Идентификация и некоторые биологические свойства изолятов бактерий рода Bacillus, выделенных из толстого отдела кишечника птицы

ВВЕДЕНИЕ

Микробиота кишечника играет важную роль в поддержании здоровья хозяина, поскольку она может обеспечивать организм различными питательными веществами, регулировать энергетический баланс и иммунный ответ, а также защищать от патогенов. Восстановление и поддержание стабильности кишечной микробиоты с помощью полезных бактерий было предложено в качестве потенциальной стратегии для предотвращения нежелательных последствий для здоровья кишечника взамен применения антибиотиков [1].

Проведенная за последнее десятилетие перепись филогенетического разнообразия бактерий, идентифицированных в кишечном тракте здоровой птицы, показывает, что до 60% родóв, присутствующих в микробиоме кишечника, содержат спорообразующие бактерии, и эти роды составляют 30% от общей кишечной микробиоты [2][3].

В исследованиях микробиома спорообразующие бактерии предложено рассматривать как отдельную функциональную группу в составе глобальной микробиоты. Для обозначения всей совокупности спорообразующих бактерий в микробной популяции был предложен термин sporobiota [4].

Эндоспоры образуются у представителей Firmicutes – большого, разнообразного и морфологически сложного типа бактерий [5]. В рамках этого типа представители семейства Bacillaceae рода Bacillus привлекают пристальное научное внимание, поскольку охватывают наиболее значимые для модуляции кишечной микробиоты виды [6].

Спорообразующие бактерии рода Bacillus чаще ассоциированы с почвенным микробиомом [7], а их присутствие в кишечнике связывают с употреблением кормов и воды. При этом априори считается, что бактерии рода Bacillus попадают в кишечник в споровой форме [8]. Однако накопленные данные свидетельствуют о том, что некоторые виды рода Bacillus рассматривают как микроорганизмы с бимодальным жизненным циклом, которые растут и образуют споры как в окружающей среде, так и в желудочно-кишечном тракте [9][10].

Спорообразующие бактерии рода Bacillus широко применяют в кормах для животных для улучшения роста животных и ингибирования патогенов [11][12]. Механизмы пробиотического действия микроорганизмов этого рода связаны с синтезом антимикробных веществ и молочной кислоты [13], укреплением неспецифического иммунитета [14], высвобождением ферментов амилазы, липазы, протеазы, пектиназы и целлюлазы [15]. Bacillus subtilis стимулирует рост нормальной микрофлоры кишечника, увеличивает разнообразие кишечного микробиома [16], модулирует реактивность регуляторных систем для обновления эпителия кишечника и активность иммунных клеток [17] и нейтрализует негативное влияние различных факторов, особенно антибиотикотерапии [18][19].

Также было показано, что B. subtilis играет важную роль в стимулировании развития кишечно-ассоциированной лимфоидной ткани и что именно споруляцию живых бацилл считают критически важной для этого процесса [20][21].

Выживаемость и колонизацию в пищеварительном тракте считают необходимыми факторами функциональности и проявления физиологических функций микробиоты [22]. В этом аспекте важным условием для колонизации кишечника спорообразующими бактериями является прилипание спор к слизистой оболочке кишечника и дальнейшее формирование биопленок, при котором планктонные клетки переходят в прикрепленные формы [21][23].

Термин «биопленка» используют для описания структурированного сообщества бактериальных клеток, заключенных в полимерный внеклеточный матрикс собственного производства, который прилипает к инертной или живой поверхности [24]. Полимерный внеклеточный матрикс представляет собой сложную систему, состоящую из экзополисахаридов, белка TasA, липидов, нуклеиновых кислот и различных гетерополимеров, секретируемых микроорганизмами во внеклеточную среду [25]. Проведенные исследования показали, что белок TasA и экзополисахарид являются основными компонентами биопленки. TasA – это амилоидный белок, который, как было установлено, участвует в формировании матрикса биопленки микроорганизмами, включая и спорообразующие бактерии [26-29].

Бактериальные биопленки могут защищать бактерии от воздействия окружающей среды, иммунного ответа хозяина, противомикробных средств и антибиотиков [30].

Устанавливать наличие способности у бактерий синтезировать амилоиды с помощью красителя конго красного было предложено D. J. Freeman et al. для выявления образующих слизь или биопленку Staphylococcus sp. [31]. Метод основан на морфологии и цвете колоний Staphylococcus, образующих и не образующих биопленки на агаре с конго красным. В дальнейших исследованиях была установлена возможность использования данного метода для выявления потенциальных биопленкообразователей среди широкого круга грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, в том числе и спорообразующих бактерий рода Bacillus [32-34].

