Иммунологический контроль эффективности аэрозольной фитотерапии острой катаральной бронхопневмонии у телят

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время респираторные заболевания широко распространены в хозяйствах, особенно среди высокопродуктивных животных, при этом достаточно тяжело они протекают у молодняка [1-4]. Экономические потери в животноводческой отрасли при респираторных патологиях формируются прежде всего из-за падежа животных, снижения продуктивности у больных или выздоровевших, существенного замедления их роста и развития, а также затрат на их лечение и профилактику заболевания [5-7]. Бронхопневмония телят регистрируется практически во всех регионах страны и занимает второе место среди всех патологий в хозяйствах, уступая только желудочно-кишечным заболеваниям, при этом достигая 30% случаев в нозологическом профиле всех патологий [8][9]. Этиологические факторы возникновения неспецифической бронхопневмонии у телят представляют собой комплекс причин, включая прежде всего условно-патогенную микробиоту дыхательных путей, которая при неблагоприятных условиях может стать патогенной, скученность содержания, несбалансированное кормление, стресс, сквозняки, шум, влияние негативных факторов окружающей среды, а также снижение резистентности и иммунной реактивности новорожденных животных [10-13].

В условиях производства в целях профилактики и при борьбе с факторными заболеваниями, в том числе и бронхопневмонией у телят, широко используют в качестве антимикробных препаратов антибиотики, которые чаще всего назначают эмпирически [14-16]. При этом эмпирическое и бесконтрольное их использование зачастую приводит к мутациям и приобретению устойчивости к ним микроорганизмов. Антибиотики могут накапливаться в тканях организма и животноводческой продукции, что приводит к формированию резистентности к ним микробиоты их конечного потребителя – человека. Кроме того, имеет место кумулятивный и токсический эффекты при использовании таких препаратов, что может приводить к возникновению полиорганной недостаточности у животных. Поэтому поиск альтернативных средств борьбы со множественноустойчивыми патогенными бактериями является актуальной задачей [17-19].

Результаты исследования иммунной системы больных респираторными болезнями телят достаточно противоречивы и в большинстве случаев свидетельствуют о ее дисфункции и снижении ответной реакции [20][21]. В этой связи иммунобиологическая реактивность организма играет одну из ключевых ролей в формировании и прогрессировании различных инфекционных заболеваний, в том числе и острой катаральной бронхопневмонии у телят. Поэтому иммунологический скрининг в динамике проведения терапии патологий респираторного тракта больных животных может быть ключевым аспектом контроля его эффективности, являясь, на наш взгляд, актуальным направлением исследований, требующим своевременного и грамотного решения.

Цель работы – провести иммунологический контроль эффективности аэрозольной фитотерапии острой катаральной бронхопневмонии телят в условиях животноводческих ферм.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 24-26-00091 (https://rscf.ru/project/24-26-00091) на базе животноводческих ферм ООО «Бабаево» Собинского района Владимирской области и ООО «Дельта-Ф» Сергиево-Посадского городского округа Московской области с однотипными условиями содержания и кормления животных.

Объектом исследования служили телята в возрасте от 1 до 3 мес., больные острой катаральной бронхопневмонией (n = 60). По мере заболевания телят рандомно распределяли в опытные группы, помещали в отдельные изоляторы и проводили лечение согласно представленным схемам. Было сформировано три опытные группы животных (1О, 2О и 3О) по 20 больных бронхопневмонией телят в каждой. Лечение животных 1-й опытной группы (1О) проводили по общепринятой в хозяйствах схеме, которая включала аэрозольную обработку животных в помещении с помощью промышленного генератора холодного тумана «Хайфог» с использованием раствора йодтриэтиленгликоля (3 мл/м3 помещения + глицерин, 10% от общего объема раствора) 1 раз в сутки в течение 30 мин на протяжении 7 дней. В качестве антибактериальной терапии животным группы 1О внутримышечно 1 раз в сутки трехкратно применяли «Пенстреп-400» (1 мл/10 кг). В помещении, где содержались телята 2-й опытной группы (2О), также 1 раз в сутки в течение 30 мин на протяжении 7 дней проводили аэрозольную обработку животных с помощью промышленного генератора холодного тумана «Хайфог» с применением раствора йодтриэтиленгликоля (3 мл/м3 помещения + глицерин, 10% от общего объема раствора). В качестве антибактериальной терапии на основании ранее проведенных микробиологических исследований и определения чувствительности изолированных патогенов к антибиотикам был назначен препарат из группы фторхинолонов «Марфлоксин», 10%-й раствор (8 мг/кг), который применяли трехкратно 1 раз в сутки. Животным 3-й опытной группы (3О) аэрозольную обработку в помещении проводили экспериментально ранее подобранным фитопрепаратом «Экстракт зверобоя продырявленного», который также обладал высокой антибактериальной активностью по отношению к инициаторам бронхопневмонии у телят [22]. Помимо этого, также трехкратно 1 раз в сутки применяли фторхинолоновый препарат «Марфлоксин», 10%-й раствор (8 мг/кг).

