Исследование биологических свойств экзотического штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» вируса ящура генетической линии O/EA-3, выявленного на территории Северной Африки

ВВЕДЕНИЕ

Ящур считается сверхопасным вирусным заболеванием парнокопытных животных, приводящим к глобальным экономическим потерям в производстве мясной и молочной продукции во многих государствах мира [1][2]. Возбудителем ящура является вирус вида Aphthovirus vesiculae (foot-and-mouth disease virus, FMDV) рода Aphthovirus семейства Picornaviridae. В настоящее время отмечают существование семи серотипов вируса ящура: А, O, С, Азия 1, SAT 1, SAT 2 и SAT 3. Геном вируса ящура представлен одноцепочечной молекулой РНК с положительной полярностью, размером 8450–8520 н. о., которая кодирует следующие структурные белки: VP₁, VP₂, VP₃, VP₄ [3][4][5].

Распределение серотипов вируса ящура на земном шаре неравномерное. На территории государств Африканского материка заболеваемость обуславливается такими серотипами, как SАТ 1, SАТ 2, SАТ 3, А и О. Следует отметить, что изоляты вируса ящура серотипа О наиболее часто встречаются в странах Восточной, Западной, Центральной и Южной Африки, а также на территории Ближнего Востока и Азиатского континента [6][7][8][9][10].

Изоляты и штаммы вируса ящура серотипа О являются самыми распространенными в мире и представлены 11 топотипами, которые встречаются на территории Западной и Восточной Африки, Юго-Восточной Азии, Европы, Ближнего Востока и Южной Америки [11][12][13].

Для вируса ящура характерны такие явления, как мутационная и модификационная изменчивость, особенно для изолятов и штаммов серотипа О. По этой причине данный серотип включает в себя топотипы, генетические линии и сублинии, различия между которыми определяют при анализе нуклеотидной последовательности гена 1D, кодирующего высоковариабельный протеин VP₁ [14][15][16].

Более 92% аминокислотных замен отмечается в структурном белке VP₁. Наиболее вариабельными областями являются участки 40–60, 141–160 (G–H петля) и 190–213 а. о. (С-конец) [17]. Участок поверхностного белка VP₁ в регионе 141–160 а. о. отличается наиболее высокой вариабельностью, поскольку отвечает за один из важнейших этапов жизненного цикла вируса ящура – адсорбцию на поверхности клетки [5][7][18][19].

Учитывая наличие торгово-экономических отношений Российской Федерации со странами Африканского континента, в частности Алжиром, Египтом, Ливией, Марокко и Тунисом, высоки риски заноса изолятов серотипа О на территорию нашей страны, это угрожает биологической безопасности России по ящуру.

Как показывают результаты анализа вспышек ящура, которые регистрировались на территории Африки, все они были вызваны вирусом генотипа O/EA-3: в Алжире – в 2018, 2019 и 2022 гг., в Египте – в 2013–2017 и 2021 гг., в Ливии – в 2019 и 2023 гг., в Марокко – в 2019 г., в Тунисе – в 2019 и 2022 гг., в Сенегале – в 2018 г. [5][6][8][9][10]. В настоящее время эпизоотическая ситуация по ящуру данной генетической линии остается напряженной, поэтому актуальным является исследование биологических свойств штаммов возбудителя линии O/EA-3.

Цель работы заключалась в исследовании биологических свойств штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» вируса ящура генетической линии O/EA-3, выявленного на территории Северной Африки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирус ящура. Изолят «O/TUN 19/2019» вируса ящура был выделен в пробах от крупного рогатого скота (КРС) на территории Тунисской Республики в 2019 г. В ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» вирусный материал поступил для анализа в 2020 г. При проведении научных исследований штамм был охарактеризован и получил название «О/ЕА-3/Тунис/2019».

Клеточные линии. Процесс выделения вируса ящура указанного штамма осуществляли в перевиваемых монослойных линиях клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30, почки свиньи IB-RS-2, почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21. В исследовании применяли также перевиваемую суспензионную культуру клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH [20].

Животные. В экспериментах использовали следующих животных:

а) КРС массой по 260–310 кг (7 гол.);

б) свиньи массой по 35–40 кг (2 гол.);

в) кролики массой по 2,8–3,0 кг (20 гол.).

Этический статус. Исследования с участием животных проводили в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей. Проект исследования одобрен Комиссией по биоэтике ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Определение генетической принадлежности штамма вируса ящура проводили с помощью реакции секвенирования на генетических анализаторах Applied Biosystems (США) при автоматизации пробоподготовки продуктов реакции с использованием станции Freedom EVO-2 100 Bas (Tecan, Швейцария).

