Тест-система для дифференциации вирусов гриппа птиц и ньюкаслской болезни в органах больных и павших кур

ВВЕДЕНИЕ

Ньюкаслская болезнь (НБ) является одной из самых распространенных инфекционных болезней птиц и встречается на всех континентах, за исключением Антарктиды. Вирус ньюкаслской болезни (ВНБ) оболочечный, с несегментированной однонитчатой (–)РНК относится к семейству Paramyxoviridae [1]. По патогенности для цыплят штаммы ВНБ подразделяются на апатогенные, лентогенные, мезогенные и велогенные. Велогенный вирус вызывает нейротропную или висцеротропную инфекцию в зависимости от локализации. У инфицированной птицы повышается температура, пропадает аппетит, птица выглядит вялой, малоактивной, много спит, возникает поражение дыхательной системы с признаками удушья. В случае висцеротропной инфекции главным образом поражается желудочно-кишечный тракт. Наблюдается некроз тканей селезенки и печени, появление кровоточащих язв в кишечнике. Помет жидкий, зеленого цвета. Из клюва выделяется тягучая серая слизь, птица чихает и совершает глотательные движения. Могут возникать массовые конъюнктивиты. Перед смертью при нейротропной инфекции часто наблюдаются тремор мышц, искривление шеи, опистотонус. Наиболее характерной клинической картиной при заражении ВНБ, в отличие от инфицирования другими высокопатогенными вирусами птиц, является обширное поражение лимфоидной ткани. Смертность может достигать 100% [2][3]. ВНБ относится к виду Orthoavulavirus javaense (OAVJ, ранее известный как AOAV-1) рода Orthoavulavirus и филогенетически делится более чем на два десятка генотипов. C момента открытия вируса в 30-х гг. XX в. зафиксировано 4 панзоотии, последняя из которых, вызванная генотипами V, VI, VII, VIII, продолжается в настоящее время. В последние годы в Африке и Евразии наблюдались многочисленные вспышки НБ, вызываемые вирусом VII генотипа (субгенотип VII.1.1) [4]. В России зарегистрированы десятки вспышек, при этом, по всей вероятности, большое их количество осталось незарегистрировано [5]. Вирусы заносятся на птичьи дворы дикими птицами, которые в сельской местности свободно кормятся вместе с курами [6]. Методами борьбы с НБ являются вакцинация и карантинные меры.

Высокопатогенный грипп птиц не только наносит громадный экономический ущерб птицеводству, но и представляет угрозу здоровью животных и человека [7]. В Америке вирус гриппа птиц (ВГП) субтипа H5 вызывал многократные вспышки среди млекопитающих (лис, тюленей, енотов и других). Более того, ВГП стал поражать дойных коров с выделением большого количества инфекционного агента в молоко. Риск межвидовой передачи возбудителя и его адаптации к человеку при этом возрос многократно [8].

Подтипы H5 и H7 ВГП являются причиной многочисленных вспышек заболеваний среди диких и домашних птиц и гибели не менее 422 млн домашних птиц с 2005 г. Они вызвали 2634 случая заболевания людей по всему миру, включая более 1000 случаев смерти [9]. ВГП распространяется перелетными дикими птицами, он стал причиной трех волн вспышек гриппа на нескольких континентах. Третья волна, начавшаяся в 2020 г., продолжается.

Своевременная регистрация вспышек НБ и гриппа птиц – необходимое условие предотвращения распространения вирусов. В последние годы разработано много методов экспресс-диагностики этих болезней. Для обнаружения ВГП и ВНБ была разработана методика иммунохроматографического анализа (ИХА) с использованием меченных золотом антител. Данный метод обладает высокой чувствительностью, а результат реакции учитывается визуально [10, 11]. Разработан тест с коллоидной золотой полоской (CGS) для обнаружения ВГП/H5, который может применяться в полевых условиях [12]. Также были разработаны ИХА-методики для детекции ВГП субтипа H9 [13]; для быстрого обнаружения возбудителя подтипа H7 с использованием моноклональных антител против вируса гриппа А/H7N9 [14][15] и для выявления представителей подтипа H6 [16]. Все методы, основанные на использовании стрипов, удобны при контроле за конкретной вспышкой – недорогие, быстрые и чувствительные. Однако, поскольку в их основе лежит использование моноклональных антител, они нацелены на конкретный патоген, и при внезапной вспышке заболевания неизвестной природы, скорее всего, окажутся непригодными.

