Разработка и валидация высокочувствительного метода мультиплексной ОТ-ПЦР-РВ для обнаружения генома вируса классической чумы свиней

ВВЕДЕНИЕ

Классическая чума свиней (КЧС, Pestis suum) – одна из основных вирусных болезней, оказывающих значительное влияние на развитие свиноводства и охотничьего промысла дикого кабана [1].

Возбудителем КЧС является Pestivirus C рода Pestivirus семейства Flaviviridae, геном которого представлен одноцепочечной РНК положительной полярности длиной 12,3 т. н. [2]. Молекула РНК содержит две нетранслируемые области (5'-NTR и 3'-NTR), а также одну рамку считывания, кодирующую 13 белков (4 структурных и 9 неструктурных) [3].

Согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения животных (ВОЗЖ), КЧС подлежит нотификации [4]. И несмотря на ликвидацию КЧС в европейских странах и России, где последняя вспышка регистрировалась в 2019 г. среди домашних свиней и в 2020 г. в популяции дикого кабана, угроза эмерджентного трансграничного заноса остается, что требует систематического надзора за заболеванием [5]. Ввиду отсутствия достоверных данных по количеству проведенного пассивного серологического мониторинга доказать циркуляцию вирулентного вируса КЧС в популяции дикого кабана на территории России затруднительно [6].

В настоящее время метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) широко используется как один из самых быстрых, специфичных и чувствительных методов в молекулярной биологии, нацеленных на обнаружение генетического материала возбудителей болезней [7]. Однако метод классической ПЦР с электрофоретической детекцией в агарозном геле – долгий и трудоемкий, несущий высокий риск перекрестной контаминации [8]. Для диагностики КЧС, в том числе скринингового мониторинга, наиболее подходит мультиплексная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) с внутренним контрольным образцом (ВКО), снижающим вероятность недостоверных результатов [9].

Зонды TaqMan, позволяющие проводить гибридизационно-флуоресцентную детекцию результатов ПЦР в режиме реального времени, как одни из самых практичных и надежных для диагностики пестивирусных инфекций, используются в ряде протоколов [10]. Большинство тест-систем на основе ОТ-ПЦР-РВ, описанных ранее для обнаружения генома вируса КЧС, амплифицируют фрагмент 5'-нетранслируемой области (5’-NTR) и демонстрируют приемлемую чувствительность и специфичность [11]. Более высокий уровень аффинности праймеров к ДНК-мишени и физико-химической стабильности достигается модификацией олигонуклеотидов в LNA (locked nucleic acid) [12].

Использование экзогенного ВКО дает возможность избегать ложноотрицательных результатов, возникающих вследствие ошибок как на стадии пробоподготовки (выделение нуклеиновой кислоты), так и амплификации целевого фрагмента [13].

Цель этого исследования заключалась в разработке и валидации высокочувствительного, специфичного и воспроизводимого протокола мультиплексной ОТ-ПЦР-РВ с ВКО, релевантного для диагностики всех субгенотипов вируса КЧС, циркулировавших на территории Российской Федерации (1.1, 1.2, 2.1, 2.3) в период с 1982 по 2020 г. [5][14]. Такой метод должен обладать характеристиками, удовлетворяющими всем требованиям для тест-системы на основе ПЦР-РВ, и возможностью широкого применения в диагностическом мониторинге инфекции [15].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусы и бактерии. Для разработки методики использовали разные штаммы вируса КЧС: референтный «Ши-мынь», «684», «719» (субгенотип 1.1), вакцинный «СК» (субгенотип 1.2), «CSF Amur 19-10/WB-12555» и «CSF Tigrovoe 16/WB-634» (субгенотип 2.1), «275» (субгенотип 2.2), «368», «870», «843» (субгенотип 2.3) и штаммы с неопределенным генотипом «589», «924», «925», «929», «917», «918», «920», «926», «927», «930» вируса КЧС, выделенные в России в период с 1982 по 2020 г.

