Филогенетический анализ изолятов вируса бешенства, выделенных от животных на территории Волгоградской области

ВВЕДЕНИЕ

Применение молекулярно-генетических исследований в эпизоотологии существенно расширило возможности надзора за зоонозными инфекциями. Сведения о внутривидовом разнообразии и степени родства генетических линий возбудителей инфекционных болезней, полученные в результате филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей отдельных генов и полных геномов, несут в себе ценную информацию о происхождении патогенов, особенностях их пространственного распространения и значении в патологии человека и животных. Сформировались и активно развиваются новые направления исследований и практической деятельности – молекулярная эпидемиология и геномный эпидемиологический надзор [1][2].

На территории Российской Федерации выявлено несколько генетических групп вируса бешенства, имеющих различную географическую привязку [3-7]. Представители генетической группы С («степная») [3] распространены наиболее широко и в настоящее время занимают территории от Восточной Европы до юга Сибири, Казахcтана и Северо-Восточного Китая [6][8-11]. С середины XX века основным резервуаром вируса бешенства на этой территории является лисица (Vulpes vulpes). Предполагалось, что эпизоотии «лисьего» бешенства начались в 1939 г. в Восточной Пруссии (Польский коридор) и за 20–30 лет распространились на запад (до Франции и Бельгии) и на восток (в Прибалтику, на Украину, в Белоруссию и западные регионы России) [12][13]. На картограммах хорошо прослеживается последовательное распространение «лисьего» бешенства в европейской части бывшего СССР [14]. В начале XXI века эпизоотии среди лисиц распространились на регионы Сибири (в Красноярский край и Забайкалье), которые оставались благополучными по бешенству на протяжении нескольких десятилетий [7][15].

В 1942 г. была описана вспышка бешенства среди диких животных в дельте Волги [13]. Считается, что этот район, наряду с Восточной Пруссией, послужил одним из центров распространения «лисьего» бешенства в СССР [13][16]. Нижнее Поволжье, в том числе Волгоградская область, вплоть до настоящего времени относится к числу наиболее неблагополучных по бешенству регионов России [7][16]. Практически вся территория Волгоградской области энзоотична [17][18]. Первичным резервуаром вируса бешенства здесь считается лисица, хотя в последние десятилетия до 38% всех зафиксированных случаев заболевания приходилось на собак и кошек, тогда как доля диких животных не превышала 25% [19]. Известно, что в 4 из 6 зарегистрированных после 2000 г. случаев бешенства у людей заражение произошло от собак и кошек [7][20]. Опубликованы нуклеотидные последовательности гена нуклеопротеина (гена N) всего двух изолятов вируса бешенства от животных из Волгоградской области, которые были отнесены к генетической группе С [3]. Сведения о генетическом разнообразии возбудителя бешенства в современный период для Волгоградской области представлены недостаточно, поэтому филогенетический анализ изолятов вируса из этого региона представляется актуальной научной задачей.

Целью работы являлось проведение филогенетического анализа современных изолятов вируса бешенства, выделенных от животных на территории Волгоградской области, на основании полноразмерной последовательности гена N.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Изучено 13 изолятов вируса бешенства, выделенных от животных на территории Волгоградской области в 2018–2021 гг. (табл. 1, рис. 1).

Выделение РНК из головного мозга животных и наработку в полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией двух перекрывающихся фрагментов генома, содержащих полноразмерный ген N вируса бешенства, с последующей очисткой и нуклеотидным секвенированием по Сэнгеру осуществляли согласно ранее опубликованному протоколу [5]. Полученные последовательности экспортировали в международную базу данных GenBank (номера доступа в GenBank представлены в таблице 1).

При выполнении филогенетического анализа использовали байесовский подход с применением пакета программ Bayesian Evolutionary Analysis Sampling Trees (BEAST X) [21]. Предварительно с помощью компьютерной программы Mega X оценивали модель, подходящую для построения филогенетического дерева, с определением байесовского коэффициента (BIC) и скорректированного коэффициента Акаике (AICc). По результатам теста была выбрана модель Хасегава – Кишино – Яно с гамма-распределением 4-й категории (HKY + G; ВIC = 21 360,059; AICc = 17 664,682) [22]. Филогенетическое дерево, отражающее апостериорную (эмпирическую, лат. a posteriori) вероятность времени образования внутренних (предковых) и терминальных узлов с 95%-м доверительным интервалом (95% ДИ), конструировали методом строгих молекулярных часов, устанавливая гетерохронную калибровку до года выделения образца, модель случайного начального дерева с постоянным размером популяции, длину марковской цепи Монте-Карло (MCMC) 1 × 10⁸ c частотой дискретизации 1 × 10⁵. Апостериорную прогностическую проверку проводили для всех таксонов, принадлежащих генетической группе С вируса бешенства.

Достоверность МСМС оценивали в программе Tracer при анализе выходных данных BEAST X [23].

Дерево аннотировали с помощью утилиты TreeAnnotator и установленных параметров устранения выбросов (burn-in = 10%, 10 000 000 состояний), максимальной достоверности клада (MCC) и сохранения заданной длины.