Ранее мы описали метод детекции и дифференциации вируса гриппа птиц и парамиксовирусов птиц на 96-луночных панелях [17]. Детекция вирусов проводилась в аллантоисной жидкости после культивирования их в куриных эмбрионах. Однако для экспресс-диагностики в небольших птицеводческих хозяйствах востребованы методы, не требующие предварительного наращивания вируса.

Цель работы – разработка методики выявления на одном планшете разных субтипов вируса гриппа птиц и парамиксовируса в органах больных и павших птиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реагенты и растворы. В работе использовались: MycoKill AB (PAA Laboratories GmbH, Австрия); пероксидаза хрена (#P8375, Sigma-Aldrich, США); антитела против иммуноглобулинов мыши и курицы, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США); фетуин (#F3004, Sigma-Aldrich, США).

Растворы:

– фосфатно-солевой буфер – 0,02 М, pH 7,2 (PBS);

– PBS с добавлением 0,1 мг/мл канамицина, 0,4 мг/мл гентамицина, 0,01 мг/мл нистатина и 2%‑го раствора MycoKill AB;

– промывочный раствор – 0,01%‑й твин-80 в PBS;

– блокирующий раствор – 0,1%‑й раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА; 1 мг/мл) в PBS;

– реакционный буфер – 0,02%‑й твин-80 и 0,1%‑й БСА в PBS;

– субстратный раствор – 1 мг 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ) и 10 мкл 30%‑й перекиси водорода в 10 мл 0,05 М буфера ацетата натрия, pH 5,5;

– стоп-раствор – 3%‑й водный раствор серной кислоты;

– растворы для синтеза препаратов, меченных пероксидазой хрена (HRP);

– свежеприготовленный 0,2 М раствор NaIO₄ в воде;

– 1 М и 0,1 М буферы карбоната натрия, pH 9,3;

– свежеприготовленный раствор NaBH₄ в воде (5 мг/мл);

– 1 М Трис-буфер, pH 6,0;

– 0,1 М Трис-буфер, pH 7,2.

Животные. Куриные эмбрионы (КЭ) поступили с птицефабрики «Птичное» (г. Москва), куры – с птицефабрики «Томилинская» (Московская область). Работа с живыми вирусами проводилась в помещении биологической безопасности 3‑го уровня. Все испытания осуществлялись в соответствии со стандартом, регулирующим содержание и уход за лабораторными животными ГОСТ 33215-2014¹.

Вирусы. Апатогенные штаммы ВГП и парамиксовирусы выделяли из фекалий уток в ходе многолетнего мониторинга гриппа птиц в популяции кряквы. Свежие фекалии, собранные на берегах прудов г. Москвы [18], суспендировали в двойном объеме PBS с добавлением антибиотиков: 0,4 мг/мл гентамицина, 0,1 мг/мл канамицина, 0,01 мг/мл нистатина и 2%‑го раствора MycoKill AB. После центрифугирования в течение 10 мин при 4000 об/мин супернатантом заражали 10-суточные КЭ. Через 48 ч собирали вируссодержащую аллантоисную жидкость (ВАЖ) и отбирали пробы, положительные в реакции гемагглютинации (РГА), которые проходили трехкратное пассирование.

Высокопатогенный штамм ВНБ NDV/Chicken/Moscow/6081/2022 (ch6081) был выделен из почек погибших кур [18]. Для этого ткань растирали с мелкодисперсным стеклом, добавляли PBS с 0,1 мг/мл канамицина, 0,4 мг/мл гентамицина, 0,01 мг/мл нистатина и 2%-м раствором MycoKill AB, центрифугировали и заражали КЭ. Дважды в сутки контролировали гибель эмбрионов. У погибших КЭ отбирали ВАЖ. Полученный вирус клонировали и секвенировали [19].

Высоковирулентные штаммы ВГП А/chicken Kurgan/3/2005 (H5N1) и А/FPV/Rostock/34 (H7N1) были любезно предоставлены доктором биологических наук С. С. Ямниковой (Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского, г. Москва).

Получение яиц, содержащих иммуноглобулины к ВНБ. Несушек заражали непатогенным штаммом NDV/Duck/Moscow/3639/2008 (d3639), добавляя в поилку 10⁹ ЭИД₅₀ вируса на курицу. Через 2 нед. кур инфицировали высокопатогенным штаммом NDV/chicken/Moscow/6081/2022 (ch6081). Через 2 нед. собирали яйца иммунизированных кур [20].

