Выделение аденовируса собак 2-го серотипа и определение параметров культивирования

ВВЕДЕНИЕ

Аденовирусная инфекция собак (инфекционный ларинготрахеит), вызванная аденовирусом 2-го серотипа (CAV-2), является преимущественно респираторным заболеванием, классическим проявлением которого является поражение органов дыхательной системы [1-3]. Возбудитель инфекции широко распространен в центральной части Российской Федерации из-за плотной популяции собак и регулярного проведения мероприятий, для которых характерно скученное содержание животных. Несмотря на регулярную профилактическую вакцинацию животных, заболеваемость инфекционным ларинготрахеитом имеет тенденцию к росту.

Аденовирус собак 2-го серотипа относится к сфере Varidnaviria, царству Bamfordvirae, типу Preplasmiviricota, классу Tectiliviricetes, отряду Rowavirales, семейству Adenoviridae, роду Mastadenovirus, виду Mastadenovirus canidae. Внесен в реестр Международного комитета по систематике вирусов (International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV) в 1976 г. [4]. Был впервые выделен в Канаде в 1961 г. [5].

В настоящий момент известно два серотипа возбудителя аденовирусной инфекции собак: 1-й серотип (Canine adenovirus 1, CAV-1) характеризуется генерализованным влиянием на организм животного, поражает большинство основных органов и вызывает инфекционный гепатит; вирус 2-го серотипа (Canine adenovirus 2, CAV-2), как и многие представители рода Mastadenovirus, характеризуется локальным действием и вызывает преимущественно поражение органов респираторного тракта, реже – желудочно-кишечного тракта [2][6-9].

Аденовирус собак 1-го серотипа (CAV-1) более вирулентен по сравнению с CAV-2. Возбудитель 2-го серотипа является безоболочечным ДНК-вирусом, ослабленным вариантом CAV-1, с которым имеет общность нуклеотидной последовательности около 75% [10]. Коинфекция с другими вирусами повышает патогенность аденовирусов [11].

Аденовирус собак 2-го серотипа был зарегистрирован у собак, енотов, лошадей, крупного рогатого скота, кошек и волков. Субклинически присутствует в популяции диких плотоядных [11-14].

Необходимо отметить, что симптомокомплекс, называемый «инфекционный ларинготрахеит собак» (или «вольерный кашель»), вызывают многие микроорганизмы, к числу которых, помимо аденовируса 2-го серотипа, относятся такие возбудители, как вирус чумы плотоядных, герпесвирус собак, вирус парагриппа собак, вирус гриппа собак, респираторный коронавирус собак, пневмовирус собак, а также следующие бактерии: Mycoplasma cynos, Bordetella bronchiseptica и подвид Streptococcus equi [3][15-18]. Бокавирус и гепацивирус собак в редких случаях вызывают симптомы заболевания респираторного тракта и не рассматриваются при дифференциации [19].

В отношении культивирования CAV-2 представлены различные сведения. Известно, что аденовирусы наилучшим образом размножаются в клетках тех видов животных, которые являются их природными хозяевами [6]. К вирусу наиболее чувствительны культуры клеток почки собаки и не чувствительны другие виды клеточных культур собачьего происхождения. Не чувствительны также к вирусу первичные или перевиваемые культуры клеток других млекопитающих, таких как люди, овцы, обезьяны. В мировой практике как оптимальная система культивирования CAV-2 зарекомендовала себя перевиваемая культура клеток почки собаки Мадина – Дарби (Madin – Darby Canine Kidney, MDCK) [11][20-22]. Согласно другим исследованиям, CAV-2 возможно культивировать в том числе в культуре клеток Vero (перевиваемая культура клеток почки африканской зеленой мартышки) [7].

Целью данного исследования являлось выделение аденовируса собак 2-го серотипа, обладающего устойчивостью на протяжении пяти и более пассажей, а также определение параметров его культивирования.

Подбор культур клеток для размножения вируса CAV-2 осуществляли на основании имеющихся в наличии клеточных линий путем серийных пассажей из числа основных, используемых для культивирования вирусов собак и рекомендованных для культивирования аденовирусов.

