолятов).

Результаты нашей работы подтверждены рядом научных статей. В 2024 г. было опубликовано исследование, в котором установлена высокая степень резистентности изолятов E. coli, выделенных в 2022 г. в Китае, к ципрофлоксацину (61,4%) и цефепиму (25,1%). Устойчивость к цефтриаксону была выявлена у 9,7% изолятов. Показатели устойчивости к имипенему и меропенему увеличились с 1,0% в 2019 г. до 1,6% в 2022 г. [16]. Из пищевой продукции в Чили в 2021 г. выделены изоляты E. coli, обладающие резистентностью к хлорамфениколу (5,6%) [17]. В Италии в период с 2010 по 2018 г. из пищевой продукции выделены изоляты, устойчивые к гентамицину, хлорамфениколу, ко-тримоксазолу, тетрациклину и налидиксовой кислоте. В Бразилии в 2010–2019 гг. из мяса выделены изоляты энтеробактерий, резистентные к аминогликозидам, β-лактамам, тетрациклинам и хинолонам. Из мяса птицы в Корее в 2019 г. выделены изоляты, устойчивые к налидиксовой кислоте, ципрофлоксацину, тетрациклину, хлорамфениколу, ко-тримоксазолу и гентамицину [27].

В 2018 г. С. А. Шевелёвой были опубликованы результаты исследований устойчивости к АМП изолятов, выделенных из мясной и молочной продукции. В процессе проведенной работы были выделены изоляты энтеробактерий, обладающие резистентностью к тетрациклинам (45–63%), ампициллину (42%), фторхинолонам (до 20%) [28].

В 2022 г. М. М. Сибиркина и соавт. представили результаты исследования устойчивости к АМП бактерий, обнаруженных в пищевой продукции животного происхождения, представленной на рынках Московского региона. В процессе работы были выделены изоляты семейства Enterobacteriaceaе, резистентные к антибиотикам групп пенициллинов, хинолонов и аминогликозидов. Также авторами исследования была отмечена чувствительность выделенных изолятов к карбапенемам [29].

Результаты анализа распространенности устойчивости к АМП среди изолятов различных родов семейства Enterobacteriaceaе представлены в таблице 2.

Изоляты E. coli наибольшую устойчивость проявили к налидиксовой кислоте (53,2%), левофлоксацину (45,0%), ципрофлоксацину (43,1%) и тетрациклину (40,4%).

Изоляты Citrobacter spp. показали резистентность к амоксициллину/клавуланату (37,5%), цефалотину (37,5%), цефокситину (37,5%), а также к цефазолину (25,0%).

У изолятов Enterobacter spp. была определена устойчивость к цефалотину (85,7%), амоксициллину/клавуланату (71,4%), цефазолину (71,4%) и цефокситину (71,4%).

Изоляты Cronobacter spp. проявили устойчивость к тикарциллину/клавуланату (66,7%), а также к таким антибиотикам, как ампициллин/сульбактам, амоксициллин/клавуланат, налидиксовая кислота, офлоксацин, ципрофлоксацин и левофлоксацин.

Изоляты Raoultella spp. и Leclercia adecarboxylata продемонстрировали чувствительность ко всем АМП, включенным в эксперимент.

В настоящее время в мире остро стоит вопрос об устойчивости бактерий семейства Enterobacteriaceaе к антибиотикам группы цефалоспоринов, особенно к цефалоспоринам III и IV поколения [30][31]. Согласно данным, представленным в таблице 2, устойчивость к цефалоспоринам I поколения наблюдали у (26,15 ± 5,95)% изолятов E. coli, к цефалоспоринам II поколения – у (10,3 ± 4,1)% изолятов, к цефалоспоринам III поколения – у (8,6 ± 2,8)% изолятов, к цефалоспоринам IV поколения – у 5,5% изолятов. Таким образом, установлено снижение доли резистентных изолятов E. coli в зависимости от того, к какому поколению относится применяемый антибактериальный препарат. При этом стоит отметить, что выявление в пищевой продукции бактерий E. coli, устойчивых к цефалоспоринам III и IV поколения, должно послужить основанием для ужесточения надзорных мероприятий по применению ветеринарных препаратов при производстве животноводческой продукции.

Среди представителей родов Citrobacter spp., Enterobacter spp., Cronobacter spp., Raoultella spp., Leclercia adecarboxylata, Serratia spp. и Klebsiella spp. изолятов, устойчивых к цефалоспоринам III и IV поколения, не обнаружено.

