Видовое разнообразие микроорганизмов и распространение антибиотикорезистентных энтеробактерий на молочных фермах

ВВЕДЕНИЕ

Бактериальные сообщества, циркулирующие на молочных фермах, оказывают значительное влияние на безопасность пищевых продуктов, качество молочной продукции и здоровье животных [1]. Концепция «Единое здоровье» критически важна для понимания распространения резистентности к антибактериальным средствам, она подразумевает взаимодействие между людьми, животными и окружающей средой, что особенно актуально из-за общей природы устойчивых к противомикробным препаратам бактерий человека и животных [2]. В мире полмиллиарда человек заняты в сфере животноводства и напрямую подвергаются воздействию зоонозных микроорганизмов [3]. Остаточные количества противомикробных препаратов, антибиотикорезистентные патогены часто обнаруживаются в отходах животного происхождения и загрязняют почвенную среду и сточные воды [4]. Escherichia coli является резервуаром для многих генетических детерминант резистентности к антибиотикам, которые могут передаваться животным и людям через многочисленные пути: при контакте с животными или продуктами животного происхождения, а также с объектами окружающей среды [4]. Proteus mirabilis – условно-патогенный микроорганизм семейства Enterobacteriaceae, вызывающий воспалительные заболевания кожи, дыхательных путей, мочевыводящих путей и желудочно-кишечного тракта. После E. coli он является наиболее распространенной условно-патогенной и зоонозной бактерией, которую обнаруживают у различных животных, таких как куры, утки, черепахи, крупный рогатый скот и другие домашние животные [5]. P. mirabilis встречается в различных средах: сточных водах, почве и желудочно-кишечном тракте животных и человека [6]. Несоблюдение рекомендаций по назначению противомикробных препаратов в животноводстве способствует распространению антибиотикорезистентности.

Актуальность данной работы определяется тем, что изучение состава бактериальных сообществ, циркулирующих в животноводческих помещениях, позволит определить приоритетные микроорганизмы, влияющие на здоровье животных. Новизна исследований заключается в получении ранее неизвестных данных о составе микробиоты корма, раневого экссудата и фекалий крупного рогатого скота и выявлении степени распространения антибиотикорезистентности энтеробактерий в сельскохозяйственных организациях Свердловской области.

Цель исследования – изучение видового разнообразия бактериальных сообществ, а также проведение мониторинга распространения антибиотикорезистентных энтеробактерий (E. coli и P. mirabilis) на молочных фермах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили в 2023–2024 гг. в отделе геномных исследований и селекции животных Уральского научно-исследовательского ветеринарного института – структурного подразделения ФГБНУ «Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук» и лаборатории ООО «Кволити Мед» (г. Екатеринбург). Работа выполнена в 4 сельскохозяйственных организациях Свердловской области, занимающихся разведением крупного рогатого скота голштинской породы. Всего была отобрана 61 проба материала: экссудат с поверхностей ран конечностей (25), фекалии (22) и пробы корма (14).

Сбор проб фекалий от коров проводился зондом-тампоном в пробирки с модифицированной средой Кэри – Блэра, разработанной для транспортировки и сохранения жизнеспособности возбудителей кишечных инфекций (FecalSwabTM, Copan, Италия). Пробы остального биоматериала помещали в пробирки с транспортной средой Amies (eSwab®, Copan, Италия).

В лаборатории ООО «Кволити Мед» методом истощающего штриха 10 мкл суспензии биоматериала с помощью стерильной калиброванной петли высевали на питательные среды: колумбийский агар (Bio-Rad Laboratories, Inc., Франция) с 5% дефибринированной крови барана (E&O Laboratories Ltd., Шотландия); агар Плоскирева (ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Россия); ГРМ-агар (ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Россия); среда питательная хромогенная UriSelect 4 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Франция); агар Сабуро с 2% глюкозы и хлорамфениколом (SIFIN diagnostics GmbH, Германия). Засеянные чашки Петри помещали в термостат при (37 ± 1) °С и инкубировали 24 ч.

