Разработка тест-системы для выявления РНК вируса гриппа птиц подтипов H5 и H7 методом мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием внутреннего контрольного образца

ВВЕДЕНИЕ

Грипп птиц – одно из наиболее опасных вирусных заболеваний домашних и диких птиц, характеризующееся в первую очередь поражением органов дыхательной и пищеварительной систем. Возбудителем заболевания является вирус из рода Alphainfluenzavirus семейства Orthomyxoviridae. Геном вируса представляет собой линейную одноцепочечную (–)РНК и содержит 8 сегментов, что обуславливает высокую скорость эволюции вируса за счет реассортации [1]. На основании антигенных различий поверхностных белков вирус гриппа птиц (ВГП) подразделяется на 16 подтипов по гемагглютинину (HA) и на 9 подтипов по нейраминидазе (NA) [2].

Естественный резервуар вируса гриппа птиц – дикие водоплавающие птицы, инфекция у которых протекает бессимптомно или в легкой форме. Распространение возбудителя в природе происходит по путям миграции диких перелетных птиц, при этом вирус передается и домашней птице [3][4]. Наиболее опасным для птицеводства является вирус высокопатогенного гриппа птиц, способный вызывать тяжелое быстроразвивающееся заболевание с летальностью до 100%. Считается, что высокопатогенные ВГП возникают из низкопатогенных вирусов подтипов H5 и H7 в естественных условиях за счет точечных мутаций в гене HA, вызывающих накопление нескольких основных аминокислот в сайте расщепления гемагглютинина [4-8]. Высокопатогенный грипп птиц относится к заболеваниям, подлежащим обязательному уведомлению Всемирной организации здравоохранения животных независимо от подтипа вируса-возбудителя.

На территории Российской Федерации с 2021 до начала 2024 г. регулярно регистрировали вспышки заболевания среди домашних и диких птиц, вызванные вирусами высокопатогенного гриппа птиц подтипа H5 (выделяли изоляты подтипов H5N1, H5N5 и H5N8) [9]. В 2024 г. вспышка высокопатогенного гриппа птиц, вызванная ВГП подтипа H7N3, была зафиксирована в Австралии у птиц на птицефабрике [10]. До этого года регистрировались случаи заболевания, в том числе у людей, вызванные ВГП подтипа Н7 в странах Северной и Южной Америки, Европы, Африки и Азии [11][12].

Текущая эпизоотическая ситуация по высокопатогенному гриппу птиц в Российской Федерации требует постоянного мониторинга. Наиболее быстрым и точным методом выявления РНК возбудителя гриппа птиц в биологическом материале от различных видов домашних и диких птиц с возможностью одновременного типирования вируса является полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ). Данный метод характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью, относительной быстротой постановки реакции и получения результата.

В этой статье предложена высокоэффективная тест-система для выявления РНК вируса гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 методом ОТ-ПЦР-РВ. В разработанной тест-системе используется внутренний контрольный образец (ВКО) экзогенного типа, что позволяет контролировать основные этапы проведения исследования (выделение нуклеиновых кислот, обратную транскрипцию и ПЦР) и исключить ложноотрицательные результаты.

Целью исследования являлась разработка тест-системы на основе ОТ-ПЦР-РВ, способной одновременно выявлять РНК ВГП подтипов Н5 и Н7 в биологическом материале и контролировать проведение исследования на всех этапах, начиная с выделения нуклеиновых кислот.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусы. В исследовании использовали изоляты вирусов гриппа птиц различных подтипов, ньюкаслской болезни, инфекционной бурсальной болезни, инфекционного бронхита кур, болезни Марека и аденовирус птиц, полученные из рабочей коллекции референтной лаборатории вирусных болезней птиц ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») (табл. 1). В качестве ВКО служил бактериофаг MS2 с титром инфекционной активности 10⁶ БОЕ/см³ [13].

Выделение РНК проводили с помощью комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» (ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора) согласно инструкции производителя. На этапе выделения в каждую пробу (включая отрицательный контроль выделения) добавляли 0,01 мл ВКО.

Праймеры и зонды. В результате анализа публикаций по разработке тест-систем и методов обнаружения возбудителя гриппа птиц подтипов Н5/Н7 в пробах биологического материала методом ОТ-ПЦР-РВ [14-17] были выбраны и протестированы несколько систем праймеров и зондов для амплификации фрагментов гена НА вируса гриппа птиц подтипов Н5 и Н7. Поскольку реакция ОТ-ПЦР-РВ в данном случае проходит в мультиплексном формате, красители, входящие в состав TaqMan-зондов, подбирались таким образом, чтобы давать стабильный флуоресцентный сигнал и не искажать сигналы по другим каналам детекции (каналы Green/H5, Orange/H7, Crimson/ВКО). Выбранные праймеры и зонды синтезированы НПК «Синтол» (Россия), специфичные праймеры и зонд для ВКО [13] – компанией «Алкор Био» (Россия).

