Изменение ядерно-цитоплазматического соотношения гепатоцитов при заражении нетуберкулезными микобактериями на фоне действия иммуномодулятора

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время в мире значительно возросла роль нетуберкулезных микобактерий. Микобактериозы причиняют животноводческим комплексам ощутимый экономический ущерб, связанный со снижением выхода продукции, а также с ранней выбраковкой животных и их вынужденным убоем [1-3]. Высокие финансовые затраты и отсутствие эффективных противоэпизоотических мероприятий являются угрозой не только для предприятия, где выявлены микобактериозы, но и для всей страны [4-7]. Данный вопрос недостаточно глубоко изучен и требует повышенного внимания со стороны научных и производственных организаций [8-10].

Ученые России и многих зарубежных стран доказали, что нетуберкулезные микобактерии обладают не только сенсибилизирующей способностью, но и могут локализовываться и вызывать специфичные изменения в организме животных и перекрестно-иммунные реакции на введение ППД-туберкулина [11-13].

Токсины, выделяемые микобактериями в процессе их жизнедеятельности в макроорганизме, нарушают ферментативную активность печени, тем самым провоцируя патологические изменения печеночной ткани, что приводит к снижению уровня гематогепатического барьера [14-17].

Одна из основных функций печени – трансформация углеводов в гликоген, который является важнейшим энергетическим ресурсом организма в целом [18, 19]. Кроме того, звездчатые ретикулоэндотелиоциты обладают фагоцитарной способностью, нейтрализующей накопление и транспортировку токсических веществ в организме животного [10][20][21].

Согласно научным данным многих авторов, одним из более эффективных методов борьбы с инфекционными возбудителями является применение иммунопрофилактических препаратов [2][22]. В настоящее время многие современные иммуномодуляторы не обладают достаточно высокой способностью стимулировать эффективность иммунного ответа на присутствие возбудителей инфекции и их токсины у бионта.

Разработка современных иммунокорректирующих средств и их применение дает возможность увеличить устойчивость организма к инфекционным возбудителям болезней. Повышение иммунной реакции при помощи специфического иммуномодулятора усиливает восстановительную способность клеток, ткани и органа в целом [23-25].

В связи с изложенным материалом поставлена цель – изучить влияние специфического иммуномодулятора на печеночную ткань при лабораторном заражении нетуберкулезными микобактериями.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводились в специализированном виварии. В работе использовали 15 половозрелых особей беспородных морских свинок черепахового окраса, имеющих отрицательный результат в ППД-туберкулиновой реакции.

Специфический комплексный иммуномодулятор КИМ-М2 производили путем культивирования микобактерий вакцинного штамма БЦЖ на жидкой синтетической среде Сотона, затем выращенную бактериальную массу разрушали ультразвуковым диспергатором УЗДН-1 (Россия), полученную взвесь центрифугировали при 15 000 об/мин, определяли количество белка с помощью красителя бромфенолового синего в отобранной надосадочной жидкости после ее инкубации с формалином с последующим доведением его концентрации до 1 мг/мл физиологическим раствором, полученный антигенный комплекс БЦЖ конъюгировали с поливинилпирролидоном (ПВП) и полиэтиленгликолем (ПЭГ) [26].

Сконструированная серия КИМ-М2 содержала 320 мг ПВП и 80 мг ПЭГ полиионов на 1 мг/мл белка. Образец препарата был приготовлен в объеме 200 мл.

Животных разделили на 3 группы по 5 гол. в каждой. Животным 1-й группы (контроль заражения) и 2-й группы (экспериментальной) инокулировали Mycobacterium scrofulaceum в область паха подкожно в дозе 0,001 мг/мл. Через 2 нед. животным экспериментальной группы вводили иммуномодулятор КИМ-М2 во внутреннюю часть бедра подкожно в дозе 500 мг/мл белка. Животным 3-й группы (чистый контроль) вводили стерильный 0,9%-й физиологический раствор. Работа с микроорганизмами III–IV групп патогенности проводилась согласно санитарным правилам и нормам (СанПиН 3.3686-21¹). Основой специфического иммуномодулятора является антигенный комплекс вакцинного штамма БЦЖ. На 30-е сут после начала эксперимента животных выводили из опыта под эфирным наркозом и проводили тотальное обескровливание. Для работы извлекали кусочки печени и фиксировали в 10%-м нейтральном формалине. Дальнейшую подготовку проводили на автоматической станции пробоподготовки STP-120 (тип карусель; Германия), парафиновые блоки заливали с применением станции EC 350 (Германия). Серийные полутонкие срезы (5–7 мкм) изготовляли на микротоме HM-340E (Германия). Гистологические срезы окрашивали по общепринятой классической методике гематоксилином и эозином.

Работа выполнена с соблюдением международных принципов, изложенных в Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным, Директиве Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/ЕU о защите животных, используемых в научных целях, а также согласно правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных.