Выросшие колонии идентифицировали методом MALDI-ToF масс-спектрометрии с помощью прибора Vitek® MS (bioMérieux, Франция). Для этого бактериальную массу наносили на спот слайда, покрывали 1 мкл матрицы (α-циано-3-гидроксикоричная кислота), высушивали при комнатной температуре и считывали прибором масс-спектры рибосомальных белков, сравнивая их с базой данных с помощью программного обеспечения MYLA® (bioMérieux, Франция). Определяли род и вид изолятов в биоматериале с полуколичественной и количественной характеристикой (КОЕ/грамм и КОЕ/образец).

Чувствительность к антибиотикам устанавливали по стандартной методике European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) с использованием агара Мюллера – Хинтона (Bio-Rad Laboratories, Inc., Франция) и дисков (Bio-Rad Laboratories, Inc., Франция), пропитанных препаратами с определенной нагрузкой (табл.). Для считывания антибиотикограмм использовали автоматический анализатор ADAGIO (Bio-Rad Laboratories, Inc., Франция). При интерпретации категорий чувствительности применяли критерии EUCAST (E. A.  Elshafiee, S. M. Nader, S. M. Dorgham, D. A. Hamza; версия 12.0, действующая с 01.01.2022). Несмотря на то что, согласно приказу Минсельхоза России от 18 ноября 2021 г. № 771, цефтазидим, цефепим, цефотаксим, цефтриаксон, цефоперазон запрещены к применению в ветеринарных целях, многие из данных антибактериальных веществ ранее входили в состав лекарственных средств, используемых при терапии воспалительных заболеваний крупного рогатого скота, в связи с чем указанные препараты также были включены при оценке профиля антибиотикорезистентности изолятов E. coli и P. mirabilis.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Всего методом MALDI-ToF идентифицировано 189 изолятов микроорганизмов.

В исследованных пробах раневого экссудата (n = 86) среди оппортунистических и патогенных микроорганизмов наибольшую долю занимали (рис. 1): P. mirabilis (9,30%), E. coli и Trueperella pyogenes (по 8,14%), Bacteroides pyogenes (6,98%), Aerococcus viridans и Prevotella melaninogenica (по 5,81%), Aeromonas hydrophila и Candida catenulata (по 4,65%), Bacillus altitudinis/pumilus, Mannheimia haemolytica, Streptococcus agalactiae (3,49%).

По данным S. C. Liegenfeld et al. [7], в составе микробиоты инфицированных ран наиболее часто обнаруживаются следующие микроорганизмы: грамотрицательные – Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Enterobacteriaceae, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Enterobacter spp., Proteus spp. и Bacteroides spp.; грамположительные – Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Enterococcus spp., Micrococcus spp., Corynebacterium spp., Streptococcus pyogenes, Corynebacterium diphtheriae и коагулазоотрицательные стафилококки. Таким образом, представленные авторами сведения о видовом разнообразии раневой микрофлоры отличаются от результатов нашего исследования.

Распространенность P. mirabilis в пищевых продуктах животного происхождения и побочных продуктах животноводства недостаточно изучена [8]. Вероятнее всего, обнаружение P. mirabilis, как и E. coli, в раневом экссудате связано с фекальным загрязнением поверхности ран. Бактерии вида T. pyogenes входят в состав микробиоты кожи и слизистых оболочек верхних дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, мочеполовых путей животных и являются условно-патогенными микроорганизмами. Они вызывают различные гнойные инфекции, такие как метрит, мастит, пневмония и абсцессы, которые наносят значительный экономический ущерб животноводству [9]. B. pyogenes – представитель микробиоты полости рта кошек и собак, укусы этих животных являются основными факторами риска заражения для человека. Данная бактерия может вызывать ряд воспалительных заболеваний, включая инфекции кожи и мягких тканей, остеомиелит, метрит и абсцессы печени [10][11]. Обнаруженная в ходе исследований анаэробная бактерия P. melaninogenica участвует в развитии и прогрессировании копытной гнили у крупного рогатого скота [12]. Представители филума Aeromonas вызывают заболевания, связанные с развитием диареи у поросят и свиней, жеребят и лошадей; аборты и репродуктивные заболевания кобыл, септические артриты жеребят, септицемию собак, маститы коров, полиартриты телят, при этом A. hydrophila был определен как единственный источник развития инфекции в ране у коровы [13]. S. agalactiae – микроорганизм, способный индуцировать хронический мастит у коров. Помимо этого, стрептококк данного вида может колонизировать желудочно-кишечный тракт молочных коров, а при контаминации фекалиями раневых поверхностей конечностей – быть причиной обнаружения данного микроорганизма в раневом экссудате [14].

