Характеристика микробиоты кишечного тракта у телят с различными формами острой катаральной бронхопневмонии

ВВЕДЕНИЕ

В последнее время в связи с интенсификацией молочного животноводства наблюдается увеличение концентрации крупного рогатого скота на животноводческих комплексах. Это, в свою очередь, создает неблагоприятные условия, способствующие снижению устойчивости животных к различным вредным воздействиям окружающей среды, в том числе к негативному влиянию ассоциаций условно-патогенной микрофлоры, циркулирующей в фермерских биогеоценозах [1-3]. Факторные инфекции у крупного рогатого скота встречаются достаточно часто и наносят значительный экономический ущерб животноводству. К числу наиболее частых факторных инфекций относятся акушерско-гинекологические заболевания коров, а также пневмоэнтериты телят. Для предотвращения данных инфекций крупного рогатого скота необходимо соблюдать профилактические меры, включающие регулярную вакцинацию, поддержание гигиены в стойлах животных, контроль за кормлением и поением, а также регулярный осмотр и лечение больных животных [4-6].

В настоящее время в животноводческих хозяйствах среди высокопродуктивных животных широко распространены респираторные заболевания, которые чаще всего диагностируются у молодняка. При этом экономические потери для отрасли складываются из падежа животных, потери продуктивности у больных или выздоровевших особей, замедления их роста и развития, затрат на лечение и профилактику [7]. Бронхопневмония телят регистрируется практически во всех зонах нашей страны и среди всех патологий в хозяйствах занимает второе место после желудочно-кишечных заболеваний, достигая 20–30% [8]. Этиологическими факторами неспецифической бронхопневмонии телят является комплекс причин: скученность содержания, снижение резистентности и иммунологической реактивности организма новорожденных животных, воздействие неблагоприятных факторов внешней среды, стресс, несбалансированное кормление, а также условно-патогенная микробиота дыхательных путей, которая в указанных условиях может приобрести патогенные свойства [9-11].

Триллионы микроорганизмов, обитающих в кишечном тракте, являются важными регуляторами здоровья, поэтому качественные и количественные нарушения в микробных биотопах кишечника могут вызывать либо осложнять различные заболевания инфекционного характера [12-15]. Синдром «дырявой кишки» – это заболевание, характеризующееся повышенной проницаемостью кишечника. Поскольку кишечный барьер является одним из важнейших компонентов, поддерживающих гомеостаз в желудочно-кишечном тракте, потеря его целостности из-за изменений бактериального состава, снижения уровней экспрессии белков плотных соединений и повышенной концентрации провоспалительных цитокинов может привести к увеличению проницаемости кишечника с последующим развитием желудочно-кишечных и иных заболеваний. Транслокация микроорганизмов и их токсичных метаболитов за пределы биотопа – желудочно-кишечного тракта – является одним из последствий синдрома «дырявой кишки» [16-18].

Транслокация кишечной микробиоты является процессом, при котором микроорганизмы из кишечного тракта проникают через его стенку в кровоток и распространяются по организму. Это может играть значительную роль при развитии инфекционных заболеваний различной этиологии, в том числе и респираторного характера. Так, патогенные микроорганизмы, попадая в кровоток посредством кишечной транслокации, могут вызвать системный воспалительный ответ организма, что ухудшает течение инфекции. Также бактерии, проникая через стенку кишечника, могут стать причиной развития метастатических инфекций различных органов и тканей, что может привести к осложнению уже имеющегося заболевания и более тяжелому течению болезни. Кроме этого, кишечная транслокация микроорганизмов может способствовать формированию бактериемии, что может привести к развитию сепсиса и шокового состояния. Проникновение инфекционных агентов из кишечного тракта в кровоток может также стать причиной рецидивов инфекции после завершения антибиотикотерапии [19-22].

В целом кишечная транслокация микроорганизмов играет важную роль в развитии и течении различных инфекционных заболеваний, поэтому контроль этого процесса может быть ключевым аспектом в лечении таких состояний. В этой связи изучение роли кишечной транслокации микроорганизмов при острой катаральной бронхопневмонии различной степени тяжести является актуальным вопросом, требующим своевременного и грамотного решения.

