Антибиотикорезистентность бактерий рода Salmonella, выявленных в продукции животного происхождения в 2022–2024 гг.

ВВЕДЕНИЕ

В 2024 г. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) опубликовала список 24 резистентных к антибиотикам бактериальных патогенов, среди которых особенно выделяются грамотрицательные бактерии, устойчивые к противомикробным препаратам последнего поколения, в том числе бактерии рода Salmonella [1].

Антибиотикорезистентность – это проблема, затрагивающая все страны и требующая скоординированного подхода и действий на всех уровнях: здравоохранение, сельское хозяйство, окружающая среда, производство продуктов питания (в 2019 г., по данным ВОЗ, проблема вошла в десятку основных угроз глобальному здравоохранению) [2-4].

Некорректное и бесконтрольное использование антибиотиков является основным фактором, ведущим к развитию устойчивости к противомикробным препаратам. Особенно подвержены риску работники сельского хозяйства, учитывая тот факт, что в этой отрасли используется до 50–80% всех антибиотиков [5][6].

В связи с тем, что здоровье человека, животных, растений и окружающей среды, в том числе экосистем, тесно взаимосвязано и взаимозависимо, для борьбы с устойчивостью к противомикробным препаратам объединились ВОЗ, ФАО (Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций), ЮНЕП (Программа Организаций Объединенных Наций по окружающей среде) и ВОЗЖ (Всемирная организация здравоохранения животных) в рамках концепции «Единое здоровье». ВОЗ создала Глобальную систему надзора за устойчивостью к противомикробным препаратам и их применением (GLASS) с единой методологией, а также в 2001 г. опубликовала Глобальную стратегию ВОЗ по сдерживанию резистентности к противомикробным препаратам. В 2022 г. ВОЗ была запущена Глобальная стратегия геномного эпиднадзора за возбудителями болезней, обладающих пандемическим и эпидемическим потенциалом, 2022–2032 гг. [7].

В рамках борьбы с устойчивостью к препаратам ФАО опубликовала призыв полностью отказаться от применения антибиотиков в целях профилактики и в качестве стимуляторов роста в животноводстве и аквакультуре. Наряду с этим комиссией ФАО/ВОЗ по стандартам на пищевые продукты «Кодекс Алиментариус» были приняты жесткие нормативы предельно допустимых уровней остаточного содержания лекарственных препаратов.

Кроме того, в рамках 79-й сессии Генеральной Ассамблеи Организации Объединенных Наций мировые лидеры приняли политическую декларацию, в которой взяли на себя обязательство по достижению четких целей, связанных с борьбой с устойчивостью к лекарственным препаратам.

В России проблема антибиотикорезистентности также обозначена на законодательном уровне. В 2017 г. распоряжением Правительства РФ № 2045-р была утверждена «Стратегия предупреждения распространения антимикробной резистентности в Российской Федерации на период до 2030 года», которая определила государственную политику по ограничению распространения устойчивости микроорганизмов. В 2024 г. распоряжением Правительства РФ № 2214-р был утвержден план мероприятий на 2025–2030 гг. по реализации указанной стратегии, включающий вопросы нормативно-правового регулирования, информирования населения, системного мониторинга и другие, связанные с антибиотикорезистентностью.

Наряду с этим с 2022 г. в сфере ветеринарии действует перечень лекарственных препаратов, в отношении которых вводится ограничение на применение в лечебных целях (утвержден приказом Минсельхоза России от 18.11.2021 № 771), а с 2025 г. вступил в силу порядок назначения лекарственных препаратов для ветеринарного применения и перечень лекарственных средств для ветеринарного применения, отпускаемых по рецепту (утвержден приказом Минсельхоза России от 02.11.2022 № 776).

В 2024 г. в г. Москве была проведена первая Международная конференция БРИКС по антимикробной резистентности.

