Отработка режима лиофилизации гипериммунной хламидийной сыворотки

ВВЕДЕНИЕ

Хламидиоз – зооантропонозная инфекционная болезнь, этиологическим фактором которой являются грамотрицательные бактерии семейства Chlamydiaceae рода Chlamydia [1-4]. Попадая в организм животного (крупный рогатый скот, овцы, свиньи, лошади, грызуны, птицы, кошки, собаки и многие другие), хламидии поражают различные его системы [5], в том числе и иммунную, что, в свою очередь, способствует последующему заражению этих животных возбудителями инфекционных заболеваний, сопутствующих хламидиозу [1]. Наложение различных клинических признаков у животных с хламидиозом и сопутствующей инфекцией на практике мешает правильной и своевременной постановке диагноза [6]. Инфекционный процесс при хламидиозе чаще протекает в хронической форме, что также препятствует своевременному выявлению инфицированных животных после заноса возбудителя в стадо [7].

Современный ареал хламидийной инфекции сельскохозяйственных и диких животных охватывает все континенты, в связи с этим проблема ее диагностики на сегодняшний день является актуальной [8][9].

В настоящее время для постановки первичного диагноза, проведения скрининговых исследований и отдельных этапов эпизоотологических обследований с целью выявления хламидионосителей в нашей стране применяют «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных» (РОСС RU Д-RU.РА01.В.19342/23) [10][11].

При производстве средств диагностики важной задачей является обеспечение стабильности биологических свойств различных компонентов тест-систем в процессе изготовления, хранения и транспортировки [12][13]. Одним из путей решения этой проблемы является стабилизация белковых молекул различных компонентов диагностических препаратов посредством лиофилизации [14-16].

«Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных» производства ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (Россия) укомплектован двумя антигенами (специфическим и контрольным) и двумя видами сывороток крови животных (положительной и отрицательной к хламидийному антигену). Все компоненты набора выпускаются в лиофилизированном состоянии [10].

В процессе разработки тест-системы для каждого компонента набора подобраны специальные режимы лиофилизации, причем режим лиофилизации отрабатывается для каждого сушильного аппарата в зависимости от модели и характеристик, параметры процесса лиофильной сушки каждого компонента могут варьироваться.

В ходе обновления технической базы производственной площадки для изготовления диагностических тест-систем была закуплена камерная лиофильная сушилка Scientz 30F (Китай). Данная модель обладает более мощным вакуумным насосом и холодильным агрегатом. В результате появилась возможность сократить время сушки препаратов, сохраняя загружаемый объем серии. К тому же благодаря наличию в конструкции аппарата электронного блока управления параметрами сушки регулировка температурного режима и силы вакуума стала более точной, что позволило выставить больше контрольных точек процесса. Поэтому прежний режим сушки, используемый на устаревшем оборудовании меньшей мощности при отсутствии точного контроля параметров процесса, стал неприемлем – следовало отработать новые параметры и критерии контроля процесса лиофилизации. Научная новизна работы заключается в разработке новых параметров лиофилизации специфической хламидийной сыворотки на новом оборудовании с сохранением заявленных в технических условиях (ТУ) характеристик.

В связи с этим целью настоящего исследования явилась отработка режима лиофилизации специфической хламидийной сыворотки, оценка ее соответствия характеристикам, заявленным в ТУ на контроль тест-системы, и испытание стабильности этого компонента.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа проводилась в условиях лаборатории вирусных заболеваний животных ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

Штамм. Для получения инактивированного антигена использовали штамм «АМК-16» Chlamydia psittaci с инфекционным титром 10^–5,4 ЛД₅₀/0,3 мл, депонированный в коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (рег. № 11 от 5 сентября 2017 г.).

Биологические модели. Культивирование хламидий для изготовления антигена осуществляли на 6–7-суточных куриных эмбрионах. Для получения гипериммунных сывороток использовали овец романовской породы в возрасте 1,5 года, живой массой 45–50 кг.

В ходе проведения экспериментальных манипуляций с животными были соблюдены требования Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22.09.2010 по охране животных, используемых в научных целях.

Тест-системы. При постановке реакции связывания комплемента (РСК) использовали «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных» (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», г. Казань).