Недавние данные свидетельствуют о том, что в биопленках протекает более активный процесс споруляции Bacillus, чем у планктонных клеток [35].

Возросшая угроза распространения антибиотикорезистентных вариантов патобионтов выдвигает на первый план направление исследований по оценке антибиотикорезистентности комменсальной кишечной микробиоты как потенциальных доноров детерминант резистентности.

В свете этой проблемы было высказано предположение, что спорообразующие бактерии могут иметь важное значение в распространении и накоплении генов устойчивости к антибиотикам из-за их способности противостоять лечению антибиотиками [36, 37]. Однако степень устойчивости к антибиотикам и способности к биопленкообразованию у представителей кишечной споробиоты по сути неизвестна.

Предыдущие исследования распространения устойчивости к антибиотикам и способности к формированию биопленок бактерий рода Bacillus были сосредоточены на небольшом количестве бактерийных видов и не охватывали изоляты, выделенные из кишечной микробиоты птицы [38-41].

По-прежнему остается недостаточно изученной широта распространения гемолитической активности в кишечной популяции аэробных бактерий рода Bacillus и роль их гемолизинов в поддержании целостности слизистой кишечника и не установлено, что продукция гемолизинов не причиняет вреда хозяину. Негемолитические (γ-гемолитические) штаммы, как правило, считают безопасными для их хозяев, в то время как штаммы с гемолитической активностью считают патогенными [42][43].

Учитывая современную концепцию о значении кишечной микробиоты в поддержании колонизационной резистентности кишечника, этот пробел в знаниях приводит к отсутствию понимания истинной роли аэробных спорообразователей рода Bacillus в кишечной микробиоте птицы, специфичности в выборе и применении их в качестве пробиотиков [44][45].

Актуальность работы заключается в том, что оценка безопасности аэробных спорообразующих бактерий рода Bacillus, которые широко используются в технологии производства пробиотических кормовых добавок, связана не только с видовой идентификацией, но и с индивидуальными особенностями штаммов.

Новизна полученных данных состоит в том, что, оценивая перспективы использования бактерий рода Bacillus для создания пробиотических кормовых добавок, изучены некоторые биологические свойства изолятов, выделенных из слепых отростков толстого отдела кишечника промышленной птицы.

Цель работы – исследование биологических свойств изолятов бактерий рода Bacillus (гемолитическая активность, потенциальная способность к биопленкообразованию и антибиотикорезистентность), выделенных из толстого отдела кишечника птицы с целью отбора штаммов, перспективных для использования в биотехнологии получения пробиотических продуктов.

Материалы и методы

Спорообразующие бактерии, использованные в исследовании, были выделены из образцов содержимого слепых отростков толстого кишечника клинически здоровой птицы, полученной из хозяйств Московской области, благополучных по инфекционным заболеваниям. Птицу в виварии усыпляли с помощью CO₂ и вскрывали общепринятым методом. Все манипуляции с животными соответствовали этическим стандартам, принятым Европейской конвенцией ETS № 123.

Слепые отростки толстого кишечника изолировали путем наложения лигатур на границе с прямой кишкой, отсекали, помещали в отдельную емкость и переносили в лабораторию с соблюдением холодовой цепи 2–8 °С. Не позднее 30 мин после получения изолированных отростков содержимое каждого выдавливали в стерильную одноразовую посуду и маркировали. Полученные аликвоты каждого образца химуса разводили забуференной пептонной водой в соотношении 1:100, ресуспендировали интенсивным перемешиванием до получения равномерной суспензии.

Для изоляции спорообразующих бактерий аликвоты прогревали на водяной бане при 65 °C в течение 45 мин [46].

Для получения изолированных колоний прогретые аликвоты штриховым посевом высевали на триптон-соевый агар (SCD-агар; HiMedia Laboratories Pvt Ltd., Индия). Культивировали в аэробных условиях при (37 ± 1) °С. Просмотр посевов проводили через 18, 24 и 36 ч культивирования.

Отбирали колонии, имеющие морфологические признаки бактерий рода Bacillus, и очищали повторным высевом на SCD-агар. Через 18 и 24 ч культивирования после визуальной оценки степени роста и микроскопии мазков, окрашенных по Граму, изоляты спорообразующих бактерий пересевали на SCD-бульон (HiMedia Laboratories Pvt Ltd., Индия) и бульонные культуры вегетативных клеток использовали в работе.