Для определения аналитической специфичности метода использовали гетерологичные возбудители болезней свиней: вакцинный штамм «ВК»-ДЕП вируса болезни Ауески; штамм «Иркутский 2007» американского вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС); референс-штамм «Мозамбик-78» V генотипа вируса африканской чумы свиней (АЧС); изолят «Челябинск 2021» вируса диареи крупного рогатого скота II генотипа (ВД КРС), полевой изолят возбудителя рожи свиней Erysipelothrix rhusiopathiae. Патогенный биологический агент получен в форме лиофилизированного материала из государственной коллекции штаммов микроорганизмов и рабочей коллекции ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

Животные. Для получения первичной культуры клеток использовали подсвинков массой 10–15 кг в возрасте 2–2,5 мес. из благополучных по КЧС хозяйств Владимирской области. Эвтаназию и отбор эксплантата тестикул производили в соответствии с требованиями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22.09.2010 по охране животных, используемых в научных целях.

Культивирование. Вирус КЧС накапливали в первично трипсинизированной культуре клеток тестикул свиней (ТС), культивируемой на среде Игла-МЕМ, приготовленной по прописи ФГБУ «ВНИИЗЖ», с добавлением 10% фетальной сыворотки крови КРС и 50 мкг/см³ гентамицина сульфата [16]. Идентификацию репродукции возбудителя проводили в ОТ-ПЦР-РВ согласно методическим рекомендациям².

Внутренний контрольный образец. В качестве ВКО выбран РНК-содержащий бактериофаг MS2 семейства Leviviridae, патогенный для Escherichia coli [17].

Дизайн праймеров и зондов. Выравнивание и сравнительный молекулярно-генетический анализ нуклеотидных последовательностей кДНК различных субгенотипов вируса КЧС, импортированных из базы данных GenBank, осуществляли с использованием программы Bioedit v7.2.5 и NCBI: Nucleotide BLAST. Критерием выбора оптимальных праймеров служили консервативные участки генома вируса КЧС. Праймеры и зонд для амплификации и гибридизации фрагмента ВКО выбраны исходя из литературных данных [18]. Синтез олигонуклеотидов выполнялся в компании ООО «Синтол» (Россия).

Выделение нуклеиновых кислот. РНК вируса КЧС экстрагировали из культуральной вируссодержащей суспензии ТС, а геном гетерологичных вирусов и бактерий – из лиофилизата нуклеосорбционным методом с использованием набора реагентов для выделения ДНК/РНК из биологического материала «РИБО-сорб» (ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкциями производителя³.

Постановка ОТ-ПЦР-РВ. Реакционная ПЦР-смесь содержала компоненты от производителя НПО «Евроген» (Россия), а именно набор OneTube RT-PCR TaqMan, включающий смесь OneTube RT-PCRmix, ревертазу TM-MMLV и воду, свободную от нуклеаз. Все стадии ПЦР (обратную транскрипцию, собственно амплификацию и гибридизационно-флуоресцентную детекцию) проводили в автоматическом амплификаторе Rotor-Gene Q в комплекте с программным обеспечением (QIAGEN, Германия).

Положительный контрольный образец (ПКО). В качестве ПКО предложен вакцинный штамм «СК» вируса КЧС с титром не менее 3,5 lg ККИД₅₀/см³ в форме лиофилизированного материала, растворенного в 4,0 см³ физиологического раствора и инактивированного термическим методом путем нагревания в течение 60 мин при температуре +60 °C. Полноту инактивации проверяли методом трех последовательных слепых пассажей в культуре клеток ТС согласно методическим рекомендациям³.

Отрицательный контрольный образец (ОКО). В качестве ОКО использовали воду, свободную от нуклеаз, производства НПО «Евроген» (Россия).