У больных животных (по 10 гол. из каждой группы) до начала терапии, а также на 7-е и 12-е сут после лечения отбирали кровь для проведения иммунологических исследований. Общее количество Т-лимфоцитов определяли методом спонтанного розеткообразования общепринятыми методами. При этом исследовали чувствительность и резистентность Т-клеток к теофиллину. Количество Т-супрессоров определяли как разницу между количеством Т-хелперов и общим числом Т-лимфоцитов. Иммунорегуляторный индекс (ИРИ) рассчитывался по соотношению Т-хелперов к Т-супрессорам. Число NK-клеток подсчитывали как разницу между суммой Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов от общего их количества методом комплементарного розеткообразования. Структуру циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) определяли по молекулярной массе. Уровень провоспалительных интерлейкинов ИЛ-1α, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-1α (фактор некроза опухоли) измеряли методом твердофазного иммуноферментного анализа. В качестве контроля использовали кровь клинически здоровых телят (n = 10), которую отбирали однократно в первый день исследования.

Все манипуляции с животными выполняли в соответствии с Европейской конвенцией ETS № 123.

Результаты статистически обрабатывали с использованием программы STATISTICA 7.0 (StatSoft, США). Перед проведением оценивали нормальность распределения с помощью тестов Шапиро – Уилка. При нормальном распределении количественных переменных для сравнения двух групп использовали ANOVA-тест. Достоверность различий между показателями до и после лечения животных оценивали по Манну – Уитни (* р < 0,05; ** р < 0,01; *** р < 0,001).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оптимальные результаты лечения заболевания достигаются только при динамическом мониторинге состояния животных при использовании различных терапевтических схем и своевременной корректировке проводимой терапии. В этом контексте было проведено исследование сравнительной эффективности трех различных схем терапии острой катаральной бронхопневмонии у телят с регулярным наблюдением за состоянием животных.

Следует отметить, что у представителей опытной группы 1О общее клиническое улучшение наблюдалось на (9,25 ± 0,91) сут, при этом за время терапии возникло 6 случаев осложнений. В результате лечения 18 (90,0%) телят выздоровели, а 2 (10,0%) животных погибли. В опытной группе 2О общее клиническое улучшение наступило уже на (7,20 ± 0,61) сут, и все 20 (100,0%) животных выздоровели. Терапевтические исследования в опытной группе 3О показали, что общее клиническое улучшение наступило на (4,90 ± 0,64) сут, то есть на 47,0% быстрее по сравнению с первой группой, и также все 20 (100,0%) телят выздоровели.

Тяжесть течения любого инфекционного заболевания, а также выздоровление животного зависят не только от наличия микрофлоры и ее вирулентности, но и прежде всего от степени резистентности и реактивности макроорганизма, что определяется состоянием иммунной системы. Показатели клеточного звена иммунитета телят с острой катаральной бронхопневмонией в процессе лечения представлены в таблице 1.