Фенотипическая характеристика. Была проведена фенотипическая характеристика изолятов спорообразующих бактерий по морфологическим признакам, окрашиванию по Граму, гемолитической активности, каталазной активности, способности к биопленкообразованию и чувствительности к антибиотикам. Все тесты осуществляли в двух повторностях.

Идентификация изолятов. Фенотипическую идентификацию изолятов спорообразующих бактерий проводили с использованием коммерческих биохимических диагностических тест-панелей одноразового пользования API 50CHB (bioMérieux, Франция). Этот тест позволяет классифицировать бактериальные штаммы в соответствии с их способностью ферментировать 49 различных углеводов. Результаты анализировали с помощью программного обеспечения APIWEB™ (bioMérieux, Франция).

Тест на гемолитическую активность. Гемолитические свойства изолятов спорообразующих бактерий определяли с использованием колумбийского агара (HiMedia Laboratories Pvt Ltd., Индия) с добавлением 5% стерильной дефибринированной крови барана. Суточные культуры изолятов спорообразующих бактерий уколом высевали на поверхность агара. Учет реакции проводили через 24 ч после инкубации при (37 ± 1) °С. Изолят считали α-гемолитическим, когда колонии вызывали зеленое или коричневое изменение цвета окружающей среды, β-гемолитическим, когда истинный лизис эритроцитов приводил к образованию чистой, прозрачной зоны, окружающей колонии, и γ-гемолитическим, или негемолитическим, когда в окружающей среде не наблюдалось реакции [47].

Тест на каталазу. Каталазную активность бактериальных изолятов определяли в тесте с 10%-й перекисью водорода [48]. Выделение кислорода, заметное по образованию пузырьков газа, свидетельствует о продукции каталазы.

Тест на чувствительность к антибиотикам. Тест на чувствительность к антибиотикам изолятов бактерий рода Bacillus проводили диско-диффузионным методом [49]. Использовали стандартные диски, импрегнированные следующими антибиотиками в концентрациях от 5 до 30 μg/disk (HiMedia Laboratories Pvt Ltd., Индия): ципрофлоксацином (Cip 5), рифампицином (Rif 5), энрофлоксацином (Ex5), доксициклином (Do10), гентамицином (Gen10), неомицином (N30), цефазолином (Cz30), норфлоксацином (Nx10), бензилпенициллином (P100), пефлоксацином (Pf5), канамицином (K30), линкомицином (L15), азитромицином (AZM15), налидиксовой кислотой (NA30), хлорамфениколом (C30), окситетрациклином (O30), имипенемом (Ipm10), олеандомицином (Ol15), клиндамицином (Cd2), кларитромицином (Clr15), оксациллином (Ox1), ампициллином (Amp25).

Агаровые 18-часовые бактериальные культуры спорообразующих бактерий доводили по стандарту МакФарланда до 0,5 ед. оптической плотности, втирали 250 мкл культуры в поверхность SCD-агара и расставляли с помощью диспенсера (HiMedia Laboratories Pvt Ltd., Индия) диски с антибиотиками по 8 шт. на чашку, затем помещали в термостат при (37 ± 1) °С на 20–24 ч.

Штаммы обозначались как резистентные (R), если концентрация указанных в документах EFSA (Европейское агентство по безопасности продуктов питания) антибиотиков превышала пороговый уровень для штаммов Bacillus [50]. Из-за отсутствия достоверных интерпретирующих документов для ряда антибиотиков штаммы Bacillus, образующие зоны ингибирования вокруг диска с антибиотиком менее 12 мм, считали устойчивыми к антибиотикам.

Определение продуцентов биопленки. Скрининг спорообразующих бактерий – потенциальных продуцентов биопленки – проводили качественным методом путем обнаружения внеклеточных амилоидных белков на сердечно-мозговом агаре (BHI-агар, HiMedia Laboratories Pvt Ltd., Индия) с добавлением индикатора конго красного и 5% сахарозы [31].

Испытуемую суточную бульонную культуру засевали уколом на BHI-агар с конго красным и помещали в термостат на 48 ч инкубации при температуре (37 ± 1) °C. При просмотре визуально оценивали цвет и морфологию выросших колоний испытуемого изолята.

