Идентификация и некоторые биологические свойства изолятов бактерий рода Bacillus, выделенных из толстого отдела кишечника птицы

Введение. Проведенная за последнее десятилетие перепись филогенетического разнообразия бактерий, колонизирующих кишечный тракт клинически здоровой птицы, показывает, что до 60% родóв, присутствующих в микробиоме кишечника, содержат спорообразующие бактерии, и эти роды составляют 30% от общей кишечной микробиоты. Были зарегистрированы преимущества, связанные с использованием пробиотиков, содержащих спорообразующие бактерии рода Bacillus. Анализ широты распространения гемолитической и потенциальной биопленкообразующей активности, а также антибиотикорезистентности у кишечной популяции споробиоты птицы необходим для понимания истинной роли аэробных спорообразователей рода Bacillus в экологии кишечного микробиома птицы.

Цель работы. Идентификация и исследование биологических характеристик (гемолитическая активность, потенциальная способность к биопленкообразованию и антибиотикорезистентность) изолятов бактерий рода Bacillus, выделенных из толстого отдела кишечника птицы.

Материалы и методы. Выделение спорообразующих бактерий из содержимого слепых отростков толстого кишечника птицы проводили путем прогревания образцов. Фенотипическую идентификацию изолятов осуществляли с использованием биохимических тест-панелей API 50CHB (bioMérieux, Франция). Гемолитические свойства определяли на колумбийском агаре (HiMedia Laboratories Pvt Ltd., Индия) с добавлением 5% стерильной дефибринированной крови барана; каталазную активность – в тесте с 10%-й перекисью водорода по ОФС.1.7.2.0012.15; чувствительность к антибиотикам – диско-диффузионным методомсостандартными дисками, импрегнированными антибиотиками вконцентрациях от5до 30 μg/disk. Скрининг спорообразующих бактерий – продуцентов биопленки проводили качественным методом на сердечно-мозговом агаре (HiMedia Laboratories Pvt Ltd., Индия) с добавлением индикатора конго красного и 5% сахарозы.

Результаты. Установлено, что кишечная популяция аэробной споробиоты слепых отростков толстого кишечника птицы представлена видами B. licheniformis, B. subtilis/amyloliquefaciens, B. mycoides, B. megaterium и B. сereus. Все изученные изоляты были каталазоположительными, не обладали α-гемолитической активностью. У части изолятов отмечена β-гемолитическая активность. Подавляющее большинство изолятов относились к биопленкообразующим фенотипам и проявляли чувствительность к тестируемым антибиотикам.

Заключение. Вегетативные формы спорообразующих бактерий рода Bacillus потенциально могут сохраняться в сложной экосистеме кишечника или временно ассоциироваться с ней. Гемолитически активные кишечные изоляты спорообразующих бактерий не могут считаться безопасными до выяснения действия этого фактора вирулентности на организм животных. Результаты исследований могут быть использованы при отборе кандидатных штаммов бактерий рода Bacillus, выбранных в качестве пробиотиков.

1. Von Martels J. Z., Sadabad M. S., Bourgonje A. R., Blokzijl T., Dijkstra G., Faber K. N., Harmsen H. J. M. The role of gut microbiota in health and disease: in vitro modeling of host-microbe interactions at the aerobe-anaerobe interphase of the human gut. Anaerobe. 2017; 44: 3–12. https://doi.org/10.1016/j.anaerobe.2017.01.001

2. Kearney S. M., Gibbons S. M., Poyet M., Gurry T., Bullock K., Allegretti J. R., et al. Endospores and other lysis-resistant bacteria comprise a widely shared core community within the human microbiota. The ISME Journal. 2018; 12 (10): 2403–2416. https://doi.org/10.1038/s41396-018-0192-z

3. Lan P. T. N., Hayashi H., Sakamoto M., Benno Y. Phylogenetic analysis of cecal microbiota in chicken by the use of 16S rDNA clone libraries. Microbiology and Immunology. 2002; 46 (6): 371–382. https://doi.org/10.1111/j.1348-0421.2002.tb02709.x

4. Tetz G, Tetz V. Introducing the sporobiota and sporobiome. Gut Pathogens. 2017; 9 (1):38. https://doi:10.1186/s13099-017-0187-8