Оборудование. Сублимацию гипериммунных сывороток проводили в камерной лиофильной сушилке Scientz 30F (Китай).

Методы. Антиген для иммунизации овец готовили из инфицированных желточных оболочек эмбрионов кур, павших на 4–7-е сут после заражения, путем их гомогенизирования в фосфатно-солевом буфере (pH 7,2) в соотношении 1:9 с последующим дифференциальным центрифугированием для удаления балластных веществ, инактивации формалином и концентрации [17].

Сыворотку получали из крови овец, которых иммунизировали специфическим хламидийным антигеном, эмульгированным в оригинальном маслоланолиновом адъюванте. Антигенную активность сывороток устанавливали в РСК со специфическим хламидийным антигеном согласно ТУ 9388-020-00492374-2007.

Обескровливание овец проводили под анестезией. Взятие крови производили из яремной вены. Кровь собирали в стерильные стеклянные флаконы, внутренняя поверхность которых была смочена физиологическим раствором. Для отделения сыворотки крови флаконы с кровью помещали в термостат на 40–60 мин, после чего сгустки отделяли от стенок посуды и помещали флаконы в холодильную камеру при температуре 4 °С на 24 ч. Отделившуюся сыворотку крови декантировали от сгустков, центрифугировали при 3,5 тыс. об/мин в течение 20 мин для удаления эритроцитов и консервировали борной кислотой.

Полученные сыворотки разливали в спаренные стеклянные ампулы ОСТ 64-2-485-85 (Россия) в объеме 1,0 см³ с использованием одноканального диспенсера BioHit (Финляндия). Всего для исследования было получено три серии гипериммунных сывороток крови овец.

Все серии сыворотки были разделены на две равные части и высушены (сублимированы) при двух разных технологических режимах лиофилизации.

До проведения процедуры лиофилизации сыворотку в ампулах замораживали в камере лиофильной сушилки при температуре минус 60 °С с экспозицией 14 ч.

Лиофилизированный препарат закладывали на хранение на срок 24 мес. при температуре 18–22 °С. Каждый месяц проводили исследования высушенной гипериммунной сыворотки в РСК с целью оценки ее активности и определения срока хранения.

Антигенную активность сывороток крови до и после лиофилизации (сублимации) определяли в РСК в соответствии с «Инструкцией по применению набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных», утвержденной директором ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 19.05.2016 (РОСС RU Д-RU.РА01.В.19342/23).

Реакцию ставили в объеме 1,0 см³ в пробирках Флоринского. Антиген при постановке реакции применяли в рабочей дозе, сыворотки инактивировали 30 мин и титровали путем двукратных разведений начиная с 1:5. Перед постановкой реакции проводили титрование комплемента в гемолитической системе, используя его удвоенную дозу, с целью контроля специфичности реакции применяли иммунную хламидийную и заведомо отрицательную сыворотку, а также контрольный антиген. Гемолитическую систему готовили из 2,5%-й смеси отмытых эритроцитов барана и стандартной гемолитической сыворотки в двойном титре. Реакцию проводили на водяной бане при 37 °С. За диагностический титр принимали разведение сыворотки 1:10, разведение 1:5 считали сомнительным результатом [18].

Готовый препарат должен был соответствовать характеристикам, описанным в ТУ 9388-020-00492374-2007.

Полученную сыворотку оценивали по следующим показателям: внешний вид, цвет, наличие посторонних примесей и плесени, массовая доля влаги, растворимость, активность и специфичность в РСК и длительность хранения.

Внешний вид, цвет и наличие посторонних примесей и плесени определяли визуально.

Для определения растворимости полученных лиофилизированных препаратов в ампулы вносили по 1,0 см³ физиологического раствора, после чего ампулы встряхивали и замеряли время полного растворения сублимированных сывороток.

Определение массовой доли влаги в лиофилизированном препарате проводили в соответствии с правилами, описанными в ГОСТ 24061-2012. Сублимированные сыворотки крови массой 0,1 г измельчали до порошкообразного состояния. Полученные пробы равномерно распределяли по дну заранее взвешенной бюксы. После взвешивания бюксы с препаратом помещали в сушильный шкаф и выдерживали при температуре 105 °С при экспозиции 60 мин. Далее препарат охлаждали и взвешивали.

