Воспроизведение ассоциированной инфекции, обусловленной Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae, в лабораторных условиях

ВВЕДЕНИЕ

Респираторный микоплазмоз и инфекционный синовит – экономически значимые заболевания, возбудителями которых являются Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae [1]. Особенность данных микоплазмозов – их хроническое течение с обострением в периоды снижения естественной резистентности организма или при наличии стресс-факторов различного генеза [2]. Одним из способов профилактики данных заболеваний является вакцинация [3]. При разработке средств специфической профилактики особое внимание уделяется протективным свойствам нового препарата, испытаниям вакцины в остром опыте с контрольным заражением. Учитывая факторность микоплазмозов птиц, в лабораторных условиях инфекционный процесс воспроизвести довольно сложно. Таким образом, вопрос проверки протективных свойств вакцин, профилактирующих респираторный микоплазмоз и инфекционный синовит, приобрел особую актуальность в эру борьбы с антибиотикорезистентностью.

Mycoplasma gallisepticum вызывает у кур и индеек респираторный микоплазмоз, который проявляется хрипами, кашлем, ринореей, аэросаккулитами. Данное заболевание характеризуется преимущественно скрытым течением, микоплазмоносительством, распространяется в стаде медленно, может обостряться при воздействии на птиц стресс-факторов, среди которых вакцинация, неудовлетворительное кормление, сквозняки, высокая концентрация аммиака в воздухе и др. Патолого-анатомически респираторный микоплазмоз проявляется наличием серозного, серозно-фибринозного или фибринозного экссудата в полости носовых и подглазничных синусов. Слизистая трахеи гиперемирована, легкие полнокровны, может отмечаться пневмония. Патогномоничный признак – серозный, серозно-фибринозный или фибринозный аэросаккулит грудных или брюшных воздухоносных мешков: стенка их уплотнена, непрозрачна, в полости скапливается экссудат. При неосложненной форме поражения паренхиматозных органов отсутствуют [4][5].

Mycoplasma synoviae – возбудитель инфекционного синовита птиц, характерными признаками которого являются артриты, тендовагиниты, синовиты и анемия. Клинически заболевание может проявляться хромотой, побледнением гребня, отставанием в росте, припухлостями в области метатарзальных и тибиотарзальных суставов, плантарной поверхности подошвы, грудной бурсы [6]. При подостром и хроническом течении болезни поверхность пораженных суставов мацерируется, покрывается корочками экссудата и некротическими массами [7-9]. Периартикулярные ткани и сухожильные влагалища в области пораженных суставов отечны, в полости суставов выявляют скопление прозрачного экссудата, при хроническом течении – значительное количество фибринозных масс [10]. Болезнь может проявляться и респираторным синдромом, неотличимым от респираторного микоплазмоза. Считается, что патогномоничным признаком инфекционного синовита является синдром стекловидной вершины яйца (Egg Apical Abnormalities, ЕАА), который обусловливает существенные экономические потери из-за выбраковки товарных и инкубационных яиц [4][11].

Несмотря на обширный список синдроматики микоплазмозов птиц, такие их свойства, как хроническое течение и факторность, создают определенные трудности при воспроизведении инфекций в лабораторных условиях.

При разработке средств специфической профилактики против хронических болезней сложность заключается в оценке протективных свойств вакцины. Если при острых инфекциях, таких как высокопатогенный грипп птиц, ньюкаслская болезнь, протективную активность биопрепарата легко оценить в опыте с контрольным заражением, то для хронических инфекций, включая микоплазмозы, данный способ имеет существенные ограничения, так как не всегда в лабораторных условиях есть возможность воспроизвести клинически выраженную болезнь [12-14]. Кроме того, возбудители микоплазмозов могут длительное время персистировать в организме и оставаться незамеченными для иммунной системы (биологическая мимикрия) [4][9][15].

Таким образом, создание модели воспроизведения микоплазмоза в лабораторных условиях для оценки протективных свойств разрабатываемых вакцин представляется своевременной и актуальной задачей. Учитывая, что инфекции микоплазменной этиологии относятся к факторным болезням, для проявления клинического микоплазмоза необходимо было подобрать триггер [16][17]. С этой целью в эксперименте была апробирована модель воспроизведения ассоциированной инфекции, вызванной M. gallisepticum, M. synoviae и вирусом низкопатогенного гриппа птиц подтипа Н9N2, имеющим индекс внутривенной патогенности, равный нулю (IVPI = 0). По данным некоторых зарубежных авторов, коинфекция вирусом низкопатогенного гриппа птиц (Н3N8) значительно влияет на патогенез инфекции M. gallisepticum [18]. Заражение клинически здоровой птицы данным патогеном в лабораторных условиях не приводит к клинически выраженной болезни. Однако в условиях птицефабрик ассоциированная форма низкопатогенного гриппа птиц с микоплазмозами обусловливает респираторную инфекцию [10][19].