Из приведенных данных видно, что при общепринятом в опытных хозяйствах лечении (опытная группа 1О) на 7-е сут регистрировали лишь достоверное повышение Т-хелперов на 29,27%: с (12,30 ± 0,89) до (15,90 ± 0,94)% (*↑). Терапия животных группы 2О на 7-е сут сопровождалась более значительными сдвигами клеточного звена иммунитета: рост уровня Т-хелперов в 1,87 раза, с (11,90 ± 0,69) до (22,30 ± 1,31)% (***↑), на фоне снижения уровня Т-супрессоров в 1,30 раза (**↓) и NK-клеток в 1,19 раза (**↓). Необходимо отметить, что наиболее значимые позитивные сдвиги показателей клеточного звена иммунитета отмечали у телят опытной группы 3О: увеличение Т-клеток общих на 18,41%, с (39,10 ± 1,04) до (46,30 ± 1,34)% (***↑), и Т-хелперов на 111,72%, с (12,80 ± 0,87) до (27,10 ± 1,36)% (***↑), на фоне существенного снижения в сыворотке крови уровня Т-супрессоров в 1,37 раза, с (26,30 ± 1,36) до (19,20 ± 1,15)%, и NK-клеток в 1,45 раза, с (42,00 ± 1,81) до (29,00 ± 2,03)%, при сравнении с показателями до начала терапии. На 12-е сут после начала терапии во всех опытных группах отмечали дальнейшие позитивные сдвиги аналитов клеточного звена иммунитета, однако лишь у животных из опытной группы 3О они приближались к референсным значениям здоровых животных. Так, у телят группы 3О по сравнению с показателями до начала лечения наблюдали высокодостоверное увеличение Т-лимфоцитов общих на 29,92% и Т-хелперов на 188,28% при значительном снижении Т-супрессоров и NK-клеток в 1,79 и 1,68 раза соответственно.

Одним из основных лабораторных показателей удовлетворительного состояния иммунной системы, позволяющих дать объективную оценку напряженности иммунного ответа, является ИРИ. Динамика изменений ИРИ у телят с острой катаральной бронхопневмонией представлена на рисунке.

Установлено, что клиническая манифестация острой катаральной бронхопневмонии сопровождается существенным снижением уровня ИРИ у животных всех опытных групп. Стоит отметить, что на 7-е сут терапии регистрировали увеличение ИРИ у телят опытной группы 1О на 44,44% (*↑), группы 2О – на 143,73% (***↑), у животных группы 3О наблюдали наиболее существенный рост данного показателя – на 188,24% (***↑) при сравнении с исходными данными. На 12-е сут лечения у животных всех опытных групп отмечали высокодостоверный (***↑) рост ИРИ: у телят группы 1О – в 2,71 раза, с (0,45 ± 0,04) до (1,22 ± 0,18) усл. ед.; группы 2О – в 4,98 раза, с (0,44 ± 0,03) до (2,19 ± 0,16) усл. ед.; группы 3О – в 5,35 раза, с (0,51 ± 0,05) до (2,73 ± 0,32) усл. ед., который приближался к референсным значениям.

Данные, приведенные в таблице 2, наглядно демонстрируют изменения показателей гуморального звена иммунитета телят с острой катаральной бронхопневмонией в процессе лечения.

Показано, что возникающие при острой катаральной бронхопневмонии существенные сдвиги гуморального звена иммунитета у телят сопровождаются снижением В-лимфоцитов общих на фоне значительного роста уровня ЦИК, который происходит преимущественно за счет наиболее патогенных среднемолекулярных и мелкомолекулярных фракций. На 7-е сут терапии существенные позитивные сдвиги наблюдали лишь у животных опытной группы 3О: увеличение В-клеток общих на 30,69%, с (18,90 ± 0,84) до (24,70 ± 0,88)% (***↑), на фоне значительного снижения общих ЦИК на 39,61%, с (481,40 ± 10,37) до (290,70 ± 11,26) ед. опт. пл. (***↓), за счет понижения уровня крупномолекулярных ЦИК на 40,10%, с (60,10 ± 1,53) до (36,00 ± 0,73) ед. опт. пл. (***↓), среднемолекулярных ЦИК – на 22,49%, с (97,80 ± 3,36) до (75,80 ± 1,58) ед. опт. пл. (***↓), и мелкомолекулярных ЦИК – на 44,70%, с (323,50 ± 8,31) до (178,90 ± 10,94) ед. опт. пл. (***↓), при сравнении с исходными данными. Установлено, что на 12-е сут терапии у телят всех опытных групп регистрировали позитивные сдвиги искомых иммунологических аналитов, однако лишь у животных группы 3О показатели гуморального звена иммунитета приближались к референсным показателям клинически здоровых телят: увеличение В-лимфоцитов общих в 1,28 раза, с (18,90 ± 0,84) до (24,20 ± 0,55)% (***↑), снижение ЦИК общих – в 2,10 раза, с (481,40 ± 10,37) до (228,80 ± 3,88) ед. опт. пл. (***↓), ЦИК крупных – в 1,81 раза, с (60,10 ± 1,53) до (33,20 ± 0,61) ед. опт. пл. (***↓), ЦИК средних – в 1,43 раза, с (97,80 ± 3,36) до (68,60 ± 1,68) ед. опт. пл. (***↓), и ЦИК мелких – в 2,55 раза, с (323,50 ± 8,31) до (127,00 ± 3,49) ед. опт. пл. (***↓), при сравнении с показателями до начала терапии.