Массовую долю влаги вычисляли по формуле [19]:

где Х – массовая доля влаги, %;

М₁ – масса бюксы с пробой до высушивания, г;

М₂ – масса бюксы с пробой после высушивания, г;

М₀ – масса бюксы без пробы, г.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На первом этапе исследований определяли антигенную активность полученных сывороток крови овец. Все три серии сывороток реагировали в РСК с хламидийным антигеном в титре 1:160.

Далее сыворотки, разлитые в ампулы по 1,0 см³ и замороженные до температуры минус 60 °С, лиофилизировали двумя разными способами.

Показатели температурных режимов и вакуума при лиофилизации гипериммунных сывороток крови овец первым способом представлены на рисунке 1.

Данный способ лиофилизации включал в себя выдерживание сывороток крови под вакуумом в течение 26 ч при плавном понижении давления с 148 до 100 Па в первые 25 ч и до 40 Па в следующий час. Охлаждение полок осуществляли в течение первых 7 ч. Далее в течение последующих 6 ч (с 8 до 13 ч после начала сублимации) полки нагревали до температуры 0,2–0,8 °С и с 14-го по 21-й ч от начала сушки температура полок находилась в этих пределах. Полки аппарата переводили в режим нагрева (до температуры 35 °С) на 22-й ч лиофилизации. Сыворотку в таком режиме сушили еще 4 ч, пока ее температура в ампулах не достигла 25 °С.

Показатели температурных режимов и вакуума при лиофилизации гипериммунных сывороток крови овец вторым способом представлены на рисунке 2.

Отличие второго способа заключалось в том, что в 1-й ч после загрузки препарата в аппарат вакуум поддерживался на уровне 11 Па. На протяжении следующих 3 ч давление в камере аппарата плавно повышалось до 43 Па и находилось на этом уровне в течение дальнейших 5 ч. С 9-го по 11-й ч после начала сушки давление в камере повышалось до 47 Па. Начиная с 13-го и по 20-й ч процесса лиофилизации давление в камере понижалось до 2,2 Па. Охлаждение полок лиофильного аппарата длилось 1 ч. С 2-го по 9-й ч полки плавно нагревали до температуры 0,6 °С. На этом уровне температура полок находилась в течение последующих 10 ч (начиная с 10-го ч и заканчивая 20-м ч после начала сушки). В последние 2 ч сушки сыворотки полки аппарата нагревали до температуры от 1 до 54 °С, пока температура продукта в ампулах не поднималась до 25 °С.

На рисунке 3 представлены фотографии гипериммунных сывороток крови, лиофилизированных двумя вышеописанными способами.

В таблице отражены результаты оценки соответствия лиофилизированных сывороток заявленным характеристикам.

Установлено, что сублимированная первым способом сыворотка не соответствовала заявленным характеристикам. В ампуле не образовалась гомогенная масса в виде таблетки, и полученный препарат плохо растворялся в воде. Сыворотка, высушенная по второму способу, полностью соответствовала заявленным характеристикам.

Далее для оценки активности гипериммунной сыворотки в процессе длительного хранения использовали образец, сублимированный по второму способу.

Результаты оценки антигенной активности лиофилизированной хламидийной гипериммунной сыворотки в течение 24 мес. после сублимирования представлены на рисунке 4.

Выявлено, что на протяжении двух лет после лиофилизации активность гипериммунных сывороток крови овец не опускалась ниже заявленного в ТУ титра антител (1:40). На 4, 12 и 21-й мес. хранения по одной сыворотке из трех прореагировали в титре 1:80, в связи с этим средний титр на данном сроке исследования был равен 1:133. В последующие месяцы все сыворотки реагировали в титре 1:160. Предположительно, снижение титра хламидийных антител на один титр, выявляемое на некоторых сроках исследования, связано с погрешностями в постановке РСК.

ОБСУЖДЕНИЕ

Как показывает практика, наиболее оптимальным способом консервации для длительного хранения сывороток крови является лиофилизация [20]. Ранее для сублимации специфической хламидийной сыворотки, которая является одним из компонентов производимого диагностического набора, нами был отработан оптимальный режим сушки для имеющегося на тот момент оборудования. Препараты, сублимированные согласно этому технологическому режиму, соответствовали характеристикам ТУ для производимой тест-системы. В ходе обновления технической базы производственной площадки была закуплена новая современная лиофильная сушилка, обладающая более мощными характеристиками, большим объемом сушильной камеры и имеющая электронный блок управления, позволяющий отслеживать и регулировать температурный режим и силу вакуума.