С целью контроля остаточного содержания лекарственных средств в пищевой продукции решением Совета Евразийской экономической комиссии от 23.06.2023 № 70 были внесены изменения в технические регламенты Таможенного союза, касающиеся установления допустимых уровней к 75 препаратам, а также новых требований представления информации о применяемых ветпрепаратах.

Одной из противодействующих мер в вопросах распространения антибиотикорезистентности является постоянное наблюдение за изменением чувствительности патогенов к антимикробным препаратам. С целью проведения анализа данных резистентности к антибактериальным лекарственным средствам в России существует онлайн-платформа AMRmap и другие AMR-сервисы: веб-продукты, посвященные вопросам антимикробной резистентности.

Бактерии рода Salmonella являются одной из четырех основных причин диарейных болезней во всем мире. Ежегодно заболевания, вызываемые исключительно бактериями рода Salmonella, уносят жизни более 200 000 человек во всем мире [8][9].

В течение последних 10 лет в Российской Федерации проблема сальмонеллезов продолжает оставаться актуальной ввиду существующих рисков инфицирования в условиях интенсивно развивающегося сельского хозяйства. Так, согласно государственным докладам Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека в 2024 г. в РФ заболеваемость сальмонеллезом составила 24,68 случая на 100 тыс. населения; в 2023 г. – 21,45 случая; в 2022 г. – 17,10 случая и в 2021 г. – 13,61 случая на 100 тыс. населения^1 2 3 4.

Наиболее часто выявляемыми сероварами, вызывающими заболевания во всех странах, остаются: S. Enteritidis, S. Typhimurium и S. Infantis. Частота выделения других сероваров зависит от региона [10][11].

В настоящее время происходит увеличение числа устойчивых к лечению антибиотиками инфекций, в том числе вызванных бактериями рода Salmonella. Вместе с тем резистентные к лекарственным препаратам бактерии рода Salmonella представляют значительную угрозу для жизни населения и животного мира из-за своей широкой распространенности и способности заражать в том числе воду. Пищевая продукция – основной фактор передачи возбудителей сальмонеллеза [12-14].

Учитывая изложенное, целью работы было исследование образцов животноводческой продукции из трех регионов Центральной России (Владимирская, Костромская и Ивановская области) с последующим выделением изолятов бактерий рода Salmonella, типированием, определением и оценкой динамики антибиотикорезистентности в период с 2022 по 2024 г.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работу проводили в отделе микробиологических исследований Владимирской испытательной лаборатории ФГБУ «ВНИИЗЖ». Использовали 42 изолята бактерий рода Salmonella, выделенных из продукции животного происхождения в 2022–2024 гг.

Реактивы и питательные среды: забуференная пептонная вода (HiMedia Laboratories Pvt Ltd., Индия), магниевая среда Раппапорта – Вассилиадиса (RVS-бульон; Merck KGaA, Германия), селенитовый бульон (Merck KGaA, Германия), триптон-соевый агар (TSA; Scharlau, Испания), ксилозо-лизиновый дезоксихолатный агар (ХLD-агар; ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Россия), висмут-сульфитный агар (VSA; Merck KGaA, Германия), агар Мюллера – Хинтона (МHA; ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Россия).

Микробиологический анализ проводили по ГОСТ 31659-2012 «Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella». Навеску продукта (25 г) вносили в стерильный пакет с забуференной пептонной водой объемом 225 см³, гомогенизировали 1 мин и инкубировали при температуре 37 °С в течение 18–20 ч.

Полученные культуры пересевали (1 см³) в среды для селективного обогащения: RVS-бульон (10 см³) и селенитовый бульон (10 см³) – и инкубировали в течение 24 ч при температуре (41,5 ± 1,0) °С и 37 °С соответственно. Затем из каждой пробирки делали пересев штрихом бактериологической петлей согласно ГОСТ 26670-91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов» на две селективные агаризованные среды: XLD-arap и VSA – с последующим инкубированием при температуре 37 °С в течение (24 ± 3) ч.