Создание модели по воспроизведению ассоциированной формы микоплазменной инфекции с низкопатогенным гриппом птиц в лабораторных условиях позволило бы не только использовать ее в оценке протективных свойств вакцины, но и понять роль каждого возбудителя в патогенезе микст-инфекции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы. В ходе опыта были использованы штаммы S6 M. gallisepticum и WVU 1853 M. synoviae. В качестве коинфицирующего агента (триггера) – штамм вируса низкопатогенного гриппа птиц А/chicken/Amursky/03/12/Н9N2 (далее – Н9N2).

Вакцина ассоциированная против респираторного микоплазмоза и инфекционного синовита инактивированная эмульсионная производства ФГБУ «ВНИИЗЖ» (экспериментальная серия).

Заражающие дозы. Для инфицирования использовали культуру M. gallisepticum с активностью 6,0 log₂ гемагглютинирующих единиц и M. synoviae с активностью 3,0 log₂ агглютинирующих единиц. Заражающая доза вируса низкопатогенного гриппа птиц составила 10⁶ lg ЭИД/0,5 см³.

Птица. Для экспериментального заражения были использованы серонегативные и вакцинированные куры яичного кросса Хайсекс белый в возрасте 67 сут. Птицы содержались в виварии ФГБУ «ВНИИЗЖ», условия содержания и рацион кормления соответствовали зоогигиеническим требованиям.

Доза и метод заражения. Схема и методы заражения птиц представлены в таблице 1.

Клиническое наблюдение и патолого-анатомическое вскрытие. В течение всего периода эксперимента (35 сут после вакцинации) за подопытной птицей вели наблюдение, при этом оценивали общее состояние (подвижность, упитанность, реакцию на внешние раздражители, скученность, депрессию, отказ от корма и воды и др.).

Через 14 сут после заражения проводили эвтаназию птиц и их патолого-анатомическое вскрытие с описанием изменений в органах и тканях. Кусочки органов и тканей отбирали для проведения гистологического исследования.

Все эксперименты проводились согласно требованиям Директивы Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/ЕU от 22.09.2010 о защите животных, используемых в научных целях.

Гистологические исследования проводили на базе центра доклинических исследований ФГБУ «ВНИИЗЖ». Образцы срезов органов окрашивали гематоксилином и эозином, просматривали под микроскопом с последующей фотофиксацией.

Серологические исследования. Количественное определение специфических антител к M. gallisepticum и M. synoviae в сыворотках крови птиц осуществляли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью наборов производства ФГБУ «ВНИИЗЖ», детекцию антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н9N2 проводили в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) также с использованием наборов производства ФГБУ «ВНИИЗЖ».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На 3-и сут после заражения невакцинированных птиц комбинацией патогенов Н9N2 + M. gallisepticum + M. synoviae (группа № 2) наблюдали развитие легких респираторных признаков: птица была неактивной, отмечали слезотечение, инъекцию сосудов конъюнктивы (у 6 из 10 птиц). С 5-х по 10-е сут развивались стойкая гиперемия кожи в области бесперьевых участков головы, слезотечение, ринорея. Экссудат из носовых отверстий засыхал и образовывал струпья, которые легко отделялись (у 9 из 10 птиц). При этом у 5 особей из группы отмечали изменение в поведении в виде гиподинамии. При вскрытии птиц данной группы наблюдали признаки катарального ларинготрахеита с мелкоточечными кровоизлияниями (рис. 1).

На 7-е сут после заражения у некоторых особей из группы № 2 отмечали хромоту, при этом птица была апатичной. На плантарной поверхности (подошва стопы) лап наблюдали выраженный отек, трещины кожи и экссудацию (рис. 2). Большую часть светового дня птица находилась в лежачем положении. При вскрытии пораженной части подошвы стопы наблюдали сильный отек мягких тканей с выпотом серозного экссудата, на разрезе мягкая ткань была набухшей и имела студнеобразную консистенцию. Данные признаки могут указывать на суставную форму проявления инфекционного синовита.

В группах № 1 (вакцинированные против микоплазмозов), № 3 (зараженные Н9N2), № 4 (зараженные M. gallisepticum и M. synoviae) и № 5 (отрицательный контроль) видимых клинических отклонений от нормы не наблюдалось.