Новизна работы состоит в том, что впервые исследовано состояние биотопа прямой кишки у телят с острой катаральной бронхопневмонией различной степени тяжести. Показано, что в зависимости от тяжести инфекционного процесса возникают существенные качественные и количественные сдвиги, характеризующиеся развитием дисбактериоза кишечника.

Цель работы – провести сравнительную характеристику микробиоты кишечного тракта телят с компенсированной, субкомпенсированной и декомпенсированной острой катаральной бронхопневмонией в условиях животноводческих ферм Владимирской и Московской областей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 24-26-00091, https://rscf.ru/project/24-26-00091) на базе животноводческих ферм Владимирской и Московской областей с общим поголовьем 3680 гол., в том числе 1690 коров. Бактериологические исследования проводили на базе ветеринарной лаборатории ООО «ВЕТТЕСТ» (г. Москва).

Объектом исследования служили телята в возрасте 1–3 мес., больные острой катаральной бронхопневмонией (n = 37). Диагноз ставили комплексно с учетом данных анамнеза, клинического осмотра, а также микробиологических исследований. Животные, которых лечили в течение 14 дней до отбора проб, были исключены из исследования. Оценку степени тяжести острой катаральной бронхопневмонии телят (1-я степень – компенсированная; 2-я степень – субкомпенсированная; 3-я степень – декомпенсированная) осуществляли на основании проведенных клинико-лабораторных исследований. В зависимости от степени тяжести бронхопневмонии животные были разделены на три группы: телята с легкой (компенсированной, n = 12), средней (субкомпенсированной, n = 14) и тяжелой (декомпенсированной, n = 11) степенью тяжести заболевания. Контролем служил материал, отобранный от клинически здоровых животных (n = 8).

От опытных телят в утренние часы отбирали пробы фекалий в стерильные пробирки. При проведении микробиологических исследований из полученного биологического материала с помощью пипетки Пастера производили посевы на питательные среды. Для дрожжеподобных грибов использовали глюкозный агар Сабуро; для стафилококков – пептонно-солевую среду, желточно-солевой агар и мясо-пептонный агар (МПА); для энтеробактерий – агар Эндо, среду Плоскирева, среду Кинга и висмут-сульфит агар; для бифидобактерий – среду Блаурокка; для лактобактерий – обезжиренное молоко и агар MRS. Посевы снова инкубировали в термостате при 37–38 °C в течение 24 ч, а при отсутствии роста чашки выдерживали до 3 дней. После изучения культурально-морфологических свойств из всех отдельных типовых колоний делали пересевы в пробирки и инкубировали при 37–38 °С в течение 24 ч. Полученные таким образом чистые культуры бактерий проверяли на подвижность в препаратах раздавленной капли с помощью фазово-контрастной микроскопии в затемненном поле зрения и подвергали идентификации.

Для количественного бактериологического исследования в стерильные пробирки со стерильным физиологическим раствором хлорида натрия в объеме 9,0 см³ отбирали 1,0 г фекалий. Из содержимого первой пробирки, которое считалось за разведение 10^-1, готовили дальнейшие десятикратные разведения до 10^-10. Затем из каждой пробирки проводили посевы 0,1 см³ полученной смеси в чашки Петри на поверхность твердых питательных сред (Эндо, МПА, Сабуро, Блаурокка, MRS, ПСЛ, Кинга, Ресселя, висмут-сульфит агар, желточно-солевой агар).

Количество микроорганизмов (С) в 1,0 см³ фекалий, отобранных от телят с острой катаральной бронхопневмонией, рассчитывали по приведенной ниже формуле и выражали в логарифмах с основанием 10:

C = (N/V) × K,

где N – среднее количество колоний в одной бактериологической чашке; V – объем суспензии, который наносят во время посева на агар (см³); К – кратность разведения.

Морфологию бактерий изучали в мазках, окрашенных по Граму и Романовскому – Гимзе. Дальнейшую идентификацию по биохимическим свойствам осуществляли в соответствии с «Определителем бактерий Берджи»².