При взаимодействии конго красного с амилоидными белками биопленки образуется продукт, который придает колониям или темно-красный, или темно-коричневый цвет с черным основанием. Слабые продуценты биопленки обычно остаются розовыми, хотя иногда может наблюдаться потемнение в центре колоний. Изоляты, не способные формировать биопленку, образуют колонии белого или очень светло-розового цвета [51].

Результаты и обсуждение

При проведении исследования всего было выделено и идентифицировано до уровня вида 68 штаммов аэробных спорообразующих бактерий рода Bacillus.

Фенотипические данные подтвердили принадлежность изолятов, выделенных из содержимого слепых отростков толстого отдела кишечника клинически здоровой птицы, к спорообразующим бактериям.

Идентифицированные изоляты спорообразующих бактерий были представлены 5 видами: Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis/amyloliquefaciens, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Bacillus mycoides. Ряд изолятов не поддавался идентификации по стандартизованной системе API 50CHB.

Микроскопическое исследование выделенных клеток показало наличие разнообразной коллекции палочковидных бактерий, продуцирующих эндоспоры различных размеров и форм.

Колонии спорообразующих бактерий отличались широким полиморфизмом. Изоляты B. licheniformis через 18–24 ч роста на SCD-агаре образовывали приподнятые среднего размера колонии, окрашенные в белый или бежевый цвет, в форме цветка.

При посеве на SCD-агар изолятов B. subtilis/amyloliquefaciens через 18–24 ч вырастали крупные белые, среднего размера с более светлой точкой в центре или шероховатые волнистые колонии бело-кремового цвета сухой мелкоморщинистой структуры, слегка приподнятые над поверхностью агара.

Изоляты B. megaterium на SCD-агаре образовывали резко окаймленные колонии грязно-белого цвета.

В морфологическом отношении колонии изолятов B. mycoides и B. cereus были идентичными и имели вид шероховатых, расплывающихся, ризоидных серо-белого цвета колоний с волнистыми краями или морщинистых молочного цвета колоний с волнистыми краями.

Выделенные изоляты спорообразующих бактерий были оценены на предмет их безопасности по гемолитической активности (табл. 1).

Все изоляты спорообразующих бактерий, выделенных из образцов химуса слепых отростков кишечника цыплят, не обладали α-гемолической активностью. У 14 из 57 исследованных изолятов видов B. licheniformis, B. subtilis/amyloliquefaciens, B. megaterium и B. cereus при росте на кровяном агаре наблюдали широкую зону гемолиза, характерную для β-гемолитических бактерий (рис. 1). Было обнаружено, что 9 изолятов спорообразующих бактерий обладают γ-гемолитической активностью.

Большинство изученных изолятов спорообразующих микроорганизмов, выросших на BHI-агаре с конго красным, по окраске колоний темно-красного цвета с черным основанием были отнесены к потенциальным образователям биопленок, за исключением 3 изолятов B. licheniformis, 1 изолята B. megaterium и 2 изолятов B. cereus, образующих светлые розовые колонии (рис. 2).

Тесты на чувствительность к антибиотикам показали, что большая часть изученных изолятов спорообразующих бактерий были чувствительны ко всем 22 исследованным антибиотикам (табл. 2).

Только 4 изолята спорообразующих бактерий были резистентны к рифампицину, 7 – к цефазолину, 12 – к линкомицину, 6 – к окситетрациклину. Некоторые изоляты оказались резистентными к 2 антибиотикам, но большинство изолятов проявляли резистентность не более чем к одному антибиотику.

Заключение

По результатам исследований идентифицированные виды спорообразующих бактерий рода Bacillus, выделенные из слепых отростков кишечника промышленной птицы, включали: B. licheniformis, B. subtilis/amyloliquefaciens, B. mycoides, B. megaterium и B. cereus, ряд изолятов не поддавался идентификации.

Все изученные изоляты были каталазоположительными, не обладали α-гемолитической активностью. У части изолятов отмечена β-гемолитическая активность, что не позволяет рассматривать их как непатогенные.

Дополнительно была исследована потенциальная способность выделенных изолятов к биопленкообразованию, что косвенно характеризует возможность их выживания в кишечнике. Подавляющее большинство изолятов относились к потенциальным биопленкообразующим фенотипам и проявляли чувствительность к 22 тестируемым антибиотикам.

Гемолитически активные кишечные изоляты спорообразующих бактерий не могут считаться безопасными до выяснения действия этого фактора вирулентности на организм животных.

Результаты исследований могут быть использованы при отборе кандидатных штаммов бактерий рода Bacillus, выбранных в качестве пробиотиков.