Разработка и апробация набора хромогенных сред для экспресс-диагностики мастита крупного рогатого скота

ВВЕДЕНИЕ

Мастит крупного рогатого скота – это воспаление молочной железы, которое является одним из самых распространенных и экономически значимых заболеваний в молочном животноводстве [1][2][3]. Его распространение связано со множеством факторов, включающих нарушение гигиены доения, плохие условия содержания коров, неправильную технику доения, снижение иммунитета животных и отсутствие своевременной профилактики [4][5][6]. Мастит может протекать как в клинической форме с явными симптомами, такими как отек, покраснение и болезненность вымени, так и в субклинической, когда признаки воспаления отсутствуют, но качество молока ухудшается [7].

Этиология мастита включает две основные группы причин: механические и инфекционные. Механические связаны с травмами вымени, которые могут возникать вследствие неправильной техники доения, использования неисправного доильного оборудования, ушибов или повреждений при выпасе. Такие травмы создают благоприятные условия для возникновения инфекционного процесса, что может привести к развитию воспаления [8]. Однако основную роль в возникновении маститов играют патогенные микроорганизмы [9].

Наиболее распространенными возбудителями мастита являются Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli и другие [10][11]. S. aureus является одним из наиболее опасных возбудителей, так как он способен вызывать хронические формы мастита, устойчивые к лечению [12][13][14][15]. S. agalactiae передается в основном через доильное оборудование и может длительное время сохраняться в организме коровы [16]. E. coli часто вызывает острые формы мастита, сопровождающиеся тяжелыми симптомами [17].

Для диагностики инфекционного мастита коров в арсенале ветеринарного врача существует ряд инструментов, которые имеют свои преимущества и недостатки [18][19][20][21][22][23][24]. Одним из наиболее распространенных методов является бактериологическое исследование молока [25][26]. Для этого образцы молока отбирают с соблюдением стерильности и высевают на питательные среды. После инкубации в термостате проводят идентификацию микроорганизмов по их морфологическим, биохимическим и культуральным свойствам. Этот метод позволяет точно определить возбудителя и подобрать эффективное лечение, однако он требует времени (2–3 дня) и специального оборудования [27]. Для ускорения диагностики инфекционного мастита могут использоваться хромогенные среды. Они содержат специальные субстраты, которые изменяют цвет под действием ферментов, вырабатываемых определенными микроорганизмами, и уже на следующие сутки после посева можно определить этиологическую единицу возбудителя мастита. На данный момент применяются различные виды экспресс-тестов, а именно подложки с питательной средой Compact Dry (R-Biopharm AG, Германия) или RIDA® COUNT (Chisso Corporation, Япония) [28][29]. Линейки наборов представлены различными тестами, направленными на выявление S. aureus, энтеробактерий, сальмонелл и на определение общего микробного числа, бактерий из группы кишечной палочки, дрожжей и плесеней.

В лаборатории диагностики и контроля антибиотикорезистентности возбудителей наиболее клинически значимых инфекционных болезней животных ФГБНУ «Федеральный научный центр – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К. И. Скрябина и Я. Р. Коваленко Российской академии наук» (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) была предложена собственная рецептура набора хромогенных сред, позволяющая дифференцировать возбудителей мастита, не прибегая к длительным лабораторным исследованиям. Набор представлен тремя различными хромогенными средами, которые при комплексном использовании позволяют сделать заключение о спектре возбудителей мастита в каждом конкретном случае. Это дает возможность установить спектр возбудителей, что, в свою очередь, может повлиять на выбор дальнейшей терапии.

Цель работы – определить эффективность и качество предложенного набора хромогенных сред для диагностики мастита крупного рогатого скота.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Хромогенные среды. Было приготовлено три хромогенные питательные среды.

Среда I предназначена для определения и дифференциации наиболее часто встречаемых микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae.

Среда II предназначена для определения и дифференциации микроорганизмов рода Staphylococcus.

Среда III предназначена для определения и дифференциации микроорганизмов рода Streptococcus (в частности, S. agalactiae).

Для удобства применения три среды разместили в одной чашке Петри с секторами.

Эффективность хромогенных питательных сред определяли по ряду критериев: чувствительность, специфичность, культуральные свойства контрольных штаммов микроорганизмов, дифференцирующие и ингибирующие свойства. В качестве контрольной использовали коммерческую среду – колумбийский кровяной агар (HiMedia Laboratories Pvt Ltd., Индия) с добавлением 5% дефибринированной крови барана.

Контрольные штаммы. В качестве контрольных штаммов служили 22 культуры разных видов микроорганизмов из коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов – возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН: E. coli ATCC 25922, S. agalactiae ATCC 8057, S. aureus ATCC 12600, Klebsiella pneumoniae B-1392, Proteus mirabilis B-1382, Pseudomonas aeruginosa B-1366, Salmonella typhimurium B-1025, Enterococcus faecalis B-1399, Enterococcus faecium 1921, Acinetobacter baumannii 2516, Enterobacter cloacae 1322, Staphylococcus hominis 1377, Staphylococcus equorum 2511, Staphylococcus haemolyticus 2505, Staphylococcus pseudintermedius B-1849, Morganella morganii 1418, Streptococcus uberis 2114, Streptococcus dysgalactiae 2432, Streptococcus pyogenes 1972, Aerococcus viridans 2320, Streptococcus canis 2326, Streptococcus suis 2383.