Для идентификации отобранных колоний с ростом, характерным для бактерий рода Salmonella, и получения изолированных колоний осуществляли пересев с последующим культивированием на поверхности подсушенного TSA с дрожжевым экстрактом при температуре 37 °С в течение (24 ± 3) ч.

Принадлежность выросших колоний к бактериям рода Salmonella подтверждали посредством биохимических тестов API 20E (bioMérieux, Франция) и иммуноферментного анализа с использованием анализатора Mini Vidas (bioMérieux, Франция).

Серологическая идентификация. В рамках работы была проведена серологическая идентификация изолятов бактерий рода Salmonella, выделенных с применением реакции агглютинации на стекле с моно- и поливалентными О- и Н-сыворотками сухими диагностическими адсорбированными промышленного производства «ПЕТСАЛ»® (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России). Серологический вариант штамма определялся на основании серологической формулы в соответствии со схемой Кауфмана – Уайта согласно МУ 4.2.4070-24 
«Лабораторная диагностика сальмонеллезов, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах и объектах окружающей среды: методические указания» (утверждены Главным государственным санитарным врачом РФ 27.09.2024).

Определение антибиотикорезистентности. Чувствительность к антимикробным препаратам выделенных изолятов бактерий рода Salmonella определяли диско-диффузионным методом согласно МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: методические указания».

Антибиотики (бумажные диски производства ФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера», Россия): азитромицин 15 мкг, амикацин 30 мкг, амоксициллин 20 мкг, ампициллин/сульбактам 10 мкг, бензилпенициллин 10 ЕД/6 мкг, гентамицин 10 мкг, доксициклин 30 мкг, имипенем 10 мкг, канамицин 30 мкг, левофлоксацин 5 мкг, меропенем 10 мкг, норфлоксацин 10 мкг, сульфаметоксазол/триметоприм 23,75/1,25 мкг, стрептомицин 10 мкг, тетрациклин 30 мкг, хлорамфеникол/левомицетин 30 мкг, цефазолин 30 мкг, цефотаксим 30 мкг, цефуроксим 30 мкг, ципрофлоксацин 5 мкг, эритромицин 15 мкг.

Для определения антибиотикорезистентности использовали бактериальную суспензию с оптической плотностью 0,5 по стандарту МакФарланда, приготовленную из суточной культуры изолятов бактерий рода Salmonella, выросших на TSA. Плотность суспензии измеряли с помощью денситометра VITEK BIOMERIEUX model DENSICHEK (Франция).

В стерильные чашки Петри диаметром 100 мм наливали по 20 мл расплавленного TSA. Бактериальную суспензию не позднее 15 мин после ее приготовления инокулировали на подсушенную поверхность агара МHA с помощью стерильного хлопкового тампона штриховыми движениями без промежутков, затем размещали диски на поверхности агара (4 диска на одну чашку Петри). После аппликации дисков с антибиотиками чашки Петри инкубировали при 37 °С в течение (18 ± 2) ч. Оценку результатов осуществляли по наличию зон задержки роста микроорганизмов вокруг дисков, измеряя с точностью до 1 мм на темной матовой поверхности на расстоянии примерно 30 см от глаз при помощи линейки под углом 45°.

Интерпретацию результатов проводили согласно российским рекомендациям «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» (МАКМАХ, версия 2025-01), подготовленным на основе рекомендаций Европейского комитета по определению чувствительности к антимикробным препаратам (EUCAST), и с использованием стандарта CLSI M100. В настоящее время комплекс подходов к оценке чувствительности и интерпретации результатов, предлагаемый EUCAST, является теоретически наиболее обоснованным [15, 16, 17].

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени. Для выделения ДНК бактерий рода Salmonella в работе использовали набор «Сорб-ГМО-Б» (ЗАО «Синтол», Россия).