5. Elshaghabee F. M., Rokana N., Gulhane R. D., Sharma C., Panwar H. Bacillus as potential probiotics: status, concerns, and future perspectives. Frontiers in Microbiology. 2017; 8:1490. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01490

6. Egan M., Dempsey E., Ryan C. A., Ross R. P., Stanton C. The sporobiota of the human gut. Gut Microbes. 2021; 13 (1):е1863134. https://doi.org/10.1080/19490976.2020.1863134

7. Zeigler D. R., Perkins J. B. The Genus Bacillus. In: Practical Handbook of Microbiology. Ed. by L. H. Green, E. Goldman. 4th ed. Boca Raton: CRC Press; 2021; Chapter 22: 249–278. https://doi.org/10.1201/9781003099277

8. Priest F. G. Systematics and Ecology of Bacillus. In: Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria: Biochemistry, Physiology, and Molecular Genetics. Ed. by A. L. Sonenshein, J. A. Hoch, R. Losick. Washington: American Society for Microbiology; 1993; Chapter 1: 1–16. https://doi.org/10.1128/9781555818388.ch1

9. Barbosa T. M., Serra C. R., La Ragione R. M., Woodward M. J., Henriques A. O. Screening for Bacillus isolates in the broiler gastrointestinal tract. Applied and Environmental Microbiology. 2005; 71 (2): 968–978. https://doi.org/10.1128/AEM.71.2.968-978.2005

10. Hoa T. T., Duc L. H., Isticato R., Baccigalupi L., Ricca E., Van P. H., Cutting S. M. Fate and dissemination of Bacillus subtilis spores in a murine model. Applied and Environmental Microbiology. 2001; 67 (9): 3819–3823. https://doi.org/10.1128/AEM.67.9.3819-3823.2001

11. Mohammed A. A., Zaki R. S., Negm E. A., Mahmoud M. A., Cheng H. W. Effects of dietary supplementation of a probiotic (Bacillus subtilis) on bone mass and meat quality of broiler chickens. Poultry Science. 2021; 100 (3):100906. https://doi.org/10.1016/j.psj.2020.11.073

12. Abramowicz K., Krauze M., Ognik K. The effect of a probiotic preparation containing Bacillus subtilis PB6 in the diet of chickens on redox and biochemical parameters in their blood. Annals of Animal Science. 2019; 19 (2): 433–451. https://doi.org/10.2478/aoas-2018-0059

13. Леляк А. А., Штерншис М. В. Антагонистический потенциал сибирских штаммов Bacillus spp. в отношении возбудителей болезней животных и растений. Вестник Томского государственного университета. Биология. 2014; (1): 42–55. https://elibrary.ru/tgwlvz

14. Dong Y., Li R., Liu Y., Ma L., Zha J., Qiao X., et al. Benefit of dietary supplementation with Bacillus subtilis BYS2 on growth performance, immune response, and disease resistance of broilers. Probiotics and Antimicrobial Proteins. 2020; 12: 1385–1397. https://doi.org/10.1007/s12602-020-09643-w

15. Смирнов В. В., Резник С. Р., Кудрявцев В. А., Осадчая А. И., Сафронова Л. А. Внеклеточные аминокислоты аэробных спорообразующих бактерий. Микробиология. 1992; 61 (5): 865–872.

16. Wu B. Q., Zhang T., Guo L. Q., Lin J. F. Effects of Bacillus subtilis KD1 on broiler intestinal flora. Poultry Science. 2011; 90 (11): 2493–2499. https://doi.org/10.3382/ps.2011-01529

17. Sumi C. D., Yang B. W., Yeo I.-C., Hahm Y. T. Antimicrobial peptides of the genus Bacillus: a new era for antibiotics. Canadian Journal of Microbiology. 2015; 61 (2): 93–103. https://doi.org/10.1139/cjm-2014-0613

18. Horosheva T. V., Vodyanoy V., Sorokulova I. Efficacy of Bacillus probiotics in prevention of antibiotic‐associated diarrhoea: a randomized, double‐blind, placebo‐controlled clinical trial. JMM Case Reports. 2014; 1 (3):e004036. https://doi.org/10.1099/jmmcr.0.004036