Приготовление иммуноглобулинов яичного желтка (IgY). Желтки 4 яиц отделяли от белков, тщательно удаляли халазы, дважды промывали в холодной дистиллированной воде и переносили в пластиковый контейнер с 40 мл PBS с pH 7,4. Тщательно перемешивали, добавляли H₂O до объема 250 мл, доводили pH до 4,2 с помощью 1 М раствора соляной кислоты и замораживали при –30 °C. Через 20 ч суспензию размораживали и центрифугировали в течение 30 мин при 10 000 g. Добавляли 1 г порошка активированного угля в супернатант, перемешивали в течение 30 мин и фильтровали через бумажный фильтр [20]. Добавляли в фильтрат сульфат аммония до 25% и выдерживали в течение 2 ч при +4 °C. Центрифугировали 30 мин при 10 000 g, растворяли осадки в 10 мл PBS, аликвотировали и хранили при –20 °C.

Получение антител к ВГП и ВНБ на мышах. Мышей инфицировали интраназально 50 мкл ВАЖ, содержащей 10⁷ ЭИД₅₀ ВГП или ВНБ, дважды с интервалом в 2 нед. Через 2 нед. осуществляли тотальный забор крови у мышей и получали сыворотку.

Выявление вируса гриппа в ВАЖ. 96-луночные планшеты покрывали раствором фетуина 5 мкг/мл, промывали водой и блокировали. В лунки добавляли двукратные разведения ВАЖ начиная с разведения 1:1 и инкубировали 2 ч при +4 °C. После промывки добавляли раствор фетуина, меченного HRP (Fet-HRP), в реакционном буфере и инкубировали планшеты 1 ч при +4 °C. Отмывали и проводили цветную реакцию с ТМБ. Результаты учитывали с использованием спектрофотометра Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, США) при длине волны 450 нм.

Выявление вирусов на плашках, сенсибилизированных для дифференциальной диагностики. Для выявления ВГП и ВНБ 96-луночную плашку сенсибилизировали следующим образом. Ряды 1 и 12 не сенсибилизировали – они служили отрицательным контролем. Ряды 2–4 сенсибилизировали фетуином, а ряды 5 и 6 – анти-ВНБ IgY, который для ВГП служил вторым отрицательным контролем. Ряды 9–11 сенсибилизировали анти-ВНБ IgY, а ряды 7 и 8 – фетуином, который служил вторым отрицательным контролем для ВНБ. Панель, сенсибилизированную, как описано выше, блокировали раствором БСА. Затем в каждый ряд плашки вносили по 100 мкл вируссодержащего раствора в одинаковой концентрации (один и тот же раствор в 12 лунках). Таким образом, на панели можно было анализировать 8 разных образцов. После инкубации в течение 2 ч при +4 °C планшет промывали и добавляли в ряды 1–6 конъюгат Fet-HRP, а в ряды 7–12 – анти-ВНБ IgY-HRP в реакционном буфере и инкубировали в течение 1 ч при +4 °C. Отмывали и проводили цветную реакцию с ТМБ. Результаты учитывали на спектрофотометре Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, США) при длине волны 450 нм. В рядах 1–6 выявляли ВГП, а в рядах 7–12 – ВНБ.

Выявление вирусов в тканях кур. В эксперименте использовали 45 гол. кур породы леггорн, стандартизированных по возрасту и массе. Животные были разделены на равные группы: по 10 гол. в экспериментальных и по 5 гол. – в контрольных. Две группы были инфицированы ВГП (штаммы А/chicken/Kurgan/3/2005 H5N1 и А/FPV/Rostock/34 H7N1 соответственно), а одна группа – ВНБ (штамм NDV/Chicken/Moscow/6081/2022). Каждой экспериментальной группе соответствовала контрольная группа. Птицы содержались в отдельных клетках в разных помещениях в зависимости от группы. Всего использовали по 10 кур на точку. Для анализа патогенности вируса сначала птиц лишали воды на ночь. На следующий день в поилки добавляли 10 мл воды, содержащей 10⁸ ЭИД₅₀ тестируемых вирусов, и ставили в клетку с птицами. Контрольная группа получала обычную воду.