Визуализацию филогенетического дерева выполняли в программе FigTree v1.4.5 [24].

Для картографирования использована программа QGIS 3.2.1 и электронная ландшафтно-географическая карта Natural Earth. Точки на карту наносили по географическим координатам населенных пунктов, в которых выявлены случаи бешенства.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Была определена полноразмерная нуклеотидная последовательность гена N (1353 н.) 13 полевых изолятов вируса бешенства, выделенных от животных на территории десяти районов Волгоградской области в период c 2018 по 2021 г. Места выявления изолятов представлены на карте (рис. 1).

Согласно предварительному анализу, все изученные изоляты относятся к генетической группе С вируса бешенства. Поэтому для построения филогенетического дерева из базы данных GenBank были взяты полноразмерные последовательности всех имеющихся изолятов этой группы, выявленных на территории РФ, с известным годом обнаружения. Кроме того, анализ изучаемых последовательностей на наличие близкородственных последовательностей с помощью поисковой системы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) позволил определить близкородственные изоляты, выявленные в Казахстане, Молдове, Польше и на Украине. Они также были включены в филогенетический анализ. Для наглядного представления группы С среди других генетических вариантов вируса были включены по несколько изолятов из других генетических групп, циркулирующих на территории Европы и европейской части России (кроме представителей клада Arctic-related ввиду очень отдаленного генетического родства). Таким образом, в филогенетическое дерево было включено 178 полноразмерных последовательностей гена N вируса бешенства, из них 121 последовательность принадлежала представителям генетической группы С. Для лучшей читаемости рисунка группы изолятов, не имеющих близкого генетического родства с изучаемыми изолятами, были «свернуты» (англ. collapsed). Полученное филогенетическое дерево представлено на рисунке 2.

Согласно топологии дерева все изучаемые изоляты относятся к генетической группе С, современный ареал которой в пределах Российской Федерации простирается от западных границ и областей средней полосы европейской части страны до степных и лесостепных территорий Сибири, повсеместно уходя за границы России на юге [3][6][5][11]. Вирус бешенства генетической линии С в Волгоградской области выделяли как от диких плотоядных, так и от домашних и сельскохозяйственных животных.

Все изученные изоляты уникальны по сравнению с выявленными ранее, в том числе и из Волгоградской области, и образуют несколько групп с высокой оценкой апостериорной вероятности (ОАВ) друг с другом и с ранее изученными изолятами из российских и зарубежных регионов.

Так, изолят 490_4/2018/Volgograd проявляет значительное сходство (99,85%) с изолятом Rab-8-4, выявленным в Туркестанской области Казахстана. Предположительное время существования последнего общего предка (ПВСПОП) для этой группы – 2015,9 г. (95% ДИ – от 2012,1 до 2016,93 г.), ОАВ группы – 1,0.

Изоляты 1299/143/2021/Volgograd и 1299/148/2021/Volgograd проявляют наибольшее родство с изолятами, выявленными ранее во Владимирской, Липецкой, Нижегородской и Рязанской областях (более 98,67%). ПВСПОП для этой группы – 2007,95 г. (95% ДИ – от 2002,48 до 2009,67 г.), ОАВ группы – 1,0.

Группа изолятов (490_2/2018/Volgograd, 1299/138/2021/Volgograd, 1299/139/2021/Volgograd, 1563/2018/Volgograd) проявляет наибольшее родство (более 98,9%) с изолятами, выявленными ранее в Нижегородской и Липецкой областях (но уже с другими, чем в предыдущих случаях). ПВСПОП для этой группы – 2001,43 г. (95% ДИ – от 1994,02 до 2002,65 г.), ОАВ группы – 1,0.

Еще пять изолятов из Волгоградской области (1299/142/2021/Volgograd, 1299/147/2021/Volgograd, 1299/141/2021/Volgograd, 1299/144/2021/Volgograd, 1299/146/2021/Volgograd) образуют группу с высокой ОАВ (1,0) с изолятами из Белгородской, Липецкой, Рязанской, Смоленской, Курской, Нижегородской, Московской областей, а также с изолятами, выявленными на территории других государств – Молдовы, Украины и Польши. Примечательно, что эта относительно плотная в генетическом отношении группа занимает чрезвычайно обширный ареал, простирающийся как минимум с севера на юг на 1000 км и с запада на восток на 2000 км. ПВСПОП для этой группы – 1996,13 г. (95% ДИ – от 1989,12 до 2003,42 г.).

Изолят 1299/145/2021/Volgograd генетически значительно отличается от других волгоградских изолятов и наибольшее (хотя и не слишком близкое) родство проявляет с изолятами, выявленными в Астраханской области (98,74%). Он образует группу, поддержанную высокой ОАВ (0,98), с изолятами вируса бешенства, выявленными в Оренбургской и Астраханской областях, а также в Казахстане. ПВСПОП для этой группы – 1978,98 г. (от 1974,35 до 1983,97 г.).