ОТ-ПЦР-РВ проводили в один этап с помощью реагентов для амплификации производства НПК «Синтол» (Россия) в программируемом амплификаторе Rotor-Gene 6000 (Corbett Research Pty Ltd, Австралия). Реакционная смесь (20 мкл на одну пробу) включала: воду деионизированную (бидистиллированную) – 5,35 мкл; 10× ПЦР-буфер – 2,5 мкл; раствор MgCl₂ 25 мМ – 4 мкл; раствор дезоксинуклеозидтрифосфата (дНТФ) 25 мМ – 0,4 мкл; растворы прямого и обратного праймеров для ВГП/H5 10 пмоль/мкл – по 1 мкл каждый; флуоресцентный зонд для ВГП/H5 10 пмоль/мкл – 0,75 мкл; растворы прямого и обратного праймеров для ВГП/H7 10 пмоль/мкл – по 1 мкл каждый; флуоресцентный зонд для ВГП/H7 10 пмоль/мкл – 0,75 мкл; растворы прямого и обратного праймеров, раствор флуоресцентного зонда для MS2 10 пмоль/мкл – по 0,5 мкл каждый; SynTaq ДНК-полимеразу – 0,25 мкл; MMLV-ревертазу – 0,5 мкл. Реакция проводилась согласно протоколу: обратная транскрипция – 20 мин при 40 °С; активация полимеразы – 8 мин при 95 °С; 40 циклов ПЦР – 10 с при 95 °С; 35 с при 55 °С; 15 с при 72 °С. Сигнал флуоресценции детектировался на этапе отжига праймеров по каналам Green/H5, Orange/H7 и Crimson/ВКО.

Оценку специфичности тест-системы проводили при постановке ОТ-ПЦР-РВ с выделенной РНК гомологичных и гетерологичных вирусов (табл. 1).

Аналитическую чувствительность тест-системы определяли при постановке ОТ-ПЦР-РВ с выделенной РНК серии последовательных десятикратных разведений (10^–8–10^–3) вируссодержащей суспензии (штаммы ВГП A/duck/KChR/1590-20/2020 H5N8 и A/turkey/ Italy/9289/02 H7N3, исходный титр инфекционной активности – 8,5 lg ЭИД₅₀/см³) с ВКО в трех повторностях для каждого разведения. Чувствительность реакции для каждого образца оценивали как количество вируса (в единицах измерения lg ЭИД₅₀/см³), соответствующее последнему разведению, при котором получали не менее 95% положительных результатов (в 20-кратной повторности) [18].

Для оценки повторяемости положительные образцы тестировали 3 раза в 5-кратной повторности на протяжении трех дней. Определяли среднее значение порогового цикла (Ct), значение стандартного отклонения и коэффициент вариации для полученных результатов в пределах одной постановки ОТ-ПЦР-РВ и между постановками.

Для определения эффективности реакции (E) использовали результаты, полученные при постановке реакций для определения аналитической чувствительности. Расчет значения эффективности реакции производился после построения графика линейной регрессии (в координатах «разведение вируса» / «пороговый цикл амплификации Ct») по формуле:

E = (10(^−1/m) – 1) × 100%,

где m – коэффициент наклона прямой [19-21].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

По результатам тестирования комбинаций систем праймеров и зондов для амплификации фрагментов гена НA вируса гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 были определены оптимальные сочетания праймеров и зондов, нуклеотидные последовательности представлены в таблице 2.

Выбранные системы тестировали в ОТ-ПЦР-РВ со штаммами вируса гриппа птиц подтипов H5N2, H5N1, H5N5, H5N8, H7N2, H7N3 и H7N7 с ВКО в формате моно- и мультиплексной реакции. Значение порогового цикла, выше которого результаты реакции следует считать отрицательными, установили на уровне 36,00 для каналов Green/H5 и Orange/H7. Во всех случаях наличие РНК вируса гриппа птиц подтипов Н5 или Н7 подтверждалось только в пробах, содержащих соответствующий подтип вируса.

Оптимальную концентрацию ВКО определяли при постановке ОТ-ПЦР-РВ с несколькими 10-кратными разведениями вируссодержащей суспензии MS2 (10⁵–10⁷ БОЕ/см³) и одновременной идентификации одной или двух целевых мишеней тест-системы (ВГП/H5 и ВГП/H7). По результатам проверки была выбрана концентрация 10⁶ БОЕ/см³, обеспечивающая стабильное возрастание флуоресцентного сигнала по каналу детекции для ВКО без ингибирования сигнала по другим каналам для ВГП/H5 и ВГП/H7 (рис. 1) и не выходящая за пределы чувствительности системы праймеров и зонда для ВКО при одновременной идентификации ВГП/H5 и ВГП/H7 в высоких концентрациях. При значении Ct > 35 по каналу детекции Crimson/ВКО результаты всего исследования признаются недостоверными, то есть на этапе выделения нуклеиновых кислот, постановки обратной транскрипции или ПЦР допущены ошибки либо в исследуемом образце содержатся примеси, способные ингибировать реакцию.