Значительно меньшее видовое разнообразие оппортунистических и патогенных микроорганизмов идентифицировано в пробах фекалий крупного рогатого скота (n = 59): E. coli – 28,81%, Aspergillus niger complex – 15,25%, Bacillus licheniformis – 8,47%, P. mirabilis и Enterococcus hirae – по 6,78%, отмечено присутствие и других представителей грибковой микробиоты (рис. 2).

Сокращение разнообразия фекальной микробиоты может быть связано с увеличением концентрированных кормов в рационе [15]. Высококонцентрированная диета приводит к снижению соотношения ацетата к пропионату и pH в рубце, что негативно влияет на общее состояние здоровья и продуктивность крупного рогатого скота [16]. На этом фоне возникает дисбиоз, вследствие чего могут увеличиваться популяции определенных бактерий, таких как условно-патогенные E. coli [16], превалирование которых в фекальной микробиоте коров выявлено в наших исследованиях. Фекальное загрязнение E. coli окружающей среды увеличивает риск развития у коров колиформного мастита [17] и воспалительных заболеваний репродуктивного тракта [18].

В пробах корма: силоса, сенажа, комбикорма (n = 44) – преобладающими оппортунистическими и патогенными видами оказались: Bacillus altitudinis/pumilus – 9,09%, Aspergillus niger complex, Bacillus cereus, Candida krusei, Candida rugosa и P. mirabilis – по 6,82% (рис. 3).

Виды микроорганизмов, обычно обнаруживаемые в силосе, включают: Bacillus pumilus, B. licheniformis, B. coagulans, B. sphaericus и B. cereus. Появление спор B. cereus в силосе неизбежно при нарушении технологического процесса заготовки и хранения кормов. Споры B. cereus проходят через желудочно-кишечный тракт крупного рогатого скота без изменений и выделяются с фекалиями, во время доения из-за загрязнения поверхностей сосков могут переноситься в сырое молоко [19]. Наличие Candida spp., в частности C. krusei, в пробах корма – неблагоприятный показатель, поскольку данные микроскопические грибы могут вызывать микотический мастит у коров [20]. В нашем исследовании в пробах силоса обнаруживали A. niger, что может оказывать как положительное, так и отрицательное влияние на организм коров. Данный вид аспергилл продуцирует β-глюкозидазу, фермент, расщепляющий цианогенные гликозиды, токсичные для крупного рогатого скота, что снижает риск отравления цианидом и улучшает качество силоса [21]. В то же время аспергиллез крупного рогатого скота, особенно вызванный A. niger, может приводить к микотическим абортам и маститам [22]. Выявление в пробах корма патогенных микроорганизмов свидетельствует о необходимости разработки и реализации мер по улучшению технологических процессов заготовки, хранения и контроля качества кормов в исследованных животноводческих организациях.

Для определения антибиотикочувствительности были выбраны изоляты E. coli и P. mirabilis, так как эти микроорганизмы оказались преобладающими практически во всех видах исследованного биологического материала, кроме того, они имеют важное значение в индуцировании заболеваний как животных, так и человека.

У культур E. coli (n = 17) диско-диффузионным методом обнаружена резистентность к препаратам из групп фторхинолонов – 35,29% и цефалоспоринов – 11,76%. При этом к цефуроксиму 80,0% выделенных из фекалий изолятов эшерихий были чувствительны только при увеличении экспозиции. Наибольшая резистентность выявлена к амоксициллину – 41,18%, а к амоксициллину / клавулановой кислоте отмечается снижение устойчивости на 29,42%. Резистентность к гентамицину установлена у 17,65% изолятов (рис. 4).

Фенотип множественной лекарственной устойчивости – устойчивость хотя бы к одному агенту из трех или более химических классов антибиотиков – выявлена у одного изолята E. coli, эффективным в подавлении роста данного изолята оказалась комбинация амоксициллина и клавулановой кислоты. Среди патогенов со множественной лекарственной устойчивостью, широко распространенных на молочных фермах, особую обеспокоенность вызывает E. coli, поскольку некоторые штаммы могут вызывать пищевые инфекции у людей [4]. В процессе экспериментов R. Manishimwe et al. [23] у изолятов E. coli наблюдали наличие резистентности к тетрациклину (8,2%), цефтриаксону (56,8%), ципрофлоксацину (77,3%) и комбинации налидиксовой кислоты и ципрофлоксацина (54,5%), то есть частота встречаемости устойчивых изолятов E. coli значительно выше, чем в проведенном нами исследовании.