В настоящее время признана важная роль цитокинов в регуляции иммунного ответа организма при воспалительных процессах и инфекционных заболеваниях. Цитокины представляют собой относительно небольшие белки, которые обеспечивают коммуникацию между клетками и формируют самостоятельную систему регуляции основных функций организма, в первую очередь поддерживая гомеостаз при воздействии микробных агентов и повреждении тканей. На уровне всего организма цитокины связывают воедино иммунную, нервную, эндокринную, кроветворную и другие системы, позволяя им организовывать комплексное противодействие антигенам и регулировать защитные реакции [20].

Представленные в таблице 3 данные свидетельствуют о том, что при клинической манифестации острой респираторной патологии у телят возникает цитокиновый шторм, который сопровождается усиленным синтезом провоспалительных цитокинов при сравнении с показателями клинически здоровых животных. Установлено, что уже на 7-е сут терапии у животных всех опытных групп наблюдали резкое понижение уровня интерлейкинов, причем у животных группы 3О данные показатели приближались к референсным значениям. Так, в исследуемых сыворотках крови на 7-е сут отмечали существенное снижение (***↓) у телят группы 1О: ИЛ-1α – в 1,27 раза, ИЛ-6 – в 1,24 раза, ИЛ-8 – в 1,27 раза, ФНО-1α – в 1,13 раза; у животных группы 2О: ИЛ-1α – в 1,60 раза, ИЛ-6 – в 1,67 раза, ИЛ-8 – в 1,45 раза, ФНО-1α – в 1,62 раза; у телят группы 3О регистрировали наиболее значимые позитивные сдвиги: ИЛ-1α – в 1,92 раза, с (36,55 ± 1,21) до (19,08 ± 0,31) пг/мл, ИЛ-6 – в 2,93 раза, с (45,11 ± 1,31) до (15,39 ± 0,38) пг/мл, ИЛ-8 – в 2,24 раза, с (30,67 ± 0,77) до (13,67 ± 0,25) пг/мл, и ФНО-1α – в 2,04 раза, с (94,14 ± 1,68) до (46,23 ± 1,13) пг/мл, при сравнении с показателями до начала лечения. Следует отметить, что на 12-е сут лечения у животных отмечали дальнейшее снижение уровня провоспалительных цитокинов, которое на фоне стандартной терапии в группе 1О сопровождалось уменьшением количества ИЛ-1α лишь в 1,53 раза, ИЛ-6 – в 1,86 раза, ИЛ-8 – в 2,16 раза, а ФНО-1α – в 1,69 раза. В сыворотках крови телят из групп 2О и 3О отмечали более значительные сдвиги интерлейкинов: ИЛ-1α – в 1,83 и 2,02 раза, ИЛ-6 – в 2,52 и 3,35 раза, ИЛ-8 – в 1,85 и 2,54 раза, ФНО-1α – в 2,14 и 2,26 раза соответственно – при сравнении с исходными данными.