Общепринято для выделения вируса использовать первичную линию клеток естественно восприимчивых животных, которые, как правило, являются более чувствительными для заражения. В связи с этим для проведения первого пассажа была выбрана первично трипсинизированная культура клеток почки щенка. Также данная культура клеток приоритетна для выделения вируса из патологического материала вследствие высокой потенции эмбриональных клеток к росту.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Образцы биоматериала (смывы из носовой и ротовой полости) были получены от собак с подозрением на аденовирусную инфекцию, которые поступали в ветеринарные клиники и приюты Владимирской, Вологодской и Нижегородской областей в период с 2019 по 2022 г.

Диагностика. Для подтверждения наличия CAV-2 в материале и проведения дифференциальной диагностики методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовалась коммерческая тест-система «АДЕНОВИР» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).

В процессе пассирования вируса CAV-2 для определения наличия антигена вируса применялась иммунохроматографическая тест-система Asan Easy Test CAV2 (Asan Pharmaceutical Co., Ltd., Корея) согласно инструкции производителя.

Культуры клеток. Для исследования были отобраны: перевиваемые культуры клеток MDCK (линии NBL-2 и NBL-9) и Vero, первично трипсинизированные клеточные культуры почки щенка, селезенки щенка, почки котенка, селезенки котенка. Исходная концентрация клеток в клеточной суспензии для MDCK линий NBL-2 и NBL-9 составила 400 тыс/см³, для культур клеток Vero – 200–250 тыс/см³, для первично трипсинизированных культур клеток – 300–400 тыс/см³. Критерием выбора культуры клеток для заражения являлся полностью сформированный монослой без признаков дегенерации клеток. Для данных культур клеток был применен стационарный способ культивирования при температуре (37,0 ± 0,5) °С.

При проведении пассажей использовались пластиковые культуральные флаконы с рабочей площадью поверхности 25 см³ (Т25).

Питательные среды. Согласно паспортам на культуры клеток были использованы следующие питательные среды: в качестве ростовой среды для культуры клеток MDCK – ПСП (питательная среда полусинтетическая) с добавлением 5% сыворотки крупного рогатого скота, антибиотиков (стрептомицин 100 мкг/см³ и пенициллин 100 ЕД/см³) и в качестве поддерживающей среды – ПСП без сыворотки; в качестве ростовой среды для перевиваемой культуры клеток Vero и первично трипсинизированных культур – ПСС (питательная среда синтетическая) с добавлением глютамина (0,584 г/л), 10% сыворотки крупного рогатого скота, антибиотиков (стрептомицин 100 мкг/см³ и пенициллин 100 ЕД/см³) и в качестве поддерживающей среды – ПСС с добавлением антибиотиков без сыворотки.

Подготовка материала для внесения в культуру клеток. Вируссодержащую суспензию отфильтровали при помощи мембранного фильтра Millipore, MCE, 20 мкм (Merck Millipore, США), центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. Далее отбирали надосадочную жидкость, добавляли антибиотики (стрептомицин 100 мкг/см³ и пенициллин 100 ЕД/см³) и после экспозиции в течение 1 ч при температуре 2–8 °С использовали для заражения культуры клеток.

Выделение вируса производили на первично трипсинизированной культуре клеток почки щенка.

Заражение культуры клеток. Для каждого пассажа аденовируса собак 2-го серотипа использовали три культуральных флакона Т25. Перед инокуляцией вируса на клеточный монослой ростовую питательную среду сливали, монослой трехкратно отмывали раствором Хенкса и вводили вируссодержащую суспензию; множественность заражения составила 0,01 ТЦД₅₀/кл. Культуральные флаконы помещали в термостат с соблюдением температурного режима (37,0 ± 0,5) °С на 1 ч. По прошествии 1 ч вносили поддерживающую питательную среду, помещали культуральные флаконы в термостат при температуре (37,0 ± 0,5) °С и просматривали под инвертированным микроскопом каждые 12 ч на наличие характерных морфологических изменений клеток: при поражении монослоя более 80% флаконы подвергали замораживанию при температуре минус (45 ± 5) °С до следующего пассажа.

