Метагеномный анализ биоразнообразия микробиома кишечника птицы до и после медикаментозной нагрузки антибиотиком

ВВЕДЕНИЕ

Нормальная микрофлора представляет собой качественное и количественное соотношение разнообразных популяций микробов отдельных органов и систем, поддерживающее биохимическое, метаболическое и иммунологическое равновесие, необходимое для сохранения здоровья животных [1]. В последние годы роль кишечной микробиоты в развитии болезней была установлена у различных видов, включая людей, собак, cвиней, крупный рогатый скот, птиц и пушных зверей [2-8]. Желудочно-кишечный отдел кур густо заселен сложными микробными сообществами (бактерии, грибы, археи, простейшие и вирусы), в которых доминируют бактерии [9][10]. Исторически сложилось так, что для идентификации и характеристики микробного разнообразия кишечника птиц использовали методы селективного культивирования. Новизна данной работы состоит в использовании секвенирования генов бактериальной 16S-рибосомальной РНК (рРНК) для определения разнообразия микробиоты желудочно-кишечного тракта птицы до и после медикаментозной нагрузки антибиотиком. Современные высокопроизводительные подходы к секвенированию позволяют быстро получить полную информацию о микробных сообществах и являются мощным инструментом, который привел к новому пониманию биологической и экологической роли микробиоты желудочно-кишечного тракта [11-14].

Использование антибиотиков в ветеринарии может способствовать развитию устойчивости бактерий к антимикробным средствам [15]. Согласно критериям, предложенным Всемирной организацией здравоохранения животных (ВОЗЖ), противомикробные препараты классифицируют по трем категориям: ветеринарные критически важные противомикробные препараты (Veterinary Critically Important Antimicrobial Agents, VCIA), ветеринарные особо важные противомикробные препараты (Veterinary Highly Important Antimicrobial Agents, VHIA) и ветеринарные важные противомикробные препараты (Veterinary Important Antimicrobial Agents, VIA). Однако конкретный антимикробный препарат/класс можно считать критически важным для лечения определенной болезни. Для ряда противомикробных средств не существует или существует мало альтернатив для лечения конкретной болезни. Фторхинолоны часто применяют в ветеринарной практике с целью лечения инфекционных болезней животных. Также они внесены в перечень противомикробных препаратов ВОЗЖ как критически важные для здоровья человека и животных [16]. Изучение влияния данной группы антимикробных средств на здоровый организм, то есть нормальный микробиом, является актуальным.

Цель работы – исследование биоразнообразия микробиома кишечника птицы до и после медикаментозной нагрузки антибиотиком с помощью секвенирования гена 16S рРНК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследований являлся микробиом слепых отростков кишечника цыплят.

Исследования проведены на 90 цыплятах яйценоского направления кросса Русская белая одной партии, выведенных из яиц от СПФ-птицы в условиях инкубатория НПБ «Манихино», возрастом 15 сут и с приблизительно одинаковой живой массой. Цыплята случайным образом были распределены на две группы (опытную и контрольную), каждую из которых разместили по отдельным клеткам (по 5 гол.). Цыплят выращивали в стандартных условиях вивария, они получали стандартный коммерческий рацион и воду ad libitum.

Предметом исследования являлись образцы содержимого слепых отростков толстого кишечника цыплят опытной и контрольной групп, которые получали сразу после забоя птицы методом цервикальной дислокации на 4, 8, 11-й дни выпаивания антибиотика и 4, 8, 11-й дни после отмены препарата. Цыплятам опытной группы индивидуально через зонд выпаивали по 1,0 мл раствора антибиотика в дозе 10,0 мг/кг массы. Препарат вводили утром перед началом кормления. Цыплятам контрольной группы аналогично, параллельно с опытной группой, выпаивали по 1,0 мл воды для инъекций. Использовали антибиотик энрофлоксацин (Энровек 10% для инъекций, ООО «НПФ «Вектор», серия ОЭ011021, в 1,0 мл содержится 100 мг энрофлоксацина) из расчета 10,0 мг/кг массы.

Все процедуры, выполненные с участием животных, соответствовали этическим стандартам, принятым Европейской конвенцией ETS № 123.

Выделение ДНК из образцов осуществляли с помощью наборов QIAamp DNA Microbiome Kit (QIAGEN, Германия) согласно рекомендациям производителя. Проверку качества выделенной ДНК проводили методом электрофореза в 0,8%-м агарозном геле, а также с использованием системы микрокассетного электрофореза TapeStation 4200 (Agilent Technologies, США). Концентрацию ДНК измеряли на флуориметре Quantus (Promega, США). Подготовку ДНК-библиотеки проводили согласно протоколу 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation с использованием набора реактивов Nextera XT (Illumina, США). Для секвенирования применяли набор реактивов MiSeq Reagent Kit v3 (Illumina, США), обеспечивающий получение прочтений длиной 300 нуклеотидов.

