Комплексные исследования и видовая идентификация вируса вирусной диареи крупного рогатого скота в популяциях высокопродуктивных животных на территории Свердловской области

ВВЕДЕНИЕ

Всемирная организация здравоохранения животных (WOAH) относит вирусную диарею крупного рогатого скота (ВД КРС, Bovine viral diarrhea, BVD) к инфекционным заболеваниям класса B. В США, Великобритании и большинстве стран Европы действуют государственные программы эпизоотологического контроля и оздоровления поголовья крупного рогатого скота (КРС) от данной инфекции [1].

Для животноводческой отрасли нашей страны в контексте выполнения приоритетных направлений Стратегии научно-технологического развития Российской Федерации (пункт 21г) задача по созданию высокопродуктивных молочных стад КРС является одной из первостепенных [2]. Однако, как и для зарубежных стран, для Российской Федерации вирусные инфекционные заболевания представляют собой негативный сдерживающий фактор развития животноводческой отрасли [3-5].

Экономические потери от ВД КРС для товарно-племенных хозяйств складываются из абортов, рождения слабого и нежизнеспособного молодняка, вынужденного убоя телят, снижения молочной продуктивности и сокращения продолжительности жизни сельскохозяйственных животных [6]. В неблагополучных хозяйствах наблюдается высокая летальность от болезни (до 10%). Наличие в стадах бессимптомно протекающей ВД КРС ухудшает ситуацию на сельскохозяйственных предприятиях, приводя к поголовному заражению животных, снижению продуктивности и воспроизводства, повышению затрат на лечебные мероприятия [6][7].

Снижение экономического ущерба, по мнению как российских, так и зарубежных ученых, возможно при регулярном оздоровлении сельскохозяйственных животных от вирусных инфекций [8-10]. Процесс оздоровления поголовья от ВД КРС очень долгий и не всегда заканчивается успехом, что напрямую связано с патогенетическими особенностями возбудителя [8].

Вирус ВД КРС (BVDV) делят на виды: BVDV-1, BVDV-2, HoBi-подобный (атипичный) пестивирус жвачных животных. Виды подразделяются на подгенотипы на основе филогенетического анализа [11][12]. BVDV можно разделить на цитопатические (CP) и нецитопатические (NCP) биотипы [13][14]. Цитопатический биотип BVDV может приводить к разным цитопатическим эффектам (CPE) в клеточных системах организма: цитоплазматической вакуолизации и разрушению клеток, что не наблюдается при NCP-биотипах вируса [15]. Поскольку иммунная система плода незрелая, BVDV NCP-типа (BVDV-1, BVDV-2) ингибирует способность организма животных индуцировать продукцию интерферона I типа. Таким образом, BVDV-1 или BVDV-2 NCP-типа у коров на ранних сроках беременности могут вызывать аборты или мертворождение [13-16]. 

Пестивирус 1-го типа (BVDV-1) считается более распространенным по всему миру среди КРС, возбудитель 2-го типа (BVDV-2) чаще регистрируют в США и Канаде, реже – в Японии, Индии, Южной Америке, в единичных случаях – в европейских странах [17]. Появление новых штаммов, а также штаммов BVDV с большей вирулентностью, например вызывающих геморрагическую болезнь у животных (Северная Америка, генотип 2), подчеркивает необходимость проведения диагностических исследований, связанных с генотипированием вируса [18]. Доза и вирулентность штаммов возбудителя, возраст и иммунокомпетентность животного – все это влияет на уровень патогенности [19].

Фекалии и выделения животных содержат большое количество вирусных частиц, поэтому они являются одним из важных источников заражения [13]. Кишечная форма ВД КРС проявляется у животных высокой температурой, анорексией, диареей, сильным обезвоживанием, при этом в фекалиях животных наблюдается примесь крови. Заболевание, как правило, носит спорадический характер, инкубационный период составляет одну – две недели, смертность больных животных чрезвычайно высока [14]. Клиническими особенностями у коров с заболеванием слизистых оболочек являются геморрагические, некротические и язвенные поражения. Кроме того, ВД КРС может проявляться потерей кишечных крипт, эрозиями, язвами и крупномасштабным некрозом слизистой частично или во всем желудочно-кишечном тракте [16]. Животные, обладающие иммунотолерантностью к BVDV, переболевая, выделяют вирус всю жизнь, становясь источником инфекции в популяции животных, что затрудняет искоренение болезни [20][21].