Изучение молекулярно-генетических свойств выделенных изолятов бактерий рода Salmonella на наличие генов антибиотикорезистентности (blaCTX-M, blaOXA10, blaDHA, blaGES, blaKPC, blaOXA48-like, blaNDM, blaVIM) было проведено с применением тест-систем серии «РЕЗИСТОМ» (ООО НПФ «Литех», Россия) согласно инструкции производителя.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате исследований образцов продукции животного происхождения выявлено 42 изолята бактерий рода Salmonella: 15 изолятов – в 2022 г., 11 изолятов – в 2023 г., 16 изолятов – в 2024 г.).

Морфологические и культуральные свойства выделенных изолятов бактерий Salmonella были характерны для своего семейства и рода.

На рисунке 1 видно, что в рамках проведенных исследований чаще всего бактерии рода Salmonella обнаруживали в продукции из мяса птицы – 36 изолятов (85,7%), в частности в мясе кур – 24 изолята (57,1%). При этом, по данным Европейского центра профилактики и контроля заболеваний (ECDC), в Европейском союзе наиболее зараженной бактериями рода Salmonella продукцией на этапе распространения являются мясо птицы и полуфабрикаты, приготовленные из мяса птицы. В мясе и мясной продукции из индейки, а также в свинине аналогично определен высокий уровень загрязнения [10][18].

При серологической идентификации было установлено, что большинство изолятов бактерий рода Salmonella относятся к группе О:9 (D1) – 18 (42,9%) и группе О:7 (С1) – 13 (30,9%), еще 7 изолятов (16,7%) – к группе О:4 (В), 4 изолята (9,5%) – к группе О:8 (С2–С3). Результаты отражены на рисунке 2.

При серотипировании среди изолятов бактерий рода Salmonella чаще всего выявляли (рис. 3): S. Enteritidis – 14 (33,3%), S. Blegdam – 3 (7,1%), S. Derby – 2 (4,8%). При этом S. Enteritidis и S. Derby чаще обнаруживали в продукции из утки, а S. Blegdam – в мясе кур. Вместе с тем было установлено, что из 17 нетипируемых изолятов бактерий рода Salmonella (40,5%) 11 (26,2%) приходились на группу О:7 (С1).

В рамках исследования был проведен анализ устойчивости изолятов бактерий рода Salmonella к 21 лекарственному препарату. Полученные результаты представлены на рисунке 4.

Установлен относительно высокий общий уровень резистентности к ряду антибиотиков среди изолятов бактерий рода Salmonella, выделенных из продукции животного происхождения в 2022–2024 гг.

Максимальная частота устойчивости у изолятов бактерий рода Salmonella наблюдалась к эритромицину (80,9%), бензилпенициллину (78,6%), норфлоксацину (69,0%) и тетрациклину (40,5%).

Следует отметить, что все изоляты бактерий рода Salmonella оказались чувствительны к меропенему и имипенему.

В начале 2025 г. был опубликован «Сводный отчет Европейского союза об устойчивости к противомикробным препаратам зоонозных и индикаторных бактерий, обнаруженных у людей, животных и в продуктах питания в 2022–2023 гг.», где также представлена информация о том, что большая часть изолятов Salmonella резистентна в том числе к тетрациклину и сульфаниламидам. Кроме того, в нескольких странах наблюдалась тенденция к росту устойчивости к ципрофлоксацину и цефалоспоринам третьего поколения [19].

Эти и другие исследования [20] говорят о важности мониторинга чувствительности бактерий рода Salmonella ввиду роста резистентности к ряду критически важных противомикробных препаратов.

Наряду с этим в рамках испытаний установлено, что 90% изолятов бактерий рода Salmonella устойчивы более чем к одному антибиотику из исследуемых. Кроме того, 38% изолятов резистентны более чем к трем классам лекарственных средств.

Как видно на рисунке 5, устойчивость сразу к трем антимикробным препаратам продемонстрировали 13 изолятов (31,0%), к двум – 8 изолятов (19,0%), к восьми – 5 изолятов (11,9%).