Проверка специфичности тест-системы при постановке ОТ-ПЦР-РВ с выделенной РНК вируса гриппа птиц подтипов H3, Н4, Н9, Н10, Н16 и других РНК- и ДНК-содержащих вирусов (возбудители ньюкаслской болезни, инфекционной бурсальной болезни, инфекционного бронхита кур, болезни Марека, аденовирус) показала отсутствие перекрестных реакций с перечисленными патогенами.

Аналитическая чувствительность реакции при тестировании 10-кратных разведений вируса с инфекционным титром 8,5 lg ЭИД₅₀/см³ (рис. 1, табл. 3) для ВГП/H5 соответствовала разведению вируса 10^–7 (при 20-кратной повторности положительный результат получен в 95% случаев) со средним значением Ct = 34,16 ± 0,54 и коэффициентом вариации 1,59%; для ВГП/H7 предел чувствительности соответствовал разведению вируса 10^–7 (при 20-кратной повторности положительный результат получен в 100% случаев) со средним значением Ct = 35,17 ± 0,65 и коэффициентом вариации 1,84%.

Соответственно, минимальное количество вируса, которое способна обнаружить разработанная тест-система, составляет 1,5 lg ЭИД₅₀/см³ для ВГП/Н5 и ВГП/Н7.

Для определения параметров эффективности построили графики линейной регрессии для реакций с ВГП/Н5 и ВГП/Н7 (рис. 2). При оценке эффективности реакции необходимо учитывать такие параметры, как коэффициент наклона прямой (m) и коэффициент корреляции (R²). В идеальном случае (при эффективности 100%) значение m равняется –3,32, но оптимальными считаются значения в пределах от –3,2 до –3,5. Оптимальными для R² являются значения более 0,98 [20][22]. Результаты определения параметров эффективности реакции для разработанной тест-системы представлены в таблице 4.

Эффективность реакции для ВГП/Н5 (канал Green) составила 91,74%, для ВГП/Н7 (канал Orange) – 96,92%. Такие параметры, как коэффициент наклона прямой и коэффициент детерминации, для обоих подтипов ВГП соотносятся с оптимальными значениями [20][22].

Воспроизводимость тест-системы оценивали по величине стандартного отклонения (SD) для каждой серии 10-кратных разведений (10^–7–10^–3, n = 3). Для ВГП/H5 значения SD варьировали от 0,02 до 0,53; для ВГП/H7 – от 0,03 до 0,52.

Для оценки повторяемости использовали те же вирусы в разведении 10^–4, каждую пробу тестировали в 5 повторностях. Среднее значение Ct внутри постановок для ВГП/H5 варьировало от 22,89 до 23,36; значение SD составляло 0,22–0,33; коэффициент вариации – от 0,92 до 1,17%. Для ВГП/H7 среднее значение Ct находилось в пределах от 24,53 до 25,06; значение SD – в диапазоне 0,18–0,23, коэффициент вариации был от 0,71 до 0,94%. Значения повторяемости между постановками для ВГП/H5: среднее Ct – 23,09 ± 0,32, коэффициент вариации – 1,41%; для ВГП/H7: среднее Ct – 24,53 ± 0,31, коэффициент вариации – 1,25%.

С помощью разработанной тест-системы были исследованы 434 пробы биологического материала на наличие РНК ВГП подтипов H5 и H7, из них РНК ВГП/H5 выявили в 268 случаях. РНК ВГП/H7 не была обнаружена в исследуемых пробах. Результаты, полученные с помощью данной тест-системы, соответствуют таковым, полученным при исследовании этих же проб стандартными методами молекулярной диагностики, используемыми в референтной лаборатории вирусных болезней птиц ФГБУ «ВНИИЗЖ» [23].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной работы была разработана тест-система для выявления РНК вируса гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Определены параметры предложенной тест-системы: специфичность составила 100% (ВГП/Н5 и ВГП/Н7), предел аналитической чувствительности – 1,5 lg ЭИД₅₀/см³ (ВГП/Н5 и ВГП/Н7), эффективность реакции – 92% (ВГП/Н5) и 97% (ВГП/Н7). Данная тест-система может быть использована для качественного анализа наличия РНК вируса гриппа птиц подтипов Н5 и Н7 в пробах биологического материала от птиц и других животных.