Подготовка разведений бактериальных суспензий. Исходные бактериальные взвеси готовили с концентрацией 1 × 10⁸ – 1 × 10⁹ КОЕ/мл, используя фармакопейный стандартный образец (ФСО 3.1.00085). Для получения необходимых посевных концентраций исходные суспензии последовательно титровали десятикратными разведениями.

Определение чувствительности. На исследуемые хромогенные и контрольную среды высевали штаммы S. agalactiae, S. aureus и E. coli по 1 мл в различных концентрациях: 1 × 10⁰, 1 × 10¹, 1 × 10² КОЕ/мл. Через (24 ± 2) ч инкубации при 37 °C сравнивали количество выросших колоний во всех посевах. Опыт проводили в трех повторностях. Для сравнения средних значений групп и определения статистически значимых различий между ними использовали тест Стьюдента (t-критерий): если p-значение < 0,05, различия считаются статистически значимыми.

Оценка специфичности. Специфичность определяли для каждой хромогенной среды отдельно. Сравнивали рост и характер изменений колоний различных штаммов бактерий на одной и той же опытной среде и отмечали наличие сходства или различий.

Оценка дифференцирующих свойств. Для определения дифференцирующих свойств сравнивали изменения контрольных штаммов на хромогенных и контрольной средах (структура, цвет колоний, цвет среды вокруг колоний).

Оценка ингибирующих свойств. Ингибирующие свойства определяли по наличию или отсутствию роста культур на хромогенных средах в сравнении с наличием роста на контрольной среде.

Апробация сред с образцами маститного молока. Было отобрано 8 образцов молока в количестве 10 мл от коров с маститом, который подтверждали тестом на соматические клетки «Кенотест» (CID Lines, Бельгия). Отбор проводили в стерильные контейнеры для хранения биологического материала. Срок хранения молока перед посевом составлял не более 2 ч с момента отбора. Температура хранения была в пределах +4…+8 °C. Посев совершали с помощью стерильного ватного тампона: погружали его в молоко, удаляли излишки влаги о стенки контейнера, после чего образец засевали сплошным газоном на три хромогенные среды. Учет результатов проводили после культивирования в течение 24 ч при температуре 37 °C.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для определения чувствительности хромогенных сред использовали три целевых штамма (S. agalactiae, S. aureus и E. coli), которые засевали по 1 мл в трех разных концентрациях (1 × 10⁰, 1 × 10¹, 1 × 10² КОЕ/мл). После культивирования в течение суток при 37 °C подсчитывали количество колониеобразующих единиц на всех средах. Результаты представлены в таблице 1.

Для выявления статистически значимого различия или сходства использовали тест Стьюдента, результаты которого представлены в таблице 2.

Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что хромогенные среды обеспечивают сопоставимые с контрольной средой результаты по чувствительности, что подтверждает статистический анализ (t-критерий Стьюдента, p > 0,05): различия между хромогенными средами и контрольной средой не являются статистически значимыми для всех используемых штаммов и концентраций. Таким образом, хромогенные среды обеспечивают хорошую высеваемость целевых микроорганизмов даже в минимальном количестве.

Изучение специфичности, дифференцирующих и ингибирующих свойств хромогенных сред проводили одномоментно с использованием 22 штаммов микроорганизмов различных видов. Результаты представлены в таблице 3.

Установлено, что среда I обладает высокой специфичностью: большинство исследуемых бактерий образовывали колонии с уникальными цветами. Например, E. coli формировали бордовые колонии, S. aureus – золотистые, P. aeruginosa – серо-зеленые, а S. equorum – фиолетово-розовые. Однако некоторые микроорганизмы, такие как E. cloacae и K. pneumoniae, имели схожий цвет колоний (фиолетово-синий), что может затруднить их визуальное различие. Ингибирующие свойства были выражены слабо: все исследуемые штаммы микроорганизмов демонстрировали рост в течение 24 ч. Тем не менее среда I обеспечивала эффективную дифференциацию контрольных штаммов по цвету колоний, что позволяет уже на ранних этапах визуально различать микроорганизмы.

Ингибирующие свойства среды II выражены сильно: рост большинства бактерий отсутствовал, за исключением целевых микроорганизмов – Staphylococcus spp. Стоит отметить, что специфичность у среды невысокая – большинство стафилококков окрашивались в сине-зеленый цвет. Однако одинаковый цвет имели преимущественно сапрофитные микроорганизмы, в то время как потенциально патогенные стафилококки (S. aureus и S. haemolyticus) отличались по цвету. Например, S. aureus образовали фиолетовые колонии, а S. hominis и S. equorum – сине-зеленые, что позволило визуально различить их. По сравнению с контрольной среда II обеспечивала дифференциацию стафилококков по цвету.