Кроме того, BVDV-1 обнаруживают в сперме, что представляет серьезную угрозу вертикальной передачи и свидетельствует о необходимости постоянного исследования быков-производителей на вирусоносительство [22-24].

Поскольку клинические проявления заболевания ВД КРС схожи с другими болезнями, такими как микоплазмоз, хламидиоз, паратуберкулез, парагрипп-3, инфекционный ринотрахеит КРС, то лабораторные исследования в диагностике имеют решающее значение [1].

В последнее время большое количество выявляемых случаев респираторно-кишечных заболеваний у КРС, содержащегося на территории Свердловской области, протекают в виде смешанных инфекций, когда патогенами являются и вирусы, и бактерии, и грибы [1]. В связи с чем отмечается выраженное тяжелое течение заболевания с клинической картиной, не характерной для моноинфекций, и чаще всего преобладает бактериальная инфекция, что усложняет процесс диагностики. В развитии вышеуказанных форм патологии у КРС доминирующими возбудителями признаны герпесвирус 1-го типа (BHV-1), BVDV, а также хламидии (Chlamydophila abortus, Chlamydophila pecorum), патогенные виды микоплазм (Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma spp.), различные бактерии и их ассоциации [5][25][26].

Цель работы – провести комплексное исследование циркулирующего вируса диареи крупного рогатого скота и сопутствующих патогенов, видовую идентификацию BVDV в популяциях КРС на территории Свердловской области.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа проведена в отделе мониторинга и прогнозирования инфекционных болезней и в лаборатории микробиологических и молекулярно-генетических методов исследований Уральского научно-исследовательского ветеринарного института – структурного подразделения ФГБНУ «Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук» в рамках Государственного задания № 0532-2021-0007 «Изучение структуры антигенного пейзажа возбудителей эмерджентных инфекций сельскохозяйственных животных, биологических особенностей механизмов их взаимодействия с макроорганизмом».

Комплексные лабораторные исследования проводили в 21 животноводческой организации Свердловской области, оздоровляемой от ВД КРС в период с 2018 по 2024 г.

Материалом для исследования служил биологический материал, отобранный от КРС голштинской породы: кровь и сыворотка крови; соскобы из цервикального канала и смывы с влагалища коров; смывы из носоглотки телят; сперма быков-производителей; образцы плаценты; кусочки внутренних органов от павших телят (печень, почки, легкие) и абортированных плодов (n = 113).

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени проводили в соответствии с инструкциями производителя по применению тест-систем. Использовали тест-наборы для выявления РНК BVDV (ООО «Лаборатория Изоген», Россия), ДНК Mycoplasma spp., Mycoplasma bovis и Mycoplasma bovigenitalium (Россия), ДНК BHV1 GenPak DNA PСR Test BHV1, ДНК Chlamydophila abortus, Chlamydophila pecorum (ООО «ВекторБест», Россия). Амплификацию проводили на приборе QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific Inc., США).

Дополнительно было отобрано 16 проб биологического материала, положительного на наличие РНК BVDV, которые поместили на хранение в ультранизкотемпературный морозильник (–70 °С) для дальнейшей типизации вируса методом ПЦР. Виды проб: объединенные пробы смывов из носоглотки телят (возраст 20 сут), сыворотки крови, абортированные плоды, плацента.

Для генотипирования BVDV проводили: выделение РНК из проб набором «АмплиПрайм® РИБО-Преп ВЕТ» (ООО «НекстБио», Россия), ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), амплификацию в реальном времени, электрофорезный анализ. В работе использовались синтетические олигонуклеотиды, ранее разработанные C. Letellier and P. Kerkhofs [18] (табл. 1).