Также в рамках работы выявлен изолят, резистентный сразу к 16 антибиотикам, и изолят, имеющий устойчивость к 19 антибиотикам из 21 используемого. Оба изолята относятся к группе О:4 (В) и обнаружены в мясе кур.

Как следует из государственного доклада «О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2024 году», большинство устойчивых микроорганизмов рода Salmonella были выявлены в мясе птицы, яйцах и продуктах их переработки (97,2%), мясе и мясопродуктах (95,1%)⁵.

Исследования некоторых авторов также показывают, что большая часть выделяемых из продукции бактерий рода Salmonella резистентны как минимум к одному классу противомикробных препаратов. Так, Европейский центр профилактики и контроля заболеваний (ECDC) информирует о том, что люди, инфицированные Salmonella в Европейском союзе, часто имеют устойчивость к противомикробным препаратам, при этом более чем в 20% случаев – как минимум к трем классам противомикробных препаратов. Вместе с тем, по данным ВОЗ, с каждым годом растет антибиотикорезистентность к фторхинолонам и цефалоспоринам [1][18][21][22].

В настоящее время сообщения о множественной резистентности бактерий рода Salmonella появляются чаще. Изучение бактерий рода Salmonella, детектируемых в свиноводческой продукции, дает информацию о высокой их устойчивости к тетрациклину, стрептомицину и сульфаметоксазолу/триметоприму [23][24].

В ходе работы по исследованию выделенных из свиноводческой продукции бактерий рода Salmonella были получены аналогичные результаты, а также отмечена высокая резистентность к эритромицину 80% изолятов.

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека в государственном докладе за 2024 г. информирует о выявленной устойчивости бактерий рода Salmonella к одному и более лекарственному препарату, при этом наибольшая резистентность устанавливалась к тетрациклину, ципрофлоксацину и сульфаметоксазолу/триметоприму.

Таким образом, чрезмерное использование антибиотиков способствует распространению множественной устойчивости к целому ряду противомикробных препаратов, что влечет за собой более длительное и дорогостоящее лечение, а также летальные исходы и экономические потери, представляя особую опасность [25][26].

Рисунок 6 демонстрирует динамику роста числа изолятов бактерий рода Salmonella, резистентных к антимикробным препаратам одного класса, в период с 2022 по 2024 г.

Для лечения сальмонеллезов наиболее перспективным направлением на протяжении довольно длительного времени остается использование цефалоспоринов, в частности третьего поколения, так как данные лекарственные препараты обладают высокой активностью в отношении бактерий рода Salmonella, устойчивостью к микробным бета-лактамазам, биодоступностью и безвредностью при коротких курсах лечения. Кроме того, к эффективным противомикробным препаратам с хорошим проникновением внутрь клетки относятся фторхинолоны, однако в последнее время к ним во всем мире у бактерий рода Salmonella развивается резистентность [27][28].

В рамках исследования установлено (рис. 6А), что с 2022 г. возросла устойчивость изолятов бактерий рода Salmonella к цефалоспорину первого поколения (цефазолину) – на 18,0% (в 2024 г. было устойчиво 5 изолятов из 16 выделенных – 31,3%), к цефалоспорину второго поколения (цефуроксиму) – на 50,0% (в 2024 г. было устойчиво 8 изолятов из 16 выделенных – 50,0%), к цефалоспорину третьего поколения (цефотаксиму) – на 6,3% (в 2024 г. был устойчив 1 изолят из 16 выделенных – 6,3%, ранее резистентность у изолятов не обнаруживалась).

На рисунке 6B видно, что аналогичная ситуация наблюдалась в отношении норфлоксацина (фторхинолон второго поколения) – рост резистентности на 15,0% (в 2024 г. было устойчиво 12 изолятов из 16 выделенных – 75,0%), а также левофлоксацина (фторхинолон третьего поколения) – рост резистентности на 49,2% (в 2024 г. было устойчиво 10 изолятов из 16 выделенных – 62,5%).