Два изолята (2070f и 2072f), выявленные в Волгоградской области I. V. Kuzmin et al. [3] в 2003 г., значительно отличаются от изучаемых изолятов из этого региона. Изолят 2070f образует группу с изолятом 1350/2008/Krasnodar из Краснодарского края (ОАВ – 1,0; ПВСПОП – 1984,33 г.; 95% ДИ – от 1977,17 до 1989,78 г.), а у изолята 2072f, хотя и наблюдается генетическое родство с изолятом 2070f (99,1%), однако эта группа имеет очень низкую поддержку ОАВ – 0,19.

Количество исследованных изолятов от разных групп животных примерно соответствует структуре заболеваемости за 2020–2024 гг. Более половины из них получены от собак и кошек (табл. 2).

Таким образом, основной характеристикой популяции вируса бешенства в Волгоградской области является сильно выраженная гетерогенность, возможно, максимальная для регионов, изученных на данный момент достаточно хорошо. При этом практически все представители волгоградской популяции возбудителя бешенства имеют близких родственников в других регионах России и зарубежья, что говорит об активном перемещении вируса. Согласно литературным данным, нарастание эпизоотической напряженности имело место в Волгоградской области в 1988, 1991, 1997, 1998 и 2001 гг. [17]. Представители волгоградской популяции вируса бешенства относятся к разным генетическим вариантам, которые сформировались в разное время, на что указывает предположительный возраст последнего общего предка для этих вариантов. Возможно, пики эпизоотической напряженности совпадают по времени с распространением новых вариантов, после чего они «закрепляются» среди восприимчивых хозяев на определенной территории, продолжают эволюционировать и к настоящему времени дают такой пестрый генетический профиль популяции.

Обращают на себя внимание особенности локализации разных подгрупп вируса бешенства. Волгоградская область занимает срединную часть юго-востока Русской (Восточно-Европейской) равнины в пределах трех природных зон: лесостепной, степной и полупустынной [25]. Изоляты, собранные в лесостепных и степных районах северной части Волгоградской области на правобережье Волги (490_2/2018/Volgograd, 1563/2018/Volgograd, 1299/138/2021/Volgograd, 1299/139/2021/Volgograd, 1299/143/2021/Volgograd, 1299/144/2021/Volgograd, 1299/148/2021/Volgograd), имеют генетическое родство с изолятами из Среднего Поволжья и центральных регионов России. Вероятно, этому способствует отсутствие естественных барьеров для миграций диких плотоядных в северном направлении. Смежные территории характеризуются достаточно высокой численностью лисицы [26]. Изоляты вируса бешенства 1299/141/2021/Volgograd, 1299/142/2021/Volgograd, 1299/147/2021/Volgograd, имеющие сходство с изолятами, обнаруженными на Украине, в Молдове, Польше, западных и центральных регионах европейской части России, выявлены в юго-западной части Волгоградской области на правобережье Цимлянского водохранилища. Изоляты с левобережья Волги (490_4/2018/Volgograd, 1299/145/2021/Volgograd) генетически близки к изолятам с территорий, граничащих с Волгоградской областью на юге и востоке, что обусловлено общностью ландшафтов с полупустынями и сухими степями Казахстана и Астраханской области. Широкие водные преграды (Цимлянское, Волгоградское водохранилища и Волго-Донской канал), пересекающие всю область с северо-востока на юго-запад, замерзают на 2–3 мес. в году [25] и в течение большей части года представляют естественный барьер для распространения бешенства. В нашем распоряжении было всего 2 изолята с левобережья Волги, но оба отличались от изолятов с правого берега. Так, изолят 1299/145/2021/Volgograd, выявленный в Быковском районе Волгоградской области, группируется с изолятами, обнаруженными в Оренбургской и Астраханской (точное место происхождения изолятов неизвестно) областях, а также в Казахстане. Изолят 490/4/2018/Volgograd, выявленный в Палласовском районе Волгоградской области, имеет несколько близкородственных изолятов из Казахстана и один (что составляет единственное исключение) – из Нижегородской области. Районы с наиболее высокими показателями заболеваемости животных бешенством (Николаевский, Быковский, Ленинский, Октябрьский) [19] расположены на левом берегу Волги. Волго-Ахтубинская пойма, по-видимому, служит значимым экологическим руслом, связывающим Волгоградскую и Астраханскую области, что подтверждается генетическим сходством изолятов с этих территорий (1299/145/2021/Volgograd). Ограниченное количество исследованных изолятов не позволяет сделать более определенных выводов. Тем не менее полученные результаты заслуживают внимания для продолжения исследований и планирования мероприятий по оральной вакцинации лисиц.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Все изученные изоляты вируса бешенства, выделенные от животных на территории Волгоградской области, отнесены к генетической группе С. В пределах этой линии популяция возбудителя бешенства в Волгоградской области отличается чрезвычайно высокой генетической вариабельностью. Генетическое родство изолятов из этого региона с изолятами из Казахстана, Молдовы, центральных и южных регионов России, с Украины свидетельствует об интенсивном перемещении хозяев вируса бешенства. Это обстоятельство необходимо учитывать при организации противоэпизоотических мероприятий.