Компьютерную морфометрию и цифровые снимки микропрепаратов проводили на световом микроскопе Axio Imager A1 (Zeiss, Германия) в 10 полях зрения (окуляр 10×, объектив 40×), измеряли площадь гепатоцитов и их ядер в микрометрах (мкм²) с помощью программного комплекса и системой архивирования AxioVision version 4.8.

Статистическую обработку цифровых данных осуществляли с помощью программы Microsoft Office 2010, определением средних арифметических (М) и расчетом ошибок средних арифметических (m). Достоверность определяли по t-критериям Стьюдента и достоверными считали различия при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Как показали результаты морфологического исследования, у животных 1-й группы печень была визуально увеличена, кровенаполнена, на разрезе края не сходятся, рыхлой консистенции, темно-бурого цвета с крупными разлитыми поражениями серого цвета, капсула отечна, утолщена. Сохранено балочное строение. Гепатоциты частично округлены. Отмечено большое количество безъядерных гепатоцитов. В 50% случаев наблюдается кариопикноз ядер, клеточная стенка деформирована, цитоплазма вакуолизирована, инфильтрирует в межклеточное пространство. Клетки Купфера не дифференцируются в связи с обширным разрастанием рыхлой соединительной ткани. Субэндотелиальное пространство расширено.

У животных экспериментальной группы, иммунизированных КИМ-М2, печень незначительно увеличена, красного цвета, капсула в пределах нормы, печеночные дольки отчетливо видны, структура балочно-радиального строения сохранена. Центролобулярные вены расширены. На периферии печеночных долей просматриваются мелкие единичные очаги кровоизлияния. Некротических и дистрофических очагов не выявлено. Вокруг триад отмечается умеренное разрастание соединительной ткани. Гепатоциты идентифицируются, структура клеток определяется, цитоплазма не инфильтрирует в межклеточное пространство, кариопикнотических изменений ядра не выявлено. В синусоидах различимы клетки Купфера, расположенные в перипортальной зоне печеночных долек. У интактных животных патологических изменений не выявлено.

По результатам гистологического исследования установлено, что у иммунизированных КИМ-М2 морских свинок количество одноядерных гепатоцитов составляет 63,5% от общего числа гепатоцитов, что на 21,7% больше, чем у животных в контроле заражения, и на 11,0% меньше, чем у животных чистого контроля. Доля двухъядерных гепатоцитов от общего числа клеток равна 25,0%, что на 16,7% больше, чем при заражении без применения КИМ-М2, и на 7,0% больше, чем у здоровых животных. Количество безъядерных гепатоцитов составляет 11,5%, что на 38,4% меньше по сравнению с контролем заражения и на 4,0% больше в сравнении с чистым контролем (табл. 1).

Исходя из полученных данных, видно, что специфический иммуномодулятор микробного происхождения КИМ-М2 усиливает иммунный ответ, что обусловлено достоверным повышением количества двухъядерных гепатоцитов в процессе интенсивного митотического деления у животных экспериментальной группы. Число одноядерных гепатоцитов меньше в сравнении с чистым контролем, что объясняется обильным образованием двухъядерных гепатоцитов. Количество безъядерных гепатоцитов незначительно увеличено.

По результатам морфометрического исследования установлено среднее значение общей площади одноядерных гепатоцитов у животных 2-й группы, которое составляет 2721,10 мкм², что на 53,6% больше, чем у интактных свинок, и на 22,8% меньше, чем у зараженных особей 1-й группы. Среднее значение площади ядра одноядерных гепатоцитов у животных, которым вводили КИМ-М2, равно 289,83 мкм², что на 47,6% больше, чем у интактных свинок, и на 45,0% меньше, чем у животных в контроле заражения. У особей 1-й группы среднее значение общей площади одноядерных гепатоцитов составляет 3526,94 мкм², среднее значение площади ядра одноядерных гепатоцитов – 526,76 мкм². У интактных животных среднее значение общей площади одноядерных гепатоцитов было 1772,14 мкм², среднее значение площади ядра одноядерных гепатоцитов – 196,35 мкм² (табл. 2).

Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что у животных 2-й группы происходит накопление потенциальных восстановительных резервов и резервов полиплоидизации при воздействии специфического иммуномодулятора КИМ-М2. У морских свинок из группы контрольного заражения определено нарушение митотического деления гепатоцитов и зафиксирован процесс деструкции в печени, что замедляет восстановительный процесс.

По результатам расчета площади клеток печени и их ядер определяли внутриклеточную регенерацию органа путем расчета ядерно-цитоплазматического отношения по группе, что позволяет определить в организме лабораторных животных уровень метаболизма и компенсаторных реакций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в эксперименте на животных установили, что специфический иммуномодулятор микробного происхождения запускает и усиливает процесс клеточной и внутриклеточной регенерации печени, что стимулирует организм к противостоянию токсинам микобактерий. У морских свинок, зараженных нетуберкулезными микобактериями, без применения КИМ-М2 развиваются деструктивные процессы и слабо развит механизм восстановления печеночной ткани.