Также было изучено влияние следующих факторов на уровень титра инфекционной активности вируса:

– время культивирования;

– температура культивирования;

– возраст монослоя культуры клеток;

– множественность заражения;

– время предварительного контакта.

Титрование вируса проводилось по общепринятой методике [23][24] в трех повторностях для каждого образца. Использовались 96-луночные плоскодонные микропланшеты Costar® (Corning, США). После внесения компонентов реакции планшеты культивировали 5 сут (120 ч) при температуре (37 ± 0,5) °С, концентрации СО₂ 5% и просматривали ежедневно под инвертированным микроскопом. Титр вируса оценивали по количеству лунок с цитопатогенным действием. Расчет титра проводили по методу Кербера и выражали в lg ТЦД₅₀/см³.

Анализ результатов. Результаты, полученные в ходе исследований, обрабатывали в программе для работы с электронными таблицами Microsoft Office Exсel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Патологический материал, отобранный для выделения вируса, предварительно был исследован методом ПЦР для выявления наличия вирусного генома CAV-2. Пробы, положительные в ПЦР, были использованы в дальнейшей работе. Для выделения аденовируса собак 2-го серотипа была использована первично трипсинизированная культура клеток почки щенка. Данные о титрах инфекционной активности после первого пассажа представлены в таблице 1.

Установлено, что все изоляты, наличие генома CAV-2 в которых было подтверждено методом ПЦР, обладали инфекционной активностью в различной степени и их использование в работе было целесообразным.

С целью оценки репродуктивной способности и стабильности вируса были проведены пять последовательных пассажей в первично трипсинизированной культуре клеток почки щенка. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Исходя из полученных данных, для дальнейшего культивирования был отобран вируссодержащий материал изолята № 5 (в дальнейшем получивший название «Юнити»), так как он обладал стабильностью в течение пяти пассажей, характерное цитопатическое действие (ЦПД) вируса проявлялось на уровне каждого пассажа; титр инфекционной активности находился в пределах от (3,33 ± 0,29) до (4,33 ± 0,29) lg ТЦД₅₀/см³. Вируссодержащие материалы изолятов № 1, 2, 3, 4, титр которых был ниже 3,0 lg ТЦД₅₀/см³, в дальнейшем исследовании не использовали. На следующих этапах при изучении культуральных свойств вируса был использован материал изолята № 5 третьего пассажа с максимальным для данного изолята титром.

На уровне первого пассажа проявление ЦПД аденовируса собак 2-го серотипа отмечали через 24 ч после внесения вируссодержащей суспензии в культуру клеток. Поражение монослоя на площади 80% наблюдали через 72 ч. На уровне второго и дальнейших пассажей морфологические изменения клеток отмечали через 24–48 ч, поражение монослоя на площади 80% регистрировали через 72–120 ч.

Для изучения чувствительности различных культур клеток к CAV-2 было проведено пять последовательных пассажей. В чувствительных культурах клеток ЦПД вируса проявлялось однотипно и наблюдалось с первого пассажа. Титр инфекционной активности CAV-2 определяли путем микротитрования в культуре клеток MDCK. При отсутствии цитопатического действия наличие антигена в культуральной жидкости устанавливали при помощи иммунохроматографической тест-системы. При получении отрицательного результата на протяжении двух пассажей дальнейшие исследования на культуре клеток не проводились. Титр инфекционной активности вируса в отобранных культурах клеток представлен в таблицах 2 (для культуры клеток почки щенка) и 3 (для других клеточных культур).

Установили, что в перевиваемой культуре клеток Vero, первично трипсинизированных клеточных культурах почки котенка и селезенки котенка аденовирус собак 2-го серотипа не накапливается, видимых морфологических изменений клеток выявлено не было; иммунохроматографическая тест-система показала отсутствие антигена возбудителя аденовирусной инфекции собак в культуральной жидкости начиная со второго пассажа. При микротитровании титр вируса не был определен. Культивирование вируса в первично трипсинизированной клеточной культуре селезенки щенка приводило к постепенному снижению инфекционной активности вируса. Учитывая полученные результаты, использование указанных культур клеток для культивирования нецелесообразно.