Полученные результаты исследований обрабатывали статистически и представляли в виде таблиц. Все расчеты проводили с помощью программы STATISTICA 7.0. (StatSoft, США), при этом предварительно оценивали нормальность распределения с помощью тестов Шапиро – Уилка. В случае нормального распределения количественных переменных для сравнения двух групп применяли t-тест Стьюдента для независимых выборок. Рассчитывали среднее арифметическое (Mean), среднеквадратическую ошибку (SE) и стандартное отклонение (SD). Достоверность разницы аналитов между показателями контрольной и опытными группами рассчитывали по методу Манна – Уитни³.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При проведении эпизоотологического обследования выявлено 37 телят в возрасте от 1 до 3 мес. с острой катаральной бронхопневмонией. Клинические исследования позволили разделить животных на три группы по степени тяжести болезни: 12 телят отнести к легкой, компенсированной форме (незначительное угнетение, субфебрильная температура тела, поверхностное жесткое дыхание, серозные истечения из носа), 14 – к средней, субкомпенсированной (угнетение, повышение температуры, учащение пульса и дыхания, сухие хрипы и кашель, обильные серозно-катаральные истечения), а 11 – к тяжелой, декомпенсированной (выраженное угнетение и истощение, отсутствие аппетита, снижение реакции на внешние раздражители, повышение температуры, учащение пульса и дыхания, болезненный сухой кашель, хрипы, очаги притупления перкуторного звука, обильный серозно-катаральный экссудат зеленоватого цвета).

Проведение микробиологических исследований проб бронхоальвеолярного лаважа, отобранных от больных животных, показало, что возникновение бронхопневмонии у телят обусловлено достаточно широким спектром условно-патогенной микрофлоры. Так, из образцов исследуемого содержимого бронхов было изолировано 115 бактерий тринадцати видов, отнесенных к девяти родам. При этом чаще из проб бронхоальвеолярного лаважа выделяли Staphylococcus аureus – 18 (15,6%) культур, Mannheimia haemolytica – 18 (15,6%) штаммов, Escherichia сoli – 15 (13,1%) изолятов, Pasteurella multocida – 11 (9,6%) культур и Klebsiella pneumonia – 11 (9,6%) штаммов. Значительно реже изолировали культуры Staphylococcus intermedius и Proteus mirabilis – по 3 (2,6%) случая соответственно.

Количество микроорганизмов (lg) в 1 г фекалий телят при компенсированной, субкомпенсированной и декомпенсированной острой катаральной бронхопневмонии представлены в таблице.

Анализ полученных результатов показал, что у телят при компенсированной острой катаральной бронхопневмонии качественный и количественный состав кишечного микробиома не отличается от клинически здоровых животных.

Представленные данные демонстрируют, что в кишечном биотопе животных с клинической манифестацией средней степени тяжести острой катаральной бронхопневмонии происходят существенные количественные и качественные сдвиги, которые свидетельствуют о развитии дисбактериоза. При субкомпенсированной бронхопневмонии в пробах фекалий телят регистрировали достоверное увеличение Enterobacter spp. – в 1,26 раза (р < 0,05), Citrobacter spp. – в 1,35 раза (р < 0,05), Klebsiella spp. – в 1,90 раза (р < 0,01), Proteus spp. – в 1,66 раза (р < 0,01), Pseudomonas spp. – в 2,58 раза (р < 0,001), Clostridium spp. – в 2,06 раза (р < 0,001) и Candida spp. – в 2,12 раза (р < 0,01) при сравнении с показателями животных группы контроля. Это наблюдали на фоне высокодостоверного (р < 0,001) снижения представителей родов Lactobacillus и Bifidobacterium с (10,42 ± 0,72) до (8,59 ± 0,76) lg и с (10,94 ± 0,73) до (9,06 ± 0,62) lg, на 17,56 и 17,18% соответственно при сравнении с показателями клинически здоровых телят.