В настоящей работе представлены два технологических режима лиофилизирования специфической хламидийной сыворотки. Первый был максимально приближен к режиму, применяемому для сушки на старом оборудовании. Данный способ сублимации оказался не подходящим для нового оборудования. В связи с этим был разработан новый технологический режим (второй способ сублимации).

В научной литературе представлены сведения о разработке режимов сублимирования специфических сывороток и иммуноглобулинов для диагностических тест-систем. Продолжительность сушки этих препаратов находится в пределах от 24 до 30 ч [14][16][21][22]. Первый способ сублимации, применяемый в работе, по времени занимал 26 ч. Технологический режим, разработанный для нового оборудования (второй способ сублимации), позволил сократить срок сушки до 22 ч, что явилось первым отличием между двумя способами.

Другое отличие – температурные режимы нагрева полок аппарата. При первом способе сублимации специфической сыворотки первые 6 ч температура полок аппарата колебалась в пределах от минус 39 до минус 38 °С. Тогда как при втором способе лиофилизации сыворотки загружали в охлажденную до температуры минус 35 °С камеру аппарата и с первого часа начинали нагрев полок сначала до температуры минус 4 °С (первые 8 ч), потом до плюс 0,5 °С (следующие 10 ч). Процесс возгонки при заданных параметрах в первом случае протекал в течение 22 ч, во втором случае – в течение 20 ч. В первом случае процесс возгонки в течение первых 6 ч после начала лиофилизации протекал слишком медленно в связи с очень низкой температурой и относительно низким вакуумом. Далее при нагреве полок вакуум на протяжении всего процесса сушки также имел достаточно низкие значения (от 135 до 101 Па на этапе сублимации), что вкупе не позволило всей влаге испариться из препарата за заданный промежуток времени. Остаточная влага в процессе досушивания конденсировалась и растворила часть таблетки сублимированной сыворотки в ампуле (рис. 3). При сублимации вторым способом были подобраны оптимальный температурный режим и вакуум, которые позволили получать лиофилизированную специфическую сыворотку надлежащего качества.

В работе А. В. Комиссарова и соавт. представлены данные о корреляции времени лиофилизации сывороток крови с объемом сублимируемого препарата, которые указывают на сокращение продолжительности сушки при уменьшении объема загружаемой в аппарат сыворотки [14]. В нашем исследовании было установлено, что первый способ сублимации не позволял всей влаге возгнаться и конденсироваться на змеевике-охладителе в установленный временной промежуток, хотя для предыдущего аппарата этот технологический режим лиофилизации являлся оптимальным. Это связано с увеличением объема сублимируемого препарата на новом оборудовании, имеющем больший объем сушильной камеры. Исходя из этого, для оптимизации процесса лиофилизации можно увеличить продолжительность охлаждения полок аппарата, что позволило бы усовершенствовать процесс сушки, но значительно увеличило бы время сублимации. Однако существует способ сокращения длительности лиофилизации различных препаратов путем подбора оптимального режима ускоренного нагревания полок аппарата в пределах минусовых температур на этапе возгонки [23]. Данный принцип был использован при втором способе лиофилизации специфической хламидийной сыворотки. Новый технологический режим сублимационного высушивания сыворотки позволил получить качественный компонент для диагностического набора в больших объемах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной работы был отработан оптимальный режим сублимационной сушки специфической хламидийной сыворотки для диагностической тест-системы. Полученный данным способом препарат полностью соответствует характеристикам, заявленным в ТУ 9388-020-00492374-2007 «Набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных».

Отличием оптимизированного технологического режима от используемого ранее явилось уменьшение времени нагрева полок аппарата в пределах минусовых температур и увеличение вакуума, что, в свою очередь, позволило сократить срок сублимации препарата и получить качественный компонент для изготовления тест-системы.

Установлено, что длительность хранения лиофилизированной сыворотки составляет не менее двух лет, а ее активность и физико-химические свойства за указанный период не снижаются.