Определение антигенного родства (r₁) в реакции микронейтрализации (РМН). Титр референтных сывороток крови КРС, полученных в результате двукратной иммунизации животных культуральными инактивированными моновалентными вакцинами, содержащими антиген производственных штаммов вируса ящура серотипа О, против гомологичного и гетерологичного вируса в дозе 2,0 lg ТЦД₅₀, определяли в РМН и выражали в lg SN₅₀. Значение r₁ рассчитывали как разность антилогарифма lg SN₅₀ титров вируснейтрализующих антител сыворотки крови против гетерологичного и гомологичного штаммов вируса ящура [3].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥ 0,3 – сравниваемые штаммы вируса ящура имеют близкое родство;

при < 0,3 – сравниваемые штаммы значительно отличаются друг от друга.

Определение инфекционной активности посевного материала штамма вируса ящура проводили микрометодом в культуральных 96-луночных планшетах в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения животных (ВОЗЖ) [3].

Реакция связывания комплемента (РСК). Исследование антигена вируса ящура указанного штамма для определения содержания полных вирусных частиц осуществляли с помощью количественного варианта РСК [3]. Данную реакцию также применяли для определения типоспецифичности и активности штамма вируса.

Реакция микронейтрализации (РМН). Титр вируснейтрализующих антител (ВНА) в пробах сыворотки крови животных определяли с помощью РМН с использованием монослоя перевиваемой клеточной линии почки свиньи IB-RS-2 в соответствии с процедурой, отраженной в Руководстве по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных ВОЗЖ [3].

Получение и контроль качества антигена вируса ящура. Для изготовления антигена осуществляли культивирование вируса ящура в перевиваемой суспензионной клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Титр инфекционной активности вирусной суспензии должен быть не менее 6,00 lg ТЦД₅₀/см³. Полученную вирусную суспензию инактивировали и осветляли.

Концентрирование антигена вируса ящура проводили с применением 6–8% полиэтиленгликоля 6000 (ПЭГ 6000) с добавлением 0,85%-го хлорида натрия в течение 24 ч при температуре 2–8 °С по стандартной технологии [21].

Для изготовления сыворотки крови кролика против антигена штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» вируса ящура серотипа О применяли 20 клинически здоровых особей. Трехкратную иммунизацию животных осуществляли с использованием концентрированного и очищенного антигена вируса ящура, изготовленного, как описано выше.

Статистическая обработка данных. Данные результатов исследования обрабатывали методами вариационной статистики с использованием программ Statistica и Microsoft Excel [22][23][24].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Учитывая распространение ящура в странах – торговых партнерах Российской Федерации, были детально изучены биологические свойства штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019», выделенного на территории Северной Африки.

Исследование генетической принадлежности штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» вируса ящура. По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей установлено, что штамм «О/ЕА-3/Тунис/2019» вируса ящура принадлежит серотипу О, топотипу EA-3 (рис. 1).

Анализируя аминокислотные последовательности вирусного протеина VP₁ для штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019», выявили точечные мутации, представленные в таблице 1: в высоковариабельной области 40–60 а. о. имеются 2 замены, в диапазоне 130–160 а. о. – 4 замены, из них 2 – в диапазоне G–H петли (141–160 а. о.), находящейся в области рецептора, на С-конце (190–213 а. о.) – 2 замены. Представленные аминокислотные замены могут привести к изменению биологических свойств штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» вируса ящура по сравнению с другими изолятами и штаммами серотипа О.

Исследование биологических свойств вируса ящура штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» при репродукции в монослойных перевиваемых клеточных культурах. Выделение изолята «O/TUN 19/2019» вируса ящура осуществляли в перевиваемых монослойных культурах клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30, почки свиньи IB-RS-2 и почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 в течение 5 последовательных пассажей. Результаты адаптации вируса указанного штамма к представленным клеточным культурам продемонстрированы в таблице 2.

Установлено, что репродукция штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» вируса ящура эффективнее происходит при культивировании в монослойной клеточной линии ПСГК-30: титр инфекционной активности – (7,50 ± 0,10) lg ТЦД₅₀/см³.

Исследование биологических свойств вируса ящура штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» в организме КРС и свиней. Заражали КРС (2 гол.) исходным штаммом вируса ящура интрадермолингвально (I пассаж). Адаптацию и наработку вируса ящура штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» с последующим титрованием осуществляли на КРС. Титр инфекционной активности на КРС составил 5,00 lg ИД₅₀/0,1 см³. Аналогичная работа проведена на свиньях, титр инфекционной активности был равен 4,75 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Изучение биологических свойств штамма вируса ящура «О/ЕА-3/Тунис/2019» при репродукции в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH. По окончании репродукции указанного штамма вируса ящура концентрация общего вирусного белка в суспензии составила (2,78 ± 0,20) мкг/см³. При концентрации клеток линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, равной (4,05 ± 0,18) млн кл/см³, дозе заражения 0,005 ТЦД₅₀/кл и продолжительности репродукции вируса (10,50 ± 0,25) ч средний титр инфекционной активности возбудителя ящура был на уровне (7,99 ± 0,15) lg ТЦД₅₀/см³, содержание 146S компонента – (2,10 ± 0,14) мкг/см³ (n = 3, Mean ± SD, p < 0,01).