У погибших или подвергнутых эвтаназии кур извлекали органы (почки, легкие, кишечник), гомогенизировали в двойном объеме PBS и центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин. Супернатант использовали для дальнейшего анализа. Органы птиц контрольных групп обрабатывали идентично. Аликвоты супернатантов сохраняли для типирования вируса методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и титрования в КЭ, а остальной материал вносили в 12 лунок панели, подготовленной, как описано выше.

Выявление ВНБ с помощью анти-ВНБ IgY и их конъюгата с HRP. 96-луночный планшет покрывали раствором очищенного анти-ВНБ IgY 5 мкг/мл, промывали водой и блокировали в течение 1 ч раствором БСА. Затем в лунки добавляли испытуемые супернатанты гомогенизированных образцов в объеме 100 мкл и инкубировали 2 ч при +4 °C. Планшет промывали, добавляли конъюгат анти-ВНБ IgY-HRP в реакционном буфере и инкубировали 1 ч при +4 °C. После отмывки проводили цветную реакцию с ТМБ. Результаты учитывали на спектрофотометре Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, США) при длине волны 450 нм.

Синтез препаратов, меченных пероксидазой хрена. Синтез Fet-HRP детально описан M. N. Matrosovich and A. S. Gambaryan [21]. Конъюгация HRP с анти-ВНБ IgY проводилась в соответствии с предложенной методикой. Свежеприготовленный 0,2 М раствор NaIO₄ в воде добавляли к HRP в бидистиллированной воде и инкубировали в течение 20 мин в темноте при комнатной температуре. Реакционную смесь обессоливали на колонке с сефадексом G25, добавляли растворы фетуина или иммунного IgY в карбонатном буфере c pH 9,3 и инкубировали в течение 4 ч в темноте. Добавляли свежеприготовленный 5 мг/мл раствор NaBH₄ в воде и инкубировали в течение 30 мин на льду. Доводили pH до нейтрального с помощью 1 М Трис-буфера с pH 6,0 на льду. Проводили хроматографию на Sephacryl S-200, собирали фракции, содержащие HRP, смешивали и хранили аликвоты при –20 °C.

Выявление вирусов методом ПЦР. Наличие РНК ВГП и ВНБ в образцах определяли методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени в присутствии внутреннего контроля. Экстракцию РНК из биологического материала проводили с помощью коммерческого набора реагентов для выделения нуклеиновых кислот на магнитных частицах на основе сорбционного метода «ДНК/РНК-М-FLEX-ФАКТОР» (ООО «ВЕТ ФАКТОР», Россия). В работе для выявления наличия РНК ВГП и ВНБ использовали коммерческие наборы «ПЦР-ГРИПП-А-ФАКТОР» и «ПЦР-НЬЮКАСЛА-ФАКТОР» (ООО «ВЕТ ФАКТОР», Россия) соответственно. Матрицей для проведения ОТ-ПЦР служили пробы РНК, экстрагированные из исследуемого материала (образцы помета, фрагменты органов и тканей).

Этический статус. Исследования с участием животных проводили в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (г. Страсбург, 18.03.1986). Дизайн исследования одобрен этическим комитетом ФГАНУ «ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН» (разрешение № 4 от 02.12.2014). Принимались все меры для облегчения страданий животных.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В ходе мониторинга от перелетных птиц нами были изолированы десятки штаммов ВГП и парамиксовирусов [22]. Кроме того, при изучении вспышки заболеваний от кур в Московской области был выделен ВНБ [18]. Окончательная идентификация вирусов проводилась на основе полного или частичного секвенирования генома, но на первом этапе ВГП дифференцировали от ВНБ и APMV-4 (парамиксовирус птиц серотипа 4) с помощью твердофазного анализа (ТФА), технически аналогичного иммуноферментному анализу (ИФА). Представленные материалы описывают протоколы выявления и идентификации вирусов этим способом.

Дифференциация ВГП от парамиксовирусов. Выявление ВГП было основано на связывании вируса с сиалогликозильными остатками сывороточного белка эмбриона коровы (фетуином) [21]. ВАЖ инкубировали в лунках планшетов, сенсибилизированных фетуином. После сорбции и отмывки планшет инкубировали с раствором Fet-HRP и визуализировали с помощью цветной реакции. Окончательную идентификацию проводили путем частичного или полного секвенирования вируса. Все образцы ВГП были положительными в этом тесте, в то время как все парамиксовирусы были отрицательными (рис. 1).