Для анализа данных секвенирования 16S рРНК использовали пакет программ QIIME2. Для первоначальной обработки сырых последовательностей был применен пакет DADA2, позволяющий получить более воспроизводимые и точные результаты за счет алгоритмов денойзинга, а не кластеризации филотипов, в отличие от более классических подходов [17][18]. Определение таксономической принадлежности филотипов было проведено при помощи классификатора RDP по базе SILVA [19]. Нормализацию данных осуществляли c использованием алгоритма разряжения в программной среде QIIME2 при анализе альфа-разнообразия согласно базовым рекомендациям разработчиков, стабилизация – по вариации в составе пакета DESeq2 [20] для сравнения относительной представленности филотипов в образцах. При анализе бета-разнообразия проводилось сравнение сообществ с построением матрицы их сходства/различия с помощью алгоритмов weighted UniFrac, unweighted UniFrac и bray-curtis.

Статистическую обработку результатов исследований проводили методом дисперсионного анализа с использованием программного обеспечения Microsoft Exсel 2010. Результаты представлены как средняя арифметическая (M) и стандартные ошибки средних (± SEM). Достоверность различий устанавливали по t-критерию Стьюдента, различия считали статистически значимыми при р ≥ 0,95.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При биоинформатическом анализе наибольшее количество прочтений в микробиоме цыплят в период выпаивания антибиотика и в период его отмены составлял тип Firmicutes. Вторым по относительной численности рассчитанных OTU (операционная таксономическая единица, operational taxonomic unit) был тип Bacteroidota. Значительное увеличение Patescibacteria было отмечено на 11-й день отмены энрофлоксацина. Также на 11-й день после отмены выпаивания антибиотика наблюдали появление Actinobacteriota. Увеличение Cyanobacteria выявлено на 4-й день после отмены препарата (рис. 1, табл. 1).

Таксономические сдвиги в микробиоме цыплят на уровне классов как в период выпаивания энрофлоксацина, так и после его отмены проявились тенденцией к снижению относительной доли представителей классов Clostridia и Bacteroidia, а также тенденцией к увеличению доли класса Bacilli, особенно на 8-й день после отмены препарата (рис. 2, табл. 2).

Изменение численности прочтений на уровне порядков согласуется с изменениями на уровне семейств (рис. 3, табл. 3).

Десятидневный курс выпаивания энрофлоксацина в рекомендуемой дозе приводит к увеличению в микробиоме доли семейств Bacillaceae, Gastranaerophilales, Lactobacillaceae, Bacteroidaceae, Bifidobacteriaceae, снижению относительной численности семейств Rikenellaceae, Erysipelatoclostridiaceae, Clostridiaceae, Ruminococcaceae и не влияет на колебания относительной численности семейства Lachnospiraceae.

Из 28 родов, обнаруженных в микробиоме опытных и контрольных групп цыплят, не удалось классифицировать два, относящиеся к семействам Oscillospiraceae и Ruminococcaceae. Относительная численность родов Lactobacillus, Akkermansia, Blautia, Candidatus Saccharimonas была значительно увеличена в период выпаивания энрофлоксацина и в период его отмены, а Faecalibacterium, Lachnoclostridium, Ruminococcus снижена (табл. 4, рис. 4).

Результаты биоинформатического анализа метагеномных данных (без отсечения) показали присутствие в микробиоме цыплят 158 видов микроорганизмов, 38% из которых были отнесены к некультивируемым.

При анализе бета-разнообразия изучаемого метагеномного сообщества были отмечены изменения таксономического разнообразия микробиомов в опытной и контрольной группах (рис. 5A), выражающиеся в увеличении таксономического состава сообщества микроорганизмов внутри групп (рис. 5B).

Значимые различия, характеризующие альфа-разнообразие, с течением времени обнаружены только внутри групп, но не относительно друг друга в конкретной временной точке. Наиболее значимое отличие при анализе альфа-разнообразия было получено для образцов в точке 19, соответствующей 8-му дню после отмены антибиотика (рис. 6).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате работы было проанализировано изменение таксономической структуры метагенома микробного сообщества слепых отростков кишечника здоровых цыплят при использовании антибиотика энрофлоксацина. Наиболее выраженные относительные таксономические изменения метагенома были зафиксированы на 8-й день после начала десятидневного курса выпаивания энрофлоксацина и на 8-й день после его отмены.

При анализе данных метагеномного секвенирования установлено присутствие значительного количества некультивируемых микроорганизмов, не поддающихся выявлению микробиологическими техниками.