Оптимизация условий транзиентной трансфекции производственных линий клеток млекопитающих для экспрессии антигена Е2 вируса классической чумы свиней

Введение. Несмотря на отсутствие в Российской Федерации с 2021 г. зарегистрированных случаев классической чумы свиней, для получения стату­са зоны, свободной от данного заболевания, необходимо внедрение эффективных и безопасных вакцин, соответствующих стратегии DIVA. В качестве потенциальных инструментов для создания рекомбинантной субъединичной вакцины рассматриваются различные системы экспрессии; перспективным представляется синтез антигена Е2 в клетках млекопитающих.
Цель исследования. Оптимизация условий транзиентной трансфекции производственных линий клеток млекопитающих для экспрессии антигена Е2 вируса классической чумы свиней.
Материалы и методы. Нуклеотидная последовательность, кодирующая фрагмент антигена Е2 протяженностью 188 а. о., была клонирована в вектор pVAX1. Транзиентная трансфекция проводилась двумя общедоступными методами: кальций-фосфатным и катионным (при помощи разветвленного полиэтиленимина) – в отношении трех производственных клеточных линий млекопитающих: CHO-K1, PK-15, BHK-21/13. Контроль эффективности экспрессии осуществлялся методами иммунофлуоресценции, количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, иммуноферментного анализа.
Результаты. Было установлено, что все рассматриваемые клеточные линии подвергались трансфекции с эффективностью от 60 до 90%. Выживаемость клеток через 24 ч после проведения трансфекции составляла не менее 87%, наименьшие показатели регистрировались при проведении кальцийфосфатной трансфекции с первичной инкубацией 12 ч. Проведение трансфекции во всех случаях сопровождалось экспрессией специфических матричных РНК. Наибольший выход рекомбинантного белка Е2 молекулярной массой 17,3 кДа был характерен для линии СНО-K1 (до 47,4 мг/л), наименьший – для линии BHK-21/13 (до 24,1 мг/л). Коэффициент специфичности в антигенном варианте непрямого иммуноферментного анализа со специфическими антисыворотками для всех вариантов экспрессируемого белка варьировал в диапазоне 5,1–6,2 ед.
Заключение. Все представленные в исследовании клеточные линии обладали удовлетворительной трансфицируемостью, что в совокупности с их свойствами (высокой скоростью пролиферации, адаптацией к бессывороточным средам) позволяет использовать их для стабильной экспрессии. И кальций-фосфатный метод, и катионный обеспечивают высокую эффективность трансфекции, относительно низкую цитотоксичность и воспроизводимость. Применение рассматриваемых методов контроля целесообразно в совокупности на этапе конструирования экспрессионных систем, однако в производственных условиях основным критерием их функциональности является тотальный выход специфического рекомбинантного белка, регистрируемый при помощи антигенного иммуноферментного анализа.

1. Mahadevaswamy R., Muruganantham V., Ramesh V., Mambully S., Suresh K. P., Hiremath J., et al. Global population dynamics and evolutionary selection in classical swine fever virus complete genomes: insights from Bayesian coalescent analysis. Virus Genes. 2025; 61 (4): 464–473. https://doi.org/10.1007/s11262-025-02154-2

2. Huang Y.-C., Deng M.-C., Huang Y.-L., Tsai K.-J., Liu H.-M., Liu I.-L., et al. Classical swine fever virus genotype 2.1 triggers stronger inflammatory and immune responses in porcine alveolar macrophages than genotype 3.4. Developmental and Comparative Immunology. 2025; 172:105496. https://doi.org/10.1016/j.dci.2025.105496

3. Blome S., Staubach C., Henke J., Carlson J., Beer M. Classical swine fever – an updated review. Viruses. 2017; 9 (4):86. https://doi.org/10.3390/v9040086

4. Yamashita M., Iwamoto S., Ochiai M., Yamamoto A., Sudo K., Narushima R., et al. Pathogenicity of genotype 2.1 classical swine fever virus isola­ ted from Japan in 2019 in pigs. Microbiology and Immunology. 2024; 68 (8): 267–280. https://doi.org/10.1111/1348-0421.13160

5. Ganges L., Núñez J. I., Sobrino F., Borrego B., Fernández-Borges N., Frías-Lepoureau M. T., Rodríguez F. Recent advances in the development of recombinant vaccines against classical swine fever virus: cellular responses also play a role in protection. The Veterinary Journal. 2008; 177 (2): 169–177. https://doi.org/10.1016/j.tvjl.2007.01.030

6. Алексеев К. П., Забережный А. Д., Верховский О. А., Мусиенко М. И., Шемельков Е. В., Южаков А. Г., Алипер Т. И. Вакцина субъединичная маркированная против классической чумы свиней, способ ее полу­ чения и применения. Патент № 2808703 Российская Федерация, МПК А61К 39/187, C12N 7/00. ООО «Ветбиохим». № 2023105741. Заявл. 13.03.2023. Опубл. 01.12.2023. Бюл. № 34.