Все вирусы были выделены из фекалий уток в Москве. Для ВГП указан субтип, для парамиксовирусов – класс. Во второй строке приводятся штаммы, которые обозначены лабораторным номером. В восьми лунках каждого ряда – двукратные разведения ВАЖ.

Субтипирование вируса гриппа в комбинированном тесте с фетуином и сыворотками крови мышей против ВГП разных подтипов. Сочетание связывания вируса с универсальным рецептором фетуина и детекции с использованием специфических антител упрощает определение подтипов тестируемых образцов ВГП. Пример подтипирования вируса штамма A/duck/Moscow/5908/2021 представлен на рисунке 2. Подтип вируса гриппа (H3N8) впоследствии был подтвержден секвенированием.

В лунки рядов планшетов B–H, сенсибилизированных фетуином, внесли аллантоисную жидкость, содержащую вирус A/duck/Moscow/5908/2021. Ряд А выступает в качестве контроля и не содержит вирус. Затем в каждый столбец добавляли двукратные разведения иммунных сывороток крови мышей. В последнем столбце титровали нормальную сыворотку крови мыши. На следующем этапе инкубировали планшеты с антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с HRP. После промывки проводили цветную реакцию, которая визуализирует связывание антител.

Детекция парамиксовирусов с помощью твердофазного анализа. После двукратной иммунизации кур апатогенным штаммом ВНБ первого генотипа NDV/duck/Moscow/3639/2008 (d3639) и последующим заражением велогенным штаммом NDV/chicken/Moscow/6081/2022 (ch6081) субгенотипа VII.1.1 собирали их яйца и получали IgY против ВНБ. IgY были сконцентрированы и очищены путем осаждения 25%-м сульфатом аммония и использованы для покрытия 96-луночных планшетов. Получали анти-ВНБ IgY, конъюгированные с HRP. В тесте с этими антителами все ВАЖ с ВНБ были положительными, в то время как все ВАЖ с ВГП и с APMV-4 были отрицательными (рис. 3).

Для вирусов гриппа указан субтип, для парамиксовирусов – класс. Во второй строке приводятся штаммы, которые обозначены номером. В восьми лунках каждого ряда – двукратные разведения ВАЖ.

Детекция вирусов в тканях органов больных кур. В трех вышеприведенных тестах регистрировали наличие ВГП или ВНБ в аллантоисной жидкости после их наработки в КЭ. Однако культивировать и проводить выделение вирусов в мелких птицеводческих хозяйствах невозможно, особенно в частных подворьях. Поэтому была изучена возможность выявления вирусов в экстрактах, полученных из тканей органов инфицированных кур. Экстракты вносили в 12 лунок 96-луночной панели, подготовленной, как описано в разделе «Выявление вирусов на плашках, сенсибилизированных для дифференциальной диагностики» раздела «Материалы и методы».

На рисунке 4 представлены результаты проведенного исследования.

Образцы, содержащие ВГП (ВАЖ А/chicken/Kurgan/3/2005 и экстракты почек цыплят, инфицированных А/chicken/Kurgan/3/2005 и А/FPV/Rostock/34), дают положительный сигнал в лунках, сенсибилизированных фетуином и выявленных Fet-HRP. Все прочие варианты сенсибилизации или выявления не дают достоверного сигнала с ВГП. Образцы, содержащие ВНБ (ВАЖ NDV/Duck /Moscow/3639/2008, фекалии цыплят, инфицированных NDV/Chicken/Moscow/6081/2022, и экстракты почек цыплят, инфицированных NDV/Chicken/Moscow/6081/2022), дают положительный сигнал в лунках, сенсибилизированных анти-ВНБ IgY и выявленных анти-ВНБ IgY-HRP. Все прочие варианты сенсибилизации или выявления не дают достоверного сигнала с ВНБ. Таким образом, одновременно можно дифференцировать высокопатогенные варианты вируса гриппа (H5N1 и H7N1) от вируса ньюкаслской болезни у больных кур.

Сопоставление твердофазного анализа с полимеразной цепной реакцией и с определением инфекционности на куриных эмбрионах. Сравнение описанного твердофазного метода выявления вирусов с ПЦР и с титрованием в КЭ показывает, что два последних намного чувствительнее (табл.). С помощью данных методов ВНБ регистрировали практически во всех тестируемых образцах начиная с 3‑го по 7‑й день после заражения NDV/Chicken/Moscow/6081/2022, а ТФА позволял выявлять вирус в фекалиях только на пике заболевания.