Определение типовой специфичности и активности штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» вируса ящура в реакции связывания комплемента проводили с применением сывороток крови морских свинок на производственные штаммы вируса ящура «О/ЕА-3/Тунис/2019», «О № 2241/Эфиопия/2011», «А № 2029/Турция/06», «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1/Танзания/2012», «SAT-2/SAU/7/2000», «SAT-3/Бечуаналенд/65». По результатам исследования выявлено, что штамм «О/ЕА-3/Тунис/2019» вируса ящура обладает выраженной типовой специфичностью, относится к серотипу O и активен в РСК в разведении 1:64 (n = 3, p < 0,01).

Получение антигена вируса ящура штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» проводили, как указано выше. Результаты спектрометрического исследования полученных фракций вируса ящура штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» после ультрацентрифугирования представлены в таблице 3. Анализ проводили для всех фракций, высокие значения оптической плотности наблюдали для фракций 4–11 с максимальными значениями для фракции № 8 (1,985 ± 0,002 о. е., n = 3, Mean ± SD, p < 0,01).

По результатам белкового гель-электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях получен очищенный 100-кратный антиген вируса ящура штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019».

Данный антиген использовали в качестве компонента при проведении РСК для детекции антигена вируса ящура штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» в исследуемых пробах инактивированного сырья при изготовлении вакцинных препаратов. Для определения диагностической чувствительности теста анализировали 325 заведомо положительных проб антигена, в результате анализа было подтверждено, что все они положительные. Для исследования специфичности РСК тестировали 205 отрицательных образцов антигена вируса ящура, все они идентифицированы как отрицательные. Пользуясь статистическими методами анализа [22][23][24], определили, что в 95%-м доверительном интервале диагностическая чувствительность составляла 98,41–100,00%, диагностическая специфичность – 98,32–100,00%, общая точность – 99,37–100,00%.

Получение штаммоспецифических сывороток кролика. Исследуемый антиген применяли для иммунизации 20 кроликов, активность сывороток крови которых в РСК составила 1:2000. Данный показатель является высоким и свидетельствует о пригодности сывороток для изготовления средств диагностики для выявления антигена вируса ящура и определения вирусоспецифических антител.

Полученные сыворотки объединили в общий пул и подвергли лиофилизации. Данный антительный вирусоспецифический препарат использовали для проведения РСК для детекции антигена вируса ящура штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019». Для определения диагностической чувствительности реакции анализировали 390 проб антигена, которые являлись заведомо положительными. Для исследования специфичности реакции тестировали 220 отрицательных проб. В 95%-м доверительном интервале диагностическая чувствительность составила 99,10–100,00%, диагностическая специфичность – 98,35–100,00%, общая точность – 99,38–100,00%.

В результате была создана диагностическая тест-система, включающая штаммоспецифические сыворотки крови кролика для определения антигена вируса ящура штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» в РСК.

Применение антигена вируса ящура штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» для изготовления вакцины. Из полученного антигена приготовили сорбированную вакцину и в цельном виде ввели 5 гол. КРС. На 21-е сут после иммунизации отобрали кровь, получили сыворотки, которые исследовали на наличие антител к вирусу ящура штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» в РМН. Результаты отражены в таблице 4, из которой следует, что среднее значение титра вируснейтрализующих антител в РМН составило (2,18 ± 0,07) lg SN₅₀ (положительно при титре вируснейтрализующих антител ≥ 1,65 lg SN₅₀). Таким образом, антиген вируса данного штамма можно применять для создания вакцины, обеспечивающей защиту от инфицирования вирусом ящура указанного штамма.

Исследование степени антигенного родства (r₁) в РМН. Антигенное родство (r₁) штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» вируса ящура анализировали в РМН с применением специфических сывороток, полученных на указанные ниже производственные штаммы:

– «О № 2212/Приморский/2014» (генетическая линия O/SEA/Mya-98);

– «О № 2047/Саудовская Аравия/2008» (генетическая линия O/ME-SA/PanAsia2);

– «О № 2356/Пакистан/2018» (генетическая линия O/ME-SA/PanAsia2);

– «O/TUR/5/2009» (генетическая линия O/ME-SA/PanAsia2);

– «О № 2147/Приморский/2012» (генетическая линия O/ME-SA/PanAsia);

– «О № 2311/Забайкальский/2016» (генетическая линия O/ME-SA/Ind-2001d);

– «О № 1715/Тайвань/1997» (генетическая линия O/CATHAY/CAM 94);

– «О/Парагвай/2011» (генетическая линия O/EURO-SA);

– «О/Кения/2017» (генетическая линия O/EA-2);

– «O № 2241/Эфиопия/2011» (генетическая линия O/EA-3).