19. Sorokulova I. Modern status and perspectives of Bacillus bacteria as probiotics. Journal of Probiotics & Health. 2013; 1 (4):е106. https://doi.org/10.4172/2329-8901.1000e106

20. Duc L. H., Hong H. A., Uyen N. Q., Cutting S. M. Intracellular fate and immunogenicity of B. subtilis spores. Vaccine. 2004; 22 (15–16): 1873–1885. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2003.11.021

21. Lu S., Na K., Li Y., Zhang L., Fang Y., Guo X. Bacillus-derived probiotics: metabolites and mechanisms involved in bacteria – host interactions. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2024; 64 (6): 1701–1714. https://doi.org/10.1080/10408398.2022.2118659

22. Kubota H., Senda S., Nomura N., Tokuda H., Uchiyama H. Biofilm formation by lactic acid bacteria and resistance to environmental stress. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2008; 106 (4): 381–386. https://doi.org/10.1263/jbb.106.381

23. Todorov S. D., Ivanova I. V., Popov I., Weeks R., Chikindas M. L. Bacillus spore-forming probiotics: benefits with concerns? Critical Reviews in Microbiology. 2022; 48 (4): 513–530. https://doi.org/10.1080/1040841X.2021.1983517

24. Costerton J. W., Stewart P. S., Greenberg E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 1999; 284 (5418): 1318–1322. https://doi.org/10.1126/science.284.5418.1318

25. Branda S. S., Vik Å., Friedman L., Kolter R. Biofilms: the matrix revisited. Trends in Microbiology, 2005; 13 (1): 20–26. https://doi.org/10.1016/j.tim.2004.11.006

26. Lasa I., Penadés J. R. Bap: a family of surface proteins involved in biofilm formation. Research in Microbiology. 2006; 157 (2): 99–107. https://doi.org/10.1016/j.resmic.2005.11.003

27. Taglialegna A., Lasa I., Valle J. Amyloid structures as biofilm matrix scaffolds. Journal of Bacteriology. 2016; 198 (19): 2579–2588. https://doi.org/10.1128/jb.00122-16

28. Akbey Ü., Andreasen M. Functional amyloids from bacterial biofilms – structural properties and interaction partners. Chemical Science. 2022; 13 (22): 6457–6477. https://doi.org/10.1039/D2SC00645F

29. Cámara-Almirón J. Structural and functional study of bacterial amyloids in Bacillus subtilis: Author’s thesis. Universidad de Málaga; 2020. https://hdl.handle.net/10630/19863

30. Fazeli-Nasab B., Sayyed R. Z., Mojahed L. S., Rahmani A. F., Ghafari M., Antonius S., Sukamto. Biofilm production: a strategic mechanism for survival of microbes under stress conditions. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 2022; 42:102337. https://doi.org/10.1016/j.bcab.2022.102337

31. Freeman D. J., Falkiner F. R., Keane C. T. New method for detecting slime production by coagulase negative staphylococci. Journal of Clinical Pathology. 1989; 42 (8): 872–874. https://doi.org/10.1136/jcp.42.8.872

32. Saxena N., Maheshwari D., Dadhich D., Singh S. Evaluation of Congo red agar for detection of biofilm production by various clinical Candida isolates. Journal of Evolution of Medical and Dental Sciences. 2014; 3 (59): 13234–13238. https://doi.org/10.14260/jemds/2014/3761

33. Branda S. S., Chu F., Kearns D. B., Losick R., Kolter R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Molecular Microbiology. 2006; 59 (4): 1229–1238. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2005.05020.x

34. Romero D., Aguilar C., Losick R., Kolter R. Amyloid fibers provide structural integrity to Bacillus subtilis biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2010; 107 (5): 2230–2234. https://doi.org/10.1073/pnas.0910560107

35. Lindsay D., Brözel V. S., Von Holy A. Spore formation in Bacillus subtilis biofilms. Journal of Food Protection. 2005; 68 (4): 860–865. https://doi.org/10.4315/0362-028X-68.4.860

36. Bengtsson-Palme J., Abramova A., Berendonk T. U., Coelho L. P., Forslund S. K., Gschwind R., et al. Towards monitoring of antimicrobial resistance in the environment: For what reasons, how to implement it, and what are the data needs? Environment International. 2023; 178: 108089. https://doi.org/10.1016/j.envint.2023.108089