В образцах фекалий на 5‑й и 7‑й день эксперимента ВНБ и ВГП методом ТФА обнаружены не были, но предложенный тест показал 100%-ю выявляемость патогенов в образцах тканей органов птиц. Во всех образцах почек погибших либо подвергнутых эвтаназии на финальной стадии заболевания цыплят на панелях был выявлен вирус. Высокопатогенные ВГП и ВНБ накапливаются в почках инфицированных кур в очень высокой концентрации; при титровании в КЭ гомогенатов количество вирусов составило 10⁹ ЭИД₅₀/мл, что дает возможность выявлять их в ТФА (то есть чувствительность равна 10⁸ ЭИД₅₀/мл). Чувствительность разрабатываемого метода довольно низкая при исследовании образцов фекалий и на данном этапе не подходит для постановки предварительного диагноза. Однако падеж птицы в хозяйствах при инфицировании вышеупомянутыми патогенами наступает быстро, с разработанным тестом возможно безотлагательно и с высокой степенью достоверности установить причину заболевания и принять своевременные меры.

ОБСУЖДЕНИЕ

В последнее время грипп птиц и ньюкаслская болезнь приводят к значительным убыткам в птицеводческой промышленности по всему миру. За последние десятилетия ВГП субтипа Н5 распространился из Юго-Восточной Азии по всем континентам, включая Америку, что подтверждает необходимость эффективного мониторинга и диагностики заболеваний, вызванных этим опасным патогеном. Из Африки распространился ВНБ VII генотипа, вспышки заболевания фиксируются от Японии до Северо-Западной Европы [23]. Поскольку уничтожение всех домашних птиц в районе вспышек является основным методом сдерживания данных заболеваний, своевременное обнаружение очагов гриппа птиц и ньюкаслской болезни становится важным этапом [24].

Разработанный метод ТФА позволяет одновременно выявить и дифференцировать ВНБ и ВГП, что является важным шагом для своевременного принятия мер по контролю и профилактике заболеваний. Поскольку ВГП регистрируется с помощью универсального рецепторного аналога, а для обнаружения ВНБ использованы поликлональные антитела, полученные путем иммунизации кур ВНБ двух генотипов, можно предположить, что метод позволит выявлять различные штаммы ВГП и ВНБ, вызывающие гибель птицы, и проводить предварительную диагностику на месте. Тест-системы для обнаружения вируса гриппа, представленные на рынке, направлены на идентификацию ВГП только определенного субтипа, в то время как разработанный нами метод способен выявлять в фекалиях и патологическом материале одновременно разные субтипы, что существенно сократит время проведения диагностических исследований и позволит вовремя купировать распространение возбудителя заболевания в птицеводческом хозяйстве.

Разработка тест-системы для дифференциальной диагностики гриппа птиц и ньюкаслской болезни представляет собой важный шаг к совершенствованию контроля за оздоровлением птицеводства.

Дальнейшим этапом работы будет проведение валидации предложенного метода и тестирование его на практике в подсобных хозяйствах, а также сравнение с разработанными и утвержденными методиками идентификации ВГП и ВНБ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Циркуляция высокопатогенного ВГП подтипа H5N1 по всему миру и многочисленные вспышки НБ в Африке, Азии и Европе обусловили создание простого и быстрого метода обнаружения возбудителей в органах больной и павшей птицы. Разработанный метод позволяет выявлять и дифференцировать ВНБ и разные субтипы ВГП в фекалиях и тканях органов заболевших и павших кур.

Вклад авторов: Шустова Е. Ю. – поиск научной литературы, анализ и интерпретация данных, редактирование текста, работа со списком литературы; Гамбарян А. С. – разработка тест-системы, мониторинг/проверка информации, подготовка текста, работа со списком литературы; Боравлева Е. Ю. – участие в разработке тест-системы, редактирование материала; Трещалина А. А. – участие в разработке тест-системы, редактирование материала; Сейтаблаев А. А. – организация отбора материалов для исследования; Березовский С. И. – постановка ПЦР.

Contribution of the authors: Shustova E. Yu. – literature search, data analysis and interpretation, text review and editing, bibliography compilation; Gambaryan A. S. – test kit development, information monitoring/verification, original draft preparation, bibliography compilation; Boravleva E. Yu. – test kit development, text review and editing; Treshchalina A. A. – test kit development, text review and editing; Seitablaev A. A. – sample collection; Berezovsky S. I. – PCR testing.