Валидация. Валидационные параметры определялись согласно рекомендуемому руководству по публикации результатов разработки количественных ПЦР-РВ-протоколов (MIQE: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) [19]. Для определения правильности, сходимости и воспроизводимости анализировали положительный на наличие вируса КЧС штамма «719» образец: в 6 повторяемых реакциях, в 3 параллельных испытаниях в течение дня одним исследователем и в 3 параллельных испытаниях в течение 3 дней двумя исследователями. Аналитическую чувствительность (предел детекции) вычисляли в 10-кратных разведениях вируса КЧС штаммов «719», «684», «Ши-мынь» с известным титром. Показатель предела детекции выражали в минимальном титре вируса (lg ККИД₅₀/см³), обнаруженном валидируемым методом. Эффективность амплификации вычисляли согласно формуле:

Е = (10^1/slope − 1) × 100%,

где slope – это значение наклона линейной области зависимости Ct от логарифма концентрации кДНК-матрицы.

Проверку аналитической специфичности выполняли в реакции ОТ-ПЦР-РВ с заведомо отрицательными на наличие РНК вируса КЧС образцами, содержащими экстрагированный геном гетерологичных вирусов и бактерий, а также с образцами штаммов вируса КЧС различных субгенотипов. Для определения диагностической чувствительности готовили панель с 27 истинно положительными образцами (селезенка, печень, почка, кровь, лимфатические узлы, мышечная ткань, ректальные и оральные мазки), полученными на разных стадиях протекания инфекционного процесса у экспериментально зараженных эпизоотическим штаммом вируса КЧС свиней, а также образцами корма, контаминированного инфицированными животными. Показатель диагностической специфичности определяли путем исследования 27 заведомо отрицательных образцов полнорационного комбикорма для свиней, 10%-х суспензий селезенки, почек, печени, лимфатических узлов, мясных изделий свиного происхождения, цельной крови, оральных и ректальных смывов свободных от КЧС свиней, полученных в референтной лаборатории по африканской чуме свиней ФГБУ «ВНИИЗЖ» в рамках реализации государственного эпизоотологического мониторинга и проведения исследований на коммерческой основе со свиноводческими хозяйствами европейской части России. Сравнительная оценка как диагностической, так и аналитической чувствительности проводилась в параллельном исследовании образцов зашифрованными отечественными тест-системами № x1 и x2 согласно инструкции производителей. Выбранные тест-системы наиболее востребованы в России для диагностики КЧС и, так же как и исследуемая тест-система, содержат ВКО.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы Microsoft Excel. Построение графиков выполнялось в программе GraphPad Prism.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Дизайн олигонуклеотидов. По результатам выравнивания и сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей штаммов различных субгенотипов вируса КЧС наиболее консервативной областью генома, как и ожидалось, оказалась 5’-NTR, к которой и были подобраны прямой и обратный праймеры в модификации LNA, амплифицирующие фрагмент в 120 нуклеотидов (рис. 1).

TaqMan-зонды к целевому фрагменту генома вируса КЧС мечены флуорофором 6-FAM (6-карбоксифлуоресцеин), а к участку ВКО – флуорофором Cy5.5 (цианин-5.5).

Оптимизация условий ОТ-ПЦР-РВ. В процессе оптимизации определены температурно-временной профиль и количественный состав ПЦР-смеси.

Смесь на одну реакцию содержала 1Х OneTube RT-PCRmix, 0,4 пмоль прямого (forward) и 0,4 пмоль обратного (reverse) праймеров, 0,2 пмоль TaqMan-зонда, специфичных к фрагменту вируса КЧС; по 0,1 пмоль прямого, обратного праймеров и TaqMan-зонда, специфичных к участку ВКО, 1Х TM-MMLV ревертазы, 10,0 мкл РНК-матрицы. До конечного объема реакционной смеси 25,0 мкл добавлялась вода, свободная от нуклеаз.

Программа ПЦР включала в себя обратную транскрипцию при 50 °С в течение 25 мин и амплификацию с двойным циклированием: общую денатурацию с целью инактивации ревертазы и активации ДНК-полимеразы с «горячим стартом» при 95 °С в течение 10 мин, первые 10 циклов без детектирования флуоресценции (денатурация при 95 °С в течение 10 с, отжиг праймеров при 60 °С в течение 40 с, элонгация при 72 °С в течение 10 с), затем 35 циклов с детектированием флуоресценции на каналах Green и Crimson (денатурация при 95 °С в течение 10 с, отжиг праймеров при 55 °С в течение 40 с, элонгация при 72 °С в течение 10 с).