Кроме того, изменилась устойчивость изолятов к хлорамфениколу/левомицетину (увеличение на 37,5%) и сульфаметоксазолу/триметоприму (увеличение на 17,5%) в 2022–2024 гг. (рис. 6C).

Также определили высокий рост устойчивости в 2022–2024 гг. к тетрациклинам (рис. 6D): тетрациклину (первое поколение) – на 29,6% (в 2024 г. было устойчиво 9 изолятов из 16 выделенных – 56,3%), доксициклину (второе поколение) – на 30,0% (в 2024 г. было устойчиво 8 изолятов из 16 выделенных – 50,0%).

При этом было отмечено повышение уровня резистентности микроорганизмов к антибиотикам группы аминогликозидов (рис. 6Е). Так, к амикацину (третье поколение) и канамицину (первое поколение) он вырос на 12,5% (в 2024 г. было устойчиво 2 изолята из 16 выделенных – 12,5%). В то же время значение устойчивости к стрептомицину (первое поколение) повысилось на 10,8% (в 2024 г. было устойчиво 6 изолятов из 16 выделенных – 37,5%).

В рамках работы у выделенных изолятов бактерий рода Salmonella генов антибиотикорезистентности blaCTX-M, blaOXA10, blaDHA, blaGES, blaKPC, blaOXA48-like, blaNDM, blaVIM не обнаружено.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При проведении исследования было выявлено 42 изолята бактерий рода Salmonella, при этом превалирующими серовароми являлись: S. Enteritidis – 14 (33,3%), S. Blegdam – 3 (7,1%), S. Derby – 2 (4,8%).

Показано значительное распространение устойчивости, в том числе множественной. При этом изоляты бактерий рода Salmonella имели максимальную резистентность к эритромицину (80,9%), бензилпенициллину (78,6%), норфлоксацину (69,0%) и тетрациклину (40,5%). Также все изоляты бактерий рода Salmonella были чувствительны к меропенему и имипенему.

Большинство изолятов бактерий рода Salmonella проявили устойчивость сразу к трем антимикробным препаратам (31,0%), также обнаружен изолят, имеющий устойчивость сразу к 19 антибиотикам из 21 используемого в рамках исследования.

Кроме того, отмечен рост резистентности среди изолятов бактерий рода Salmonella к цефалоспоринам: первого поколения (цефазолину) – на 18,0%, второго поколения (цефуроксиму) – на 50,0%, третьего поколения (цефотаксиму) – на 6,3%; к фторхинолонам: второго поколения (норфлоксацину) – на 15,0%, третьего поколения (левофлоксацину) – на 49,2%; к тетрациклинам: первого поколения (тетрациклину) – на 29,6%, второго поколения (доксициклину) – на 30,0%.

Наряду с этим за исследуемый период с 2022 по 2024 г. на 37,5% увеличилась устойчивость изолятов к хлорамфениколу/левомицетину и на 17,5% – к сульфаметоксазолу/триметоприму.

Возросла резистентность и к аминогликозидам: к амикацину (третье поколение) и канамицину (первое поколение) – на 12,5%, к стрептомицину (первое поколение) – на 10,8%.

Генов антибиотикорезистентности (blaCTX-M, blaOXA10, blaDHA, blaGES, blaKPC, blaOXA48-like, blaNDM, blaVIM) у выделенных бактерий рода Salmonella не установлено.

Постоянный мониторинг качества продукции животного происхождения позволит своевременно выявлять популяционные изменения циркулирующих штаммов бактерий и разрабатывать эффективные стратегии контроля для снижения риска передачи резистентных штаммов и генов резистентности человеку. В то же время определение тенденции устойчивости к лекарственным препаратам выделяемых штаммов позволит в том числе избежать необоснованного назначения антибактериальных препаратов как в сфере ветеринарии, так и в сфере здравоохранения в рамках эпидемиологического надзора за сальмонеллезами, учитывая принцип «Единое здоровье».