При анализе антибиотикорезистентности были выявлены изоляты БГКП, резистентные к трем и более лекарственным препаратам (полирезистентные) и устойчивые к 10 и более АМП (экстремально резистентные).

Из данных, представленных в таблице 3, видно, что полирезистентностью обладали изоляты бактерий E. coli, Citrobacter spp., Enterobacter spp., Cronobacter spp., а также Serratia spp. Однако экстремально резистентные изоляты обнаружены только среди бактерий E. coli.

При анализе продукции, из которой были выделены обладающие полирезистентностью бактерии (рис. 3), было установлено, что 88,7% изолятов получены при исследовании образцов продукции животного происхождения, из них 76,1% изолятов обнаружены в продуктах из мяса птицы. Кроме того, полирезистентные изоляты были выделены из питьевой воды (9,9%) и пряностей (1,4%).

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что пищевая продукция животного происхождения, в особенности продукция птицеводства, является одним из основных путей передачи антибиотикорезистентных микроорганизмов. Эти данные согласуются с результатами наблюдений многих авторов [27][28][30][32] и указывают на то, что высокая распространенность БГКП, устойчивых к АМП, в мясе птицы может быть обусловлена особенностями технологического процесса получения мяса бройлеров, при котором только зоотехническими методами не всегда удается достичь эффективного результата.

В 2019 г. в Германии был опубликован ряд научных исследований, в которых установлено, что у большинства изолятов E. coli (до 71,9%), выделенных из мяса птицы, были обнаружены β-лактамазы расширенного спектра действия (ESBL), обеспечивающие устойчивость бактерий к цефалоспоринам. Уровень выявления ESBL-продуцирующих эшерихий в говядине и свинине был значительно ниже и составлял до 12,1%.

В 2019–2021 гг. И. Донник было проведено обследование объектов животноводства в России для анализа распространенности антибиотикорезистентных изолятов энтеробактерий. В ходе данного исследования была установлена резистентность энтеробактерий к тетрациклинам (до 92% изолятов) и пенициллинам (до 67% изолятов), а также к цефалоспоринам III поколения, карбапенемам, фторхинолонам и аминогликозидам [7].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе исследований 2667 образцов пищевой продукции и воды в отделе микробиологических исследований Владимирской испытательной лаборатории ФГБУ «ВНИИЗЖ» было выделено 134 изолята БГКП. В результате идентификации микроорганизмов было установлено, что данные энтеробактерии являются представителями родов Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Cronobacter, Leclercia, Serratia, Klebsiella, Raoultella.

При определении устойчивости к АМП была установлена 100%-я чувствительность изолятов БГКП к антибиотикам группы карбапенемов. Наибольшую устойчивость выделенные изоляты показали к следующим группам АМП: хинолоны, фторхинолоны, цефалоспорины и тетрациклины.

Среди изолятов E. coli наибольшая резистентность отмечена к антибиотикам группы хинолонов, фторхинолонов и тетрациклинов. Изоляты Citrobacter spp. и Enterobacter spp. проявили устойчивость к АМП группы пенициллинов и цефалоспоринов. Изоляты Cronobacter spp. продемонстрировали резистентность к антибиотикам группы пенициллинов, хинолонов и фторхинолонов.

В процессе оценки степени устойчивости изолятов к антибиотикам было установлено, что полирезистентностью обладали изоляты E. coli, Citrobacter spp., Enterobacter spp., Cronobacter spp., Serratia spp. К экстремально резистентным были отнесены только изоляты E. coli. Изоляты бактерий Raoultella spp., Leclercia adecarboxylata и Klebsiella spp. проявили чувствительность ко всем используемым в ходе эксперимента антибиотикам.

В результате проведенного исследования установлено, что изоляты со множественной лекарственной устойчивостью преимущественно выделяли из образцов мяса птицы. Данный факт свидетельствует о том, что высокая частота обнаружения БГКП, резистентных к антибиотикам, в мясе птицы, может быть связана с особенностями технологии производства мяса бройлеров.

Вклад авторов: Юлдашева А. Н. – проведение исследований, анализ результатов, подготовка текста статьи; Шадрова Н. Б. – дизайн исследований, редактирование текста статьи; Прунтова О. В. – научное консультирование.

Contribution of the authors: Yuldasheva A. N. – study conducting, results analysis, paper text preparation; Shadrova N. B. – study design, paper text editing; Pruntova O. V. – scientific assistance.