Показатель антигенного родства при изучении штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» составлял 0,01–0,54, что свидетельствовало об отсутствии близкого антигенного родства с большинством вакцинных штаммов вируса ящура серотипа О, кроме генетических линий O/ME-SA/PanAsia2 (гетерологичная генетическая линия) и O/EA-3 (гомологичная генетическая линия). Результаты исследования отражены в таблице 5.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведено изучение биологических свойств штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» вируса ящура. В результате сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей установлена принадлежность данного штамма к генетической линии O/EA-3. При анализе аминокислотных последовательностей белка VP₁ эпизоотических изолятов и производственных штаммов вируса ящура серотипа О для штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» выявили существенные аминокислотные замены в высоковариабельных областях 40–60, 130–160 и 190–213 а. о.

Установлено отсутствие близкого антигенного родства штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» с большинством вакцинных штаммов вируса ящура серотипа О, кроме штаммов гетерологичной O/ME-SA/PanAsia2 и гомологичной O/EA-3 генетических линий (r₁ = 0,01–0,54).

При исследовании биологических свойств указанного штамма вируса ящура выявлено, что в монослойной культуре клеток ПСГК-30 за (17,00 ± 0,25) ч получали вирусную суспензию с наибольшими показателями репродукции: активность в РСК составила 1:64, титр инфекционной активности – (7,50 ± 0,10) lg ТЦД₅₀/см³.

Определено, что вирус ящура штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» в организме КРС накапливался с титром инфекционной активности 5,00 lg ИД₅₀/0,1 см³, а в организме свиней – 4,75 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Выявлено, что при концентрации клеток линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, равной (4,05 ± 0,18) млн кл/см³, дозе заражения 0,005 ТЦД₅₀/кл и продолжительности репродукции вируса (10,50 ± 0,25) ч средний титр инфекционной активности возбудителя ящура составил (7,99 ± 0,15) lg ТЦД₅₀/см³, содержание 146S компонента – (2,10 ± 0,14) мкг/см³.

Установлено, что данный штамм обладает выраженной типовой специфичностью и активен в РСК в разведении 1:64.

Антиген вируса ящура штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019» использован для получения штаммоспецифических сывороток крови кролика (активность в РСК 1:2000) и изготовления биопрепарата, предназначенного для диагностики ящура серотипа О в РСК.

Данный антиген предложен для получения культуральной инактивированной моновалентной сорбированной вакцины, обеспечивающей защиту от заражения вирусом ящура штамма «О/ЕА-3/Тунис/2019»: среднее значение титра вируснейтрализующих антител в РМН составило (2,18 ± 0,07) lg SN₅₀.

Вклад авторов: Доронин М. И. – формирование идеи, формулировка и развитие ключевых целей и задач, проведение исследований, анализ и интерпретация полученных данных, подготовка и редактирование текста, принятие ответственности за все аспекты работы, целостность всех частей статьи и ее окончательный вариант; Кара Д. И. – проведение исследований, статистический анализ и интерпретация полученных данных, подготовка рисунков, обсуждение результатов; Борисов А. В. – научное консультирование, редактирование текста статьи; Гусева М. Н. – сбор статистических данных; Елькина Ю. С. – сбор статистических данных; Михалишин Д. В. – научное консультирование; Михалишин В. В. – научное консультирование; Оковытая Т. В. – подготовка рисунков; Никифоров В. В. – подготовка и редактирование текста; Фомина С. Н. – подготовка рисунков.

Contribution of the authors: Doronin M. I. – conceptualization, formulation and development of the key objectives and tasks, investigations, analysis and interpretation of the obtained data, preparation and editing of the manuscript, taking responsibility for all aspects of the work, integrity of all parts of the article, and for its final version; Kara D. I. – investigations, statistical analysis and interpretation of the obtained data, data visualization, discussion of the results; Borisov A. V. – scientific consultation, manuscript editing; Guseva M. N. – collection of statistical data; El’kina Yu. S. – collection of statistical data; Mikhalishin D. V. – scientific consultation; Mikhalishin V. V. – scientific consultation; Okovytaya T. V. – data visualization; Nikiforov V. V. – preparation and editing of the manuscript; Fomina S. N. – data visualization.