Таким образом, лечение животных всех трех опытных групп при острой катаральной бронхопневмонии показало достаточную эффективность. Однако наилучшие результаты были достигнуты при аэрозольном применении фитопрепарата «Экстракт зверобоя продырявленного» в сочетании с антибактериальной терапией, о чем свидетельствуют значительные позитивные сдвиги в клеточном и гуморальном звене иммунитета, а также снижение уровня провоспалительных цитокинов.

Рис. Уровень значений иммунорегуляторного индекса у телят с острой катаральной бронхопневмонией в процессе лечения

Fig. The immunoregulatory index in calves with acute catarrhal bronchopneumonia during the treatment

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Аэрозольное применение фитопрепарата «Экстракт зверобоя продырявленного» в комплексном лечении больных телят с острой катаральной бронхопневмонией показало достаточно высокую эффективность при сравнении с другими схемами. При этом в опытной группе 3О клиническое выздоровление наступало уже на (4,90 ± 0,64) сут терапии, что на 4,35 сут быстрее, чем у животных группы 1О; у телят раньше появлялся аппетит, животные лучше поедали корм, шерстный покров становился гладким и блестящим, а иммунологические показатели сыворотки крови на 12-е сут приближались к референсным значениям клинически здоровых животных. При традиционном лечении (группа 1О) на 7-е сут регистрировали лишь повышение Т-хелперов на 29,27%. Терапия животных группы 2О на 7-е сут сопровождалась более значительными сдвигами клеточного звена иммунитета: рост уровня Т-хелперов в 1,87 раза на фоне снижения уровня Т-супрессоров в 1,30 раза и NK-клеток в 1,19 раза. Наиболее значимые позитивные сдвиги показателей клеточного иммунитета отмечали у телят группы 3О: увеличение Т-клеток общих на 18,41% и Т-хелперов на 111,72% на фоне снижения уровня Т-супрессоров и NK-клеток в 1,37 и 1,45 раза соответственно. На 12-е сут во всех группах отмечали дальнейшие позитивные сдвиги аналитов клеточного иммунитета, однако лишь у животных группы 3О они приближались к референсным значениям. Так, у телят группы 3О наблюдали увеличение Т-лимфоцитов общих и Т-хелперов на 29,92 и 188,28% при снижении Т-супрессоров и NK-клеток в 1,79 и 1,68 раза соответственно. На 7-е сут терапии регистрировали также увеличение значения ИРИ в группе 1О на 44,44%, в группе 2О – на 143,73%, в группе 3О – на 188,24%. На 12-е сут лечения у животных всех опытных групп отмечали высокодостоверный рост ИРИ (у телят группы 1О – в 2,71 раза, группы 2О – в 4,98 раза, группы 3О – в 5,35 раза), который приближался к референсным показателям. Определено, что возникающие при острой катаральной бронхопневмонии существенные сдвиги гуморального звена иммунитета у телят сопровождаются снижением В-лимфоцитов общих на фоне значительного роста уровня ЦИК, который происходит преимущественно за счет наиболее патогенных среднемолекулярных и мелкомолекулярных фракций. При клинической манифестации острой респираторной патологии у телят возникает цитокиновый шторм, который сопровождается усиленным синтезом провоспалительных цитокинов. На 7-е сут терапии у животных всех опытных групп наблюдали резкое падение уровня интерлейкинов, причем у животных группы 3О данные показатели приближались к референсным значениям: ИЛ-1α уменьшился в 1,92 раза, ИЛ-6 – в 2,93 раза, ИЛ-8 – в 2,24 раза и ФНО-1α – в 2,04 раза. На 12-е сут лечения у животных отмечали дальнейшее снижение уровня провоспалительных цитокинов, которое на фоне стандартной терапии в группе 1О сопровождалось уменьшением количества ИЛ-1α лишь в 1,53 раза, ИЛ-6 – в 1,86 раза, ИЛ-8 – в 2,16 раза, а ФНО-1α – в 1,69 раза. В сыворотках крови телят из групп 2О и 3О отмечали более значительные сдвиги интерлейкинов: ИЛ-1α – в 1,83 и 2,02 раза, ИЛ-6 – в 2,52 и 3,35 раза, ИЛ-8 – в 1,85 и 2,54 раза, ФНО-1α – в 2,14 и 2,26 раза соответственно.