Все изоляты E. coli, выделенные из образцов раневого экссудата, за исключением одного, резистентного к амоксициллину, оказались чувствительными ко всем исследованным антибиотикам. Alharbi N. S. et al. выявлено, что более 50% изолятов E. coli, полученных из раневого отделяемого, были устойчивы к цефазолину, ампициллину, цефуроксиму, ципрофлоксацину, мезлоциллину, моксифлоксацину, пиперациллину и тетрациклину; 70% изолятов продуцировали бета-лактамазы расширенного спектра действия [24].

Резистентность к фторхинолонам наблюдали у 60,0% изолятов P. mirabilis (n = 10), выделенных из проб раневого экссудата (рис. 5). Все изоляты были восприимчивы к препаратам из группы цефалоспоринов, за исключением цефуроксима, к которому чувствительность проявили 80% изолятов только при увеличенной экспозиции. Устойчивость к амоксициллину и его комбинации с клавулановой кислотой наблюдали у 40% изолятов, полученных из фекалий и раневого экссудата; 40% изолятов, выделенных из раневого отделяемого, были резистентны к гентамицину. В целом стоит отметить, что препараты из группы цефалоспоринов эффективны в отношении P. mirabilis.

В проведенных исследованиях выявлено, что высокая распространенность у кур штаммов P. mirabilis, устойчивых к группе пенициллинов, цефалоспоринов и сульфаниламидов, является прямым следствием использования антимикробных препаратов в птицеводстве [25, 26]. Распространение антибиотикорезистентных P. mirabilis у продуктивных животных и в окружающей среде сельскохозяйственных предприятий является актуальной проблемой общественного здравоохранения. Ранее уже была описана передача P. mirabilis с фенотипом множественной лекарственной устойчивости от животных к человеку при употреблении зараженных пищевых продуктов или при тесном контакте с животными [8][25].

В ходе работы при помощи метода MALDI-ToF установлено видовое разнообразие бактерий, выделенных из проб экссудата с поверхности ран конечностей крупного рогатого скота, фекалий и проб корма. Полученные данные могут быть использованы на сельскохозяйственных предприятиях для назначения рациональной антибиотикотерапии как раневых инфекций, так и в случае возникновения других воспалительных заболеваний, связанных с данными возбудителями.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной работы в пробах раневого экссудата выявлено большое видовое разнообразие бактериальных сообществ, что в основном может быть связано с фекальной контаминацией ран конечностей. Фекальная же микробиота характеризовалась меньшим видовым составом, что может быть обусловлено возникновением дисбиоза вследствие увеличения доли концентрированных кормов в рационе коров, при этом в пробах фекалий установлено доминирование условно-патогенных E. coli (28,81%). Преобладание в пробах корма патогенных видов A. niger, B. cereus и C. krusei свидетельствует о необходимости изменения технологических процессов заготовки, хранения и осуществления контроля за качеством кормов в исследованных животноводческих организациях.

Установлены профили антибиотикорезистентности E. coli и P. mirabilis. У культур E. coli, изолированных из фекалий, устойчивость в основном обнаружена к препаратам из группы фторхинолонов (35,29%) и цефалоспоринов (11,76%). При этом практически все изоляты эшерихий, выделенные из раневого экссудата, оказались чувствительны ко всем исследованным антибактериальным препаратам. У одного изолята E. coli выявлен фенотип множественной лекарственной устойчивости, эффективным в подавлении его роста оказалась комбинация амоксициллина и клавулановой кислоты. Установлено, что практически все изоляты P. mirabilis были устойчивы к антибактериальным препаратам из группы фторхинолонов, эффективными в отношении P. mirabilis оказались препараты из группы цефалоспоринов. Для предотвращения дальнейшего роста антибиотикорезистентности необходимо проведение ротации антибактериальных препаратов, применяемых на молочных фермах, согласно выявленным профилям антибиотикорезистентности энтеробактерий.