Данные пары праймеров специфичны для высококонсервативных областей 5’ UTR. Последовательности зондов, маркированных красителями FAM и ROX с различием в три нуклеотида, позволили проводить дифференциацию между генотипами 1 и 2 BVDV.

Наработку кДНК производили с использованием коммерческого «Набора реактивов для обратной транскрипции с MMLV-RH» (ООО «Диаэм», Россия) по представленной программе амплификации в соответствии с инструкцией по применению.

После проведения ОТ-ПЦР и получения кДНК проводили постановку ПЦР в реальном времени с использованием реагентов мастер-микс «БиоМастер HS-Taq ПЦР (2×)» (ООО «Диаэм», Россия); 100 мM Трис-НCl, рН 8,5 (при 25 °С), 100 мM KCl, 0,4 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 4 мМ MgCl₂, 0,06 ед. акт/мкл Taq ДНК-полимеразы, 0,2% Tween 20, стабилизаторы HS-Taq ДНК-полимеразы. Для оптимизации подбирались разные концентрации веществ для отработки праймеров. Амплификацию проводили на приборе CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, Inc., США), параметры указаны в таблице 2.

В качестве контролей использовали РНК, выделенную из лекарственного препарата ветеринарного назначения Бови-шилд Голд FP5 L5 (Zoetis Inc., США), содержащего аттенуированные вирусы: инфекционного ринотрахеита КРС (Bovine herpesvirus, тип 1), диареи (BVDV, типы 1 и 2), парагриппа-3 (PIV-3), респираторно-синцитиальной инфекции (BRSV).

Детекция полученного ПЦР-продукта проводилась методом гель-электрофореза с применением агарозного геля и мини-камеры Mini-Sub Cell GT с визуализацией в камере ChemiDoc XRS+ и интерпретацией результатов с помощью Gel Doc XR+ (Bio-Rad Laboratories, Inc., США). Использовали размерный стандарт с шагом 100 п. н. (ООО «СибЭнзайм», Россия).

Полученные данные обрабатывали с помощью программы Microsoft Excel, входящей в пакет программ Microsoft OfficePro 19.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В 2018 г. на территории Свердловской области началось внедрение «Комплексной программы биологической защиты и оздоровления сельскохозяйственных организаций от вирусной диареи крупного рогатого скота». Ранее опубликованные О. В. Соколовой [15] результаты исследования по изучению динамики распространения ВД КРС на предприятиях Свердловской области дополнены новыми данными и представлены на рисунке 1.

В течение периода реализации программы оздоровительных мероприятий наблюдалась тенденция снижения количества животноводческих хозяйств, неблагополучных по ВД КРС. У молодняка острая и персистентная форма инфекции регистрировалась в 4 и 3,5 раза реже соответственно. Следует отметить увеличение в 2,5 раза диагностируемой латентной формы течения болезни у взрослого поголовья, что связано с повышением уровня лабораторной диагностики, применяемой на сельскохозяйственных предприятиях. В то же время имело место нарушение регламентов специфической профилактики. Так, при анализе выполнения этапов программы оздоровительных мероприятий в хозяйствах в 47,7% случаев выявлены несоответствия, связанные с человеческим фактором (рис. 2).

На предприятиях с установленным нарушением графиков вакцинации и выборочной вакцинацией физиологических групп латентная форма течения ВД КРС у взрослого поголовья регистрируется в 67% случаев от числа обследованных проб.

При исследовании в 2018–2024 гг. поступивших из 21 сельскохозяйственной организации 113 проб биологического материала от КРС с заболеваниями репродуктивной системы, респираторного и желудочно-кишечного тракта неясной этиологии специфические участки РНК BVDV определялись в 15,9% случаев: смешанная инфекция – 10,6%, BVDV – 5,3% (рис. 3).

Геном возбудителя ВД КРС был выявлен в 61,1% проб биологического материала от коров, абортировавших на разных сроках беременности, а также в 38,9% проб, полученных от телят.