При морфологическом исследовании органов респираторного тракта отмечено, что у невакцинированной птицы, зараженной вирусом гриппа Н9N2, M. gallisepticum и M. synoviae (группа № 2), была нарушена целостность реснитчатого эпителия трахеи с очагами отслаивания. У вакцинированных против микоплазмоза кур, инфицированных Н9N2 + M. gallisepticum + M. synoviae (группа № 1), признаков десквамации не наблюдалось, однако выявляли локальный отек подслизистого слоя. У птиц контрольной группы морфологическая структура трахеи была сохранена, все слои хорошо просматривались (рис. 3). При этом в легких лимфоцитарная инфильтрация ткани была выявлена в группе как вакцинированных, так и невакцинированных птиц. Во всех группах птиц, кроме контрольной, наблюдали картину депопуляции лимфоцитов в корковом веществе фабрициевой сумки, что говорит об активации иммунной системы и перераспределении лимфоцитов после инфицирования.

После заражения невакцинированных птиц интраназальным и окулярным методами (Н9N2 + M. gallisepticum + M. synoviae) в железе третьего века отмечали дистрофические изменения и инфильтрацию лимфоцитами (рис. 4), что свидетельствовало о наличии воспаления [16][20]. В группе вакцинированных зараженных птиц, напротив, в ткани железы наблюдали депопуляцию лимфоцитов.

У всех подопытных птиц, кроме контрольных, отмечали признаки акцидентальной инволюции тимуса. У невакцинированных зараженных кур наблюдали преобладание белой пульпы селезенки над красной. В подопытной группе невакцинированных птиц, экспериментально инфицированных вирусом Н9N2 (группа № 3), выявлена очаговая лимфоцитарная инфильтрация почек и очаговые кровоизлияния.

Во всех группах при гистологическом исследовании кишечника установлено, что серозная и мышечная оболочки двенадцатиперстной кишки сохранены, апикальная часть ворсинок в состоянии автолиза, кишечные крипты были хорошо выражены. В просвете кишечника определялся химус. На границе тонкого и толстого отдела кишечника определялись слепокишечные лимфоидные фолликулы. Они были структурированы, имели овальную форму, без выраженного реактивного центра.

Выявленная гиперемия сосудов различных органов, вероятно, обусловлена недостаточным обескровливанием.

Специфичность заболевания птиц после заражения подтверждали при исследовании проб сывороток крови кур в ИФА и РТГА. В таблице 2 приведены значения среднего титра антител у вакцинированных и невакцинированных птиц до и после инфицирования.

Из полученных данных видно, что иммунная система невакцинированных птиц реагировала на заражение каждым патогеном. При этом в группах № 2 и 4 титр антител к возбудителям микоплазмозов достоверно повышался после инфицирования с увеличением возраста, что указывало на репродукцию микоплазм в организме птиц и стимуляцию иммунного ответа. Аналогично для групп № 2 и 3 увеличение титра антигемагглютининов к вирусу гриппа Н9N2 с возрастом свидетельствовало о его репликации в организме. В группе № 1 (вакцинированная птица) титры антител к M. gallisepticum, M. synoviae и вирусу гриппа Н9N2 после заражения также с возрастом увеличивались. Однако следует учесть, что на 21-е сут после вакцинации возбудители микоплазмозов вводились в том числе и внутримышечным способом, что усилило иммунный ответ (бустерный эффект), который сопровождался повышением титра специфических антител. При этом отсутствие клинически выраженной болезни и патологических гистологических изменений у иммунизированных птиц свидетельствовало об эффективности вакцины.

ВЫВОДЫ

1. Для оценки протективной активности вакцин против микоплазмоза методом контрольного заражения в лабораторных условиях в качестве коинфицирующего агента можно использовать вирус низкопатогенного гриппа птиц подтипа Н9N2 c нулевым индексом внутривенной патогенности.
2. Ассоциированное течение микоплазмозов с низкопатогенным гриппом птиц проявляется клинически выраженным заболеванием и патогистологическими изменениями.
3. Клиническая ассоциированная форма респираторного микоплазмоза и инфекционного синовита производится в лабораторных условиях после предварительного заражения птицы вирусом низкопатогенного гриппа птиц Н9N2 и сопровождается легкими респираторными расстройствами и суставным синдромом. При гистологическом исследовании у экспериментально инфицированных невакцинированных птиц выявили нарушение целостности реснитчатого эпителия трахеи с очагами отслаивания. У вакцинированной против микоплазмоза птицы, зараженной вирусом гриппа Н9N2, M. gallisepticumи M. synoviae, признаков десквамации не наблюдалось, однако выявляли локальный отек подслизистого слоя. У птиц контрольной группы морфологическая структура трахеи была сохранена, все слои хорошо просматривались.
4. Достоверное увеличение титров антител после заражения у невакцинированных к возбудителям микоплазмозов и низкопатогенного гриппа птиц свидетельствовало о репродукции патогенов в организме кур.