Среда III продемонстрировала хорошие ингибирующие свойства, эффективно подавляя рост большинства микроорганизмов, за исключением грамположительных кокков и некоторых представителей семейства Enterobacteriaceae. Дифференцирующие и специфические свойства среды были выражены слабо и проявлялись преимущественно для энтерококков, которые окрашивались в сине-зеленый цвет, и для S. agalactiae, образующих голубые колонии.

Использование в сочетании всех трех хромогенных сред обеспечивает комплексный подход к диагностике мастита, демонстрируя высокую чувствительность, специфичность и дифференцирующие свойства. Такой метод позволяет охватить широкий спектр микроорганизмов, избирательно выделяя целевые группы бактерий, такие как стафилококки, стрептококки и энтерококки.

Для проверки сред в реальных условиях были отобраны образцы молока, которые в дальнейшем высевали на три хромогенные среды. Результаты представлены на рисунке.

Использование одновременно трех сред для посева молока позволяет дифференцировать культуры практически до вида. Так, на рисунке (a) видно, что на средах I и III выросли микроорганизмы рода Enterococcus sp. (предположительно, E. faecalis, поскольку E. faecium имеет более темный зеленый цвет). Единичные колонии на среде II представлены бактериями Staphylococcus sp., при этом исключается рост S. aureus, поскольку он на среде II должен иметь фиолетовый цвет. Также можно увидеть бордовые колонии на среде I, что говорит о наличии E. coli в исследуемом образце. На рисунке (b) микробиом образца представлен практически только Enterococcus sp. Белые и зеленые колонии на средах I и II соответственно сформированы микроорганизмами рода Staphylococcus sp., но не S. aureus. На рисунке (c) представлена монокультура бактерий из рода Enterococcus sp., предположительно E. faecium. В четвертом образце на рисунке (d) все выделенные изоляты являются мицелиальными грибами. Еще одна проба молока показала результаты, схожие с рисунком (b), в трех других посевах рост микроорганизмов отсутствовал.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанные хромогенные среды демонстрируют высокую эффективность для диагностики мастита крупного рогатого скота. Среда I, обладая высокой чувствительностью и дифференцирующими свойствами, позволяет проводить первичный скрининг и выявлять широкий спектр микроорганизмов, включающий представителей семейства Enterobacteriaceae. Среда II благодаря сильным ингибирующим свойствам избирательно выделяет стафилококки, что особенно важно для идентификации патогенных видов, таких как S. aureus. Среда III, хотя и имеет ограниченные дифференцирующие свойства, эффективно поддерживает рост энтерококков и стрептококков, в том числе S. agalactiae, что делает ее важной для диагностики мастита.

Комплексное использование всех трех сред обеспечивает высокую точность диагностики, позволяя не только охватить широкий спектр микроорганизмов, но и избирательно выделить целевые группы бактерий. Это значительно ускоряет процесс идентификации возбудителей и способствует своевременному назначению эффективной терапии. Апробация сред на образцах молока от коров с маститом подтвердила их практическую применимость и эффективность в реальных условиях.

В ходе исследований было отмечено, что на средах возможно развитие мицелиальных грибов, что может затруднить интерпретацию результатов. В связи с этим планируется продолжить работу по улучшению составов сред, исследуя различные препараты в разных концентрациях для ингибирования роста грибов. Это позволит повысить специфичность сред и исключить ложноположительные результаты, связанные с развитием нецелевых микроорганизмов.

Стоит отметить, что при использовании стандартизированных одноразовых петель для посева молока существует возможность примерного определения количества колониеобразующих единиц. Хотя этот метод не обеспечивает высокой точности, он позволяет примерно оценить степень обсемененности молока, что может быть полезно для предварительной оценки тяжести инфекции.

Таким образом, разработанные хромогенные среды представляют собой перспективный инструмент для экспресс-диагностики мастита, сочетающий в себе высокую чувствительность, специфичность и дифференцирующие свойства. Их использование в ветеринарной практике может значительно ускорить диагностику и улучшить эффективность лечения мастита, что положительно скажется на здоровье животных и продуктивности молочного стада.

Вклад авторов: Капустин А. В. – разработка концепции исследования, утверждение окончательного варианта статьи; Лаишевцев А. И. – подготовка и редактирование текста, утверждение окончательного варианта статьи; Савинов В. А. – разработка концепции и проведение исследований, сбор данных, их анализ и интерпретация, проведение статистического анализа; Шастин П. Н. – проведение исследований, сбор данных, их анализ и интерпретация, подготовка и редактирование текста; Гильманов Х. Х. – проведение исследований, сбор данных, их анализ и интерпретация, проведение статистического анализа; Хабарова А. В. – разработка концепции и проведение исследований, сбор данных, их анализ и интерпретация.

Contribution of the authors: Kapustin A. V. – conceptualization, final manuscript approval; Laishevtsev A. I. – text preparation and editing, final manuscript approval; Savinov V. A. – conceptualization and test conducting, data collection, analysis and interpretation, statistical analysis; Shastin P. N. – test conducting, data collection, analysis and interpretation, text preparation and editing; Gilmanov Kh. Kh. – test conducting, data collection, analysis and interpretation, statistical analysis; Khabarova A. V. – conceptualization and test conducting, data collection, analysis and interpretation.