В поступившем на ПЦР-исследование материале от взрослых абортировавших на разных сроках беременности коров генетический материал BVDV чаще обнаруживали в гомогенате органов абортированных плодов (38,8% случаев), в смывах с влагалища и в плаценте (11,2% случаев). Также геном возбудителя ВД КРС в 27,7% случаев выявляли в смывах с носовых ходов телят, имеющих признаки острых респираторных и желудочно-кишечных заболеваний неясной этиологии, и в 11,1% случаев – в паренхиматозных органах (суспензия из кусочков печени, сердца, селезенки, почки и тонкого отдела кишечника) павших телят.

Дополнительные исследования по типизации BVDV с применением праймерной системы позволили установить наличие вируса 1-го типа в 4 из 16 проб биоматериала (смывы из носоглотки 20-суточных телят, суспензия из органов абортированных плодов и плаценты). Вирус 2-го генотипа в исследуемых пробах выявлен не был. Можно предположить, что выделенный изолят BVDV-1 (смывы из носоглотки телят, абортированные плоды и плаценты) является высоковирулентным, поскольку летальность молодняка составляла до 20%, а количество/частота абортов у молочного скота – до 5%.

Результаты типирования BVDV методом ОТ-ПЦР представлены на рисунке 4.

В 10,6% проб, помимо BVDV, были обнаружены и другие инфекционные агенты. В 44,0% проб влагалищных смывов от абортировавших коров и единично в плаценте и паренхиматозных органах от павших телят одновременно выявляли РНК BVDV, ДНК Mycoplasma bovis и Chlamydophila pecorum. В 16,0% проб патматериала от павших телят также было обнаружено несколько патогенов: BVDV + Bovine herpesvirus 1-го типа. В единичных случаях в смывах из носоглотки телят выявляли РНК BVDV, ДНК Chlamydophila pecorum и Mycoplasma bovigenitalium.

Таким образом, реализация всех мероприятий, включающих мониторинговые исследования, диагностику «индикаторных» групп, создание «закрытых стад», вакцинопрофилактику и биологическую защиту животных, выявление скрытых носителей возбудителя инфекции и своевременные лечебные мероприятия, является результативной мерой, а дальнейший мониторинг ее качества, устранения отклонений обеспечит оздоровление от ВД КРС в условиях промышленных предприятий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных с 2018 по 2024 г. ПЦР-исследований 113 проб биологического материала, полученного от коров и телят, было обнаружено наличие РНК возбудителя ВД КРС в 15,9% случаев. Геном BVDV выявлен в пробах от абортировавших на разных сроках беременности коров в 61,1% случаев, а также от телят в 38,9% случаев. При проведении типизации вируса установлена его принадлежность к 1-му типу (в 4 пробах: смывы из носоглотки телят, суспензия из органов абортированных плодов и плаценты). Помимо BVDV, в 10,6% проб были обнаружены другие инфекционные агенты, указывающие на наличие смешанной инфекции. Были выявлены сочетания BVDV с такими патогенами, как Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium, Chlamydophila pecorum, Bovine herpesvirus (тип 1).

Проведенные мониторинговые диагностические исследования указывают на наличие положительной динамики по снижению случаев выявления ВД КРС на предприятиях Свердловской области, что говорит об успешности внедрения «Комплексной программы биологической защиты и оздоровления сельскохозяйственных организаций от вирусной диареи крупного рогатого скота». В настоящее время наблюдается уменьшение количества неблагополучных по ВД КРС хозяйств в 2 раза, при этом доля выявленных случаев латентной формы инфекции у взрослого поголовья увеличилась в 2,5 раза, что связано с расширением панели диагностических тестов, регулярным мониторингом стад, а также с нарушением регламента вакцинации животных при реализации указанной программы.

Дальнейший мониторинг качества ее выполнения, в том числе клинико-лабораторные исследования, направленные на выявление циркуляции BVDV и устранение отклонений в регламентах специфической профилактики, обеспечит оздоровление стад в условиях промышленных предприятий.

Также будет продолжена работа с типизацией BVDV, которая включит в себя количественную оценку геномов вируса, секвенирование для последующего генетического анализа BVDV (субтипирование, вирулентность изолятов), циркулирующего в стадах животных Свердловской области.