Инфекционная активность вируса в первично трипсинизированной культуре клеток почки щенка составила (4,33 ± 0,29) lg ТЦД₅₀/см³ на уровне третьего пассажа; титр вируса в перевиваемой культуре клеток MDCK был равен (4,25 ± 0,25) lg ТЦД₅₀/см³ на уровне пятого пассажа.

В результате исследований, представленных в таблицах 2 и 3, были выявлены следующие наиболее чувствительные культуры клеток: перевиваемая культура клеток MDCK линий NBL-2 (так называемая родительская) [22] и NBL-9, а также первично трипсинизированная клеточная культура почки щенка. Однако использование первично трипсинизированной культуры для последующего культивирования вируса с целью изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики нерационально, так как она является сезонной из-за использования доноров ткани. Субкультивирование первично трипсинизированных культур невозможно вследствие их низкой технологичности.

При формировании монослоя MDCK линии NBL-9 было отмечено неравномерное размещение клеток на поверхности флакона, что потенциально может отрицательно влиять на накопление вируса и способствовать ошибочной оценке наличия ЦПД при микроскопии (рис. 1). Титр инфекционной активности при культивировании в MDCK линии NBL-2 был незначительно выше. Таким образом, для дальнейшего подбора условий культивирования вируса была отобрана перевиваемая культура клеток MDCK линии NBL-2 (рис. 2).

Интактная культура клеток MDCK линии NBL-2 представлена на рисунке 3. Проявление ЦПД вируса через 96 и 120 ч отражено на рисунках 4 и 5 (увеличение 200× и 400×), где отчетливо просматриваются отдельные округлившиеся рефрактильные клетки, которые постепенно отслаиваются от стекла. В начале процесса морфологические изменения клеток имели очаговый характер, далее наблюдалась деструкция монослоя, приводящая к отделению клеток от поверхности культурального флакона. По мере размножения вируса число клеток, подвергшихся дегенерации, увеличивалось и в монослое образовывались пустоты. По краям сохранившихся участков монослоя концентрировались пораженные клетки, образуя большие конгломераты, напоминающие грозди винограда.

Для проведения дальнейших исследований необходимо было определить время культивирования, за которое накапливался CAV-2 в максимальных титрах. Результаты исследования представлены в таблице 4.

Установлено, что максимальное накопление вируса происходило на 5-е сутки культивирования (4,08 ± 0,29 lg ТЦД₅₀/см³). При культивировании вируса в течение 48, 72 и 96 ч уровень репродукции вируса был в диапазоне от (1,25 ± 0,25) до (3,08 ± 0,29) lg ТЦД₅₀/см³. Титр инфекционной активности снижался до значений (3,42 ± 0,14) и (3,08 ± 0,14) lg ТЦД₅₀/см³ при культивировании в течение 144 и 168 ч соответственно. Снижение инфекционной активности вируса, вероятно, связано с замедлением процессов обмена веществ клеток с внешней средой при длительном культивировании.

Также предварительно было исследовано влияние температурного режима (39,0 ± 0,5) °С на жизнеспособность культуры клеток MDCK. При данной температуре были отмечены морфологические изменения в культуре клеток через 12 ч. Через 24 ч монослой отторгался от поверхности. Вследствие этого данный диапазон температур не применяли для культивирования вируса.

Из результатов, представленных в таблице 5, можно сделать вывод, что при температуре (35,0 ± 0,5) °С активность CAV-2 была ниже и максимальный титр вируса составил (2,83 ± 0,29) lg ТДЦ₅₀/см³ после 144 ч культивирования. При температуре культивирования (37,0 ± 0,5) °С в культуре клеток MDCK линии NBL-2 активность вируса была максимальной (4,33 ± 0,14 lg ТДЦ₅₀/см³) через 120 ч культивирования. Далее наблюдалось постепенное снижение титра инфекционной активности CAV-2.