Результаты, приведенные в таблице, также указывают на то, что у телят при наиболее тяжелой, декомпенсированной, степени острой катаральной бронхопневмонии наблюдали значительные количественные и качественные дисбиотические сдвиги микробиоты кишечного тракта. Так, у больных животных при исследовании проб фекалий регистрировали достоверное увеличение представителей родов Escherichia – в 1,21 раза (р < 0,001), Enterobacter – в 1,63 раза (р < 0,001), Citrobacter – в 1,83 раза (р < 0,001), Klebsiella – в 3,08 раза (р < 0,001), Proteus – в 1,90 раза (р < 0,001), Pseudomonas – в 3,57 раза (р < 0,001), Staphylococcus – в 1,24 раза (р < 0,05), Streptococcus – в 1,38 раза (р < 0,01), Bacillus – в 1,47 раза (р < 0,01), Clostridium – в 3,34 раза (р < 0,001) и дрожжевых грибов из рода Candida – в 2,82 раза (р < 0,001) при сравнении с показателями животных контрольной группы. Представленные количественные различия регистрировали на фоне высокодостоверного снижения в пробах фекалий опытных животных Lactobacillus spp. (р < 0,001) и Bifidobacterium spp. (р < 0,001) с (10,42 ± 0,72) до (6,51 ± 1,08) lg и с (10,94 ± 0,73) до (7,36 ± 0,81) lg, на 37,5 и 32,7% соответственно в сравнении с группой контроля. Приведенные данные получены нами впервые.

Качественная характеристика микрофлоры кишечника телят при острой катаральной бронхопневмонии компенсированной, субкомпенсированной и декомпенсированной степени тяжести приведена на рисунке.

Как видим, при наиболее легком, компенсированном, течении болезни не выявляли представителей родов Klebsiella, Pseudomonas и Clostridium, которые были изолированы при более тяжелом течении заболевания – субкомпенсированной и декомпенсированной степеней тяжести. Стоит предположить, что тяжесть бронхопневмонии может быть связана с развитием дисбактериоза кишечника и возникновением феномена кишечной транслокации микроорганизмов из природного, эволюционно сложившегося биотопа в очаг деструкции – легкие. Поэтому в дальнейших исследованиях необходимо определить идентичность микрофлоры кишечного тракта с изолированными из легочной ткани микроорганизмами при бронхопневмонии.

Таким образом, предложены новые критерии оценки тяжести острой катаральной бронхопневмонии у телят. Так, при клинической манифестации субкомпенсированной и декомпенсированной острой катаральной бронхопневмонии у телят в кишечнике происходят существенные количественные и качественные нарушения микробиома, что свидетельствует о возникновении дисбактериоза. Развитие дисбактериоза кишечника, предположительно, может служить своеобразным триггером формирования и прогрессирования патологий респираторного тракта. Полученные данные совпадают с рядом исследований состояния микробиома кишечника при воспалительных процессах различной локализации [20][23]. Это подтверждает важную роль кишечной микробиоты и проницаемости кишечника (нормальной и повышенной) при манифестации многих инфекционных болезней. Однако доступные на настоящий момент данные выборочны и недостаточны, их оценка является предметом дискуссий, а клиническое значение требует дополнительного изучения. В этой связи считаем, что изучение состояния микрофлоры кишечника у животных при воспалительных и инфекционных процессах требует дальнейших скрупулезных исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Дана детальная характеристика микробиоты кишечного тракта у телят с острой катаральной бронхопневмонией при различной степени тяжести инфекционного процесса. Показано, что у телят при компенсированной острой катаральной бронхопневмонии качественный и количественный состав кишечного микробиома не отличается от клинически здоровых животных. Установлено, что при субкомпенсированной острой катаральной бронхопневмонии в кишечном биотопе животных происходят существенные количественные и качественные сдвиги, которые свидетельствуют о развитии дисбактериоза. Так, в пробах фекалий регистрировали достоверное увеличение представителей родов Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Clostridium и Candida на фоне высокодостоверного снижения представителей родов Lactobacillus и Bifidobacterium на 17,56 и 17,18% соответственно при сравнении с показателями клинически здоровых телят. У телят с острой катаральной бронхопневмонией при наиболее тяжелой, декомпенсированной, степени течения наблюдали еще более значительные количественные и качественные дисбиотические сдвиги микробиоты кишечного тракта. Так, в пробах фекалий от больных животных при сравнении с показателями животных контрольной группы регистрировали достоверное увеличение представителей родов Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Clostridium и дрожжевых грибов из рода Candida. Это выявляли на фоне высокодостоверного снижения в пробах фекалий опытных животных представителей родов Lactobacillus и Bifidobacterium на 37,5 и 32,7% соответственно в сравнении с контролем. Следует отметить, что при субкомпенсированной и декомпенсированной острой катаральной бронхопневмонии в пробах фекалий телят, в отличие от здоровых животных и животных с легкой степенью патологии, обнаружены представители родов Klebsiella, Pseudomonas и Clostridium.