7. Галеева А. Г., Ахунова А. Р., Хаммадов Н. И., Яруллина Г. М., Ефимова М. А. Гетерологичная экспрессия рекомбинантных антигенов вируса классической чумы свиней и цирковируса свиней 2-го типа. Ветеринария. 2024; (10): 25–31. https://doi.org/10.30896/0042-4846.2024.27.10.25-31

8. Hopkins R. F., Wall V. E., Esposito D. Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells. In: Protein Expression in Mammalian Cells. Methods in Molecular Biology. Ed. by J. L. Hartley. Vol. 801. Frederick: Humana Press; 2012; Chapter 16: 251–268. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-352-3_16

9. Ахунова А. Р., Насыров Ш. М., Галеева А. Г., Арутюнян Г. С., Ефимова М. А., Гулюкин М. И. Применение прямой реакции иммунофлуоресценции в технологическом контроле матричных расплодок вируса классической чумы свиней. Ветеринарный врач. 2024; (3): 27–33. https://elibrary.ru/mnswgm

10. Насыров Ш. М., Ахунова А. Р., Галеева А. Г., Яруллина Г. М., Самерханов И. И., Андреева А. В. Твердофазная иммуноферментная тест-система для производственного контроля специфичности рекомбинантного антигена вируса КЧС. Известия Оренбургского государственного аграрного университета. 2024; (3): 228–335. https://doi.org/10.37670/2073-0853-2024-107-3-228-235

11. Gebauer F., Hentze M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2004; 5 (10): 827–835. https://doi.org/10.1038/nrm1488

12. De Sousa Abreu R., Penalva L. O., Marcotte E. M., Vogel C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Molecular BioSystems. 2009; 5 (12): 1512–1526. https://doi.org/10.1039/b908315d

13. Greenbaum D., Colangelo C., Williams K., Gerstein M. Comparing protein abundance and mRNA expression levels on a genomic scale. Genome Biology. 2003; 4 (9):117. https://doi.org/10.1186/gb-2003-4-9-117

14. Kim T. K., Eberwine J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2010; 397 (8): 3173–3178. https://doi.org/10.1007/s00216-010-3821-6

15. Hua R.-H., Huo H., Li Y.-N., Xue Y., Wang X.-L., Guo L.-P., et al. Generation and efficacy evaluation of recombinant classical swine fever virus E2 glycoprotein expressed in stable transgenic mammalian cell line. PLoS ONE. 2014; 9 (9):e106891. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0106891

16. Tian H., Liu X., Wu J., Shang Y., Jiang T., Zheng H., Xie Q. Expression of major antigen domains of E2 gene of CSFV and analysis of its immunological activity. Virologica Sinica. 2008; 23 (4): 247–254. https://doi.org/10.1007/s12250-008-2956-5

17. Feng L., Chen L., Yun J., Cao X. Expression of recombinant classical swine fever virus E2 glycoprotein by endogenous Txnip promoter in stabl­e transgenic CHO cells. Engineering in Life Sciences. 2020; 20 (8): 320–330. https://doi.org/10.1002/elsc.201900147

18. Reinhart D., Damjanovic L., Kaisermayer C., Sommeregger W., Gili A., Gasselhuber B., et al. Bioprocessing of recombinant CHO-K1, CHO-DG44, and CHO-S: CHO expression hosts favor either mAb production or biomass synthesis. Biotechnology Journal. 2019; 14 (3):e1700686. https://doi.org/10.1002/biot.201700686

19. Opefi C. A., Tranter D., Smith S. O., Reeves P. J. Construction of stable mammalian cell lines for inducible expression of G protein-coupled receptors. Methods in Enzymology. 2015; 556: 283–305. https://doi.org/10.1016/bs.mie.2014.12.020

20. Tossolini I., López-Díaz F. J., Kratje R., Prieto C. C. Characterization of cellular states of CHO-K1 suspension cell culture through cell cycle and RNA-sequencing profiling. Journal of Biotechnology. 2018; 286: 56–67. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2018.09.007