Выбор и оптимизация концентрации ВКО. В диагностике болезней, вызываемых РНК-содержащими вирусами (гепатит С, синдром приобретенного иммунодефицита человека и т. д.), в качестве ВКО используется бактериофаг МS2. Фаг семейства Leviviridae представляет собой небольшой вирион с икосаэдрическим типом симметрии, патогенный для Escherichia coli. Геном представлен 3569 нуклеотидами одноцепочечной РНК [20]. Основаниями для выбора MS2 как ВКО являются РНК-геном и безвредность для людей, животных, растений [21].

С целью определения достаточной концентрации ВКО для добавления в систему экстракции РНК проведено тестирование образцов интактной культуры клеток ТС, 10%-й суспензии селезенки зараженных эпизоотическим штаммом возбудителя и свободных от КЧС свиней, культурального вируса КЧС штамма «719» и ОКО с различным содержанием бактериофага MS2 в пробе (табл. 1).

В результате оптимальное количество ВКО составило 3,2 × 10³ БОЕ бактериофага MS2 на 100 мкл пробы. В ходе оценки хранения суспензии MS2 с рекомендуемым титром при температуре +4 °С выяснили, что через шесть месяцев данный материал в ОТ-ПЦР-РВ имел стабильный пороговый цикл амплификации (Ct) с изменениями ± 2 Ct. При проведении пяти циклов заморозки материала при –20 °С и оттаивания при комнатной температуре Ct оставался стабильным.

Оценка правильности, сходимости и воспроизводимости. В результате исследования установлены 100%-е показатели правильности, сходимости и воспроизводимости валидируемого метода, так как заведомо положительный на наличие вируса КЧС штамма «719» образец в 6 повторяемых реакциях, в 3 параллельных испытаниях в течение дня одним исследователем и в 3 параллельных испытаниях в течение 3 дней двумя исследователями показал положительные результаты (табл. 2).

Однако, как обозначено на графике (рис. 2), на третий день испытания одного и того же образца значение Ct увеличивалось на 3,09 ± 0,81 в сравнении со вторым днем у обоих исследователей, что может быть связано с многократным замораживанием и оттаиванием вируссодержащего материала.

Определение аналитической чувствительности. Установлен средний показатель минимального титра вируса КЧС, детектируемого ОТ-ПЦР-РВ в 0,23 lg ККИД₅₀/см³ для штаммов «719», «684» и «Ши-мынь».

Как представлено в таблице 3, сравнительный анализ параллельных исследований штаммов вируса разными тест-системами на основе ОТ-ПЦР-РВ показал, что предел детекции штамма «684» разработанным методом был на 1,2 lg выше, чем у тест-систем № х1 и х2, а предел детекции референтного штамма «Ши-мынь» был на 2,0 lg выше, чем у тест-системы № х2. При исследовании образца штамма «719» с титром 7,5 lg ККИД₅₀/см³ валидируемым методом получены положительные результаты, в то время как параллельное испытание образца тест-системами № х1 и х2 приводило к сомнительным результатам.

С учетом всех полученных результатов Ct (n = 3) и 10-кратного разведения образца штамма вируса КЧС «719» построен график корреляции (рис. 3).

С помощью корреляционного анализа вычислены высокие статистические параметры, а именно: эффективность реакции Е = 105%, коэффициент адекватности R² = 0,9928 и критерий значимости p value < 0,0001, что обуславливает перспективность использования ОТ-ПЦР-РВ в дальнейшей разработке количественной ПЦР со стандартными образцами.