37. Dulya O., Mikryukov V., Shchepkin D. V., Pent M., Tamm H., Guazzini M., et al. A trait-based ecological perspective on the soil microbial antibiotic-related genetic machinery. Environment International. 2024; 190:108917. https://doi.org/10.1016/j.envint.2024.108917

38. BerićT., Biočanin M., Stanković S., Dimkić I., Janakiev T., Fira Đ., Lozo J. Identification and antibiotic resistance of Bacillus spp. isolates from natural samples. Archives of Biological Sciences. 2018; 70 (3): 581–588. https://doi.org/10.2298/ABS180302019B

39. Adamski P., Byczkowska-Rostkowska Z., Gajewska J., Zakrzewski A. J., Kłębukowska L. Prevalence and antibiotic resistance of Bacillus sp. isolated from raw milk. Microorganisms. 2023; 11 (4):1065. https://doi.org/10.3390/microorganisms11041065

40. Kowalska J., Maćkiw E., Stasiak M., Kucharek K., Postupolski J. Biofilm-forming ability of pathogenic bacteria isolated from retail food in Poland. Journal of Food Protection. 2020; 83 (12): 2032–2040. https://doi.org/10.4315/JFP-20-135

41. Morikawa M. Beneficial biofilm formation by industrial bacteria Bacillus subtilis and related species. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2006; 101 (1): 1–8. https://doi.org/10.1263/jbb.101.1

42. Bernheimer A. W., Avigad L. S. Nature and properties of a cytolytic agent produced by Bacillus subtilis. Microbiology. 1970; 61 (3): 361–369. https://doi.org/10.1099/00221287-61-3-361

43. AlGburi A., Volski A., Cugini C., Walsh E. М., Chistyakov V. А., Mazanko M. S., et al. Safety properties and probiotic potential of Bacillus subtilis KATMIRA1933 and Bacillus amyloliquefaciens B-1895. Advances in Microbiology. 2016; 6 (6): 432–452. https://doi.org/10.4236/aim.2016.66043

44. Deng F., Chen Y., Sun T., Wu Y., Su Y., Liu C., et al. Antimicrobial resistance, virulence characteristics and genotypes of Bacillus spp. from probiotic products of diverse origins. Food Research International. 2021; 139:109949. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2020.109949

45. Похиленко В. Д., Перелыгин В. В. Пробиотики на основе спорообразующих бактерий и их безопасность. Химическая и биологическая безопасность. 2007; (2–3): 20–41. http://www.cbsafety.ru/rus/saf_32_2.asp

46. Otiniano N. M., Farfán-Córdova M., Cabeza J. G., Cabanillas-Chirinos L. Isolation and selection of spore-forming bacilli with potential for self-healing of concrete. Scientific Reports. 2024; 14:27223. https://doi.org/10.1038/s41598-024-77241-9

47. Buxton R. Blood agar plates and hemolysis protocols. American Society for Microbiology. 30 September 2005. 9 p. https://asm.org/getattachment/7ec0de2b-bb16-4f6e-ba07-2aea25a43e76/protocol

48. ОФС.1.7.2.0012.15. Производственные пробиотические штаммы и штаммы для контроля пробиотиков. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. https://pharmacopoeia.regmed.ru/pharmacopoeia/izdanie-14/1/1-7/1-7-2/proizvodstvennye-probioticheskie-shtammy-i-shtammy-dlya-kontrolya-probiotikov

49. Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам: рекомендации Межрегиональной ассоциации по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии. Версия 2021-01. https://www.antibiotic.ru/files/321/clrec-dsma2021.pdf

50. EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP). Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance. EFSA Journal. 2012; 10 (6):2740. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2012.2740

51. Okouakoua F. Y., Kayath C. A., Mokemiabeka S. N., Moukala D. C. R., Kaya-Ongoto M. D., Nguimbi E. Involvement of the Bacillus SecYEG pathway in biosurfactant production and biofilm formation. International Journal of Microbiology. 2024; 2024:6627190. https://doi.org/10.1155/2024/6627190