На следующем этапе определяли оптимальный для заражения вирусом возраст клеточного монослоя. Для этого использовали монослой через 24, 48, 72, 96 ч после внесения клеток MDCK в культуральный флакон, а также культуру клеток, внесенную в культуральный флакон непосредственно перед инокуляцией вируссодержащего материала. Результаты учитывали через 120 ч (5 сут) инкубации в термостате при температуре (37,0 ± 0,5) °С.

Исходя из полученных данных (табл. 6), оптимальным сроком формирования монослоя культуры клеток для заражения является 48 ч, титр вируса составил (4,08 ± 0,38) lg ТЦД₅₀/см³. При инокуляции CAV-2 в суспензию клеток до формирования монослоя титр вируса был равен (2,42 ± 0,14) lg ТЦД₅₀/см³. Монослой при этом формировался медленнее, чем у интактной культуры клеток, и в большей степени проявлялась тенденция к формированию кластеров клеток. При культивировании в течение 72 и 96 ч, вероятно, снижались процессы обмена веществ клеток и репродукции вируса. Титр инфекционной активности при этом составил (3,83 ± 0,14) и (3,08 ± 0,29) lg ТЦД₅₀/см³ соответственно.

С целью изучения влияния множественности заражения на уровень накопления CAV-2 в культуре клеток MDCK линии NBL-2 применяли следующие дозы инфицирования: 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001 ТЦД₅₀/кл. Инкубацию прекращали при разрушении 80% площади монослоя клеток и отделении их от поверхности. Полученные результаты приведены в таблице 7.

При дозе заражения 0,1 ТЦД₅₀/кл ЦПД наблюдалось уже через 48 ч после внесения суспензии вируса в культуру клеток. Однако титр CAV-2 составил (3,08 ± 0,38) lg ТЦД₅₀/см³ и был ниже, чем при дозе заражения 0,01 ТЦД₅₀/кл (4,33 ± 0,29 lg ТЦД₅₀/см³), что связано с быстрым разрушением монослоя и, как следствие, отсутствием возможности накопления вируса в максимальной концентрации. При множественности заражения 0,001 и 0,0001 ТЦД₅₀/кл титр инфекционной активности вируса был низким и находился на уровне (2,17 ± 0,14) и (1,75 ± 0,25) lg ТЦД₅₀/см³ соответственно; ЦПД в культуре клеток наблюдалось через 96 ч.

Фактор продолжительности предварительного контакта (адсорбции) вируса с монослоем культуры клеток MDCK также представляет интерес в связи с его влиянием на накопление вируса.

Установлено, что при культивировании без адсорбции титр инфекционной активности CAV-2 составил (2,16 ± 0,14) lg ТЦД₅₀/см³. Предварительный контакт вируса с монослоем улучшает репродукцию CAV-2, что характеризуется повышением его инфекционного титра. Оптимальным для максимального накопления вируса временем был предварительный контакт в течение 60 мин: титр инфекционной активности составил (4,33 ± 0,29) lg ТЦД₅₀/см³. При времени предварительной адсорбции 30 и 90 мин титр инфекционной активности находился на уровне (4,08 ± 0,38) и (4,08 ± 0,14) lg ТЦД₅₀/см³ соответственно.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной работы был выделен аденовирус собак 2-го типа, обладающий стабильностью на протяжении пяти пассажей и высоким титром инфекционной активности.

Были изучены параметры культивирования изолята CAV-2 в перевиваемых и первично трипсинизированных культурах клеток. В результате исследований отобрана наиболее чувствительная клеточная культура MDCK линии NBL-2, позволяющая получить вируссодержащий материал с высоким титром (4,33 ± 0,29 lg ТЦД₅₀/см³). Установлено, что условиями, способствующими накоплению CAV-2 в максимальных титрах, являются: использование для заражения монослоя культуры клеток, сформированного в течение 48 ч; множественность заражения 0,01 ТЦД₅₀/кл; время предварительной адсорбции 60 мин; культивирование при температуре (37,0 ± 0,5) °С в течение 120 ч.

Полученные результаты исследований могут быть использованы при разработке диагностических тест-систем, вакцинных препаратов для профилактики аденовирусной инфекции собак, вызванной вирусом 2-го серотипа.