Оценка аналитической специфичности. Образцы, содержащие геном гетерологичных вирусов и бактерий (возбудителей АЧС, болезни Ауески, РРСС, рожи свиней и ВД КРС), показали в ОТ-ПЦР-РВ отрицательный результат, а образцы, содержащие штаммы вируса КЧС, – положительный результат на наличие РНК вируса КЧС, соответственно аналитическая специфичность равна 100% (табл. 4).

Установлено, что при высоком показателе Ct на канале Green (геном вируса КЧС) возможна ингибиция амплификации фрагмента ВКО, что может быть связано с расходованием компонентов реакционной смеси (дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, ДНК-полимеразы и др.) на синтез целевого ПЦР-продукта с большим числом копий матрицы [20]. Это обстоятельство необходимо учитывать при интерпретации результатов.

Определение диагностической чувствительности и специфичности. Все 27 истинно положительных образцов, содержащих вирус КЧС и полученных от экспериментально инфицированных эпизоотическим штаммом свиней, а также пробы контаминированного инфицированными животными корма в ОТ-ПЦР-РВ продемонстрировали положительный результат на наличие генома вируса КЧС. Аналогично все 27 истинно отрицательных проб показали отсутствие РНК вируса КЧС (рис. 4).

Таким образом, при проведении испытаний показатели диагностической чувствительности и специфичности представленного метода были максимально возможными и составили 100%. При этом положительный образец крови, полученный от экспериментально инфицированных эпизоотическим штаммом свиней, а также положительный образец корма, отобранный в виварном комплексе, где содержались экспериментально зараженные тем же штаммом свиньи, тест-системой № х2 на основе ОТ-ПЦР-РВ выявлены не были, при этом данная проба крови не была выявлена и тест-системой № х1, что указывает на более низкую диагностическую чувствительность (92,6% для тест-системы № х2 и 96,3% для тест-системы № х1), чем у валидируемого метода.

Анализ и интерпретация результатов. Рекомендуемые параметры ПЦР-анализа для каналов Green и Crimson тождественны: установка динамического фона, корректировки уклона, устранения выбросов на 10%, линейная шкала и пороговое значение, которое составляет 0,05. Результаты интерпретируются на основании наличия или отсутствия пересечения стандартной кривой с установленной пороговой линией, что соответствует наличию или отсутствию значения Ct в соответствующей графе таблицы результатов (рис. 5).

Также с целью установления параметров ПЦР-анализа и определения максимального Ct, при котором образец может интерпретироваться как положительный, проведено исследование двукратного разведения РНК, экстрагированной из суспензии вируса КЧС штамма «719» с итоговым титром 7,5 lg ККИД₅₀/см³ (табл. 5).

Полученные данные показали, что максимальное значение Ct составило 27,83, что эквивалентно титру вируса КЧС штамма «719» 0,23 lg ККИД₅₀/см³.

Результат считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей реакции.

Образец считается положительным на наличие генома вируса КЧС, если значение Ct на канале Green не превышает 28. Результат в таком случае является валидным вне зависимости показателей на канале Crimson.

Отрицательный результат на наличие генома вируса КЧС интерпретируют, если значение Ct на канале Green отсутствует, но на канале Crimson Ct не превышает 31.

Сомнительным является результат ПЦР при условии превышения 28 значения Ct на канале Green при значении Ct на канале Crimson менее 31.

При отсутствии значений Ct на каналах Green и Crimson, а также при превышении Ct более 31 на Crimson результат ПЦР является невалидным.

В случае сомнительного или невалидного результата необходимо провести повторное исследование пробы начиная с этапа выделения РНК с целью подтвердить или опровергнуть наличие генома вируса КЧС в данном образце.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанный метод обладает высокими валидационными характеристиками: 100%-ми показателями правильности, сходимости, воспроизводимости, аналитической специфичности, диагностической чувствительности и специфичности, пределом детекции 0,23 lg ККИД₅₀/см³. Такие параметры делают предложенный метод ОТ-ПЦР-РВ конкурентоспособным на отечественном рынке диагностикумов и пригодным для использования в широкомасштабном мониторинге эпизоотической ситуации по КЧС в России.