Применение иммуноферментного анализа в послеубойной диагностике лейкоза крупного рогатого скота

ВВЕДЕНИЕ

Энзоотический лейкоз крупного рогатого скота (ЭЛКРС) имеет широкое распространение во многих странах мира, в том числе и в Российской Федерации. Источником возбудителя являются инфицированные вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) животные на всех стадиях болезни [1][2][3]. Особенностью заболевания является то, что в организме животного оно протекает в основном в хронической форме, без клинических симптомов и характеризуется безудержным ростом неопластических клеток крови, которые путем малигнизации и пролиферации поражают практически все органы животного [4][5][6]. От начала попадания ВЛКРС в организм животного до проявления клинической картины лейкоза проходит несколько стадий:

1) инкубационный период (длится от 8 до 20 дней);

2) бессимптомное вирусоносительство (серопозитивные животные);

3) гематологическая (меняется состав форменных элементов крови);

4) клиническая (опухолевая).

На всех стадиях (кроме инкубационного периода) в организме животного вырабатываются антитела к антигену ВЛКРС, что прижизненно диагностируется существующими серологическими методами: реакция иммунодиффузии (РИД), иммуноферментный анализ (ИФА) и др. Помимо серологических, в прижизненной диагностике ЭЛКРС существуют и другие методы: клинический, цитоморфологический, гематологический, биопроба на животных (в основном на овцах) и др. [7][8][9][10][11][12][13]. Также в условиях лаборатории применяется полимеразная цепная реакция (ПЦР) [14][15].

Послеубойный диагноз на ЭЛКРС ставится на основании результатов исследований биологического материала, полученного от вынужденно убитых или павших животных, выполненных патоморфологическим, гистологическим и молекулярно-генетическим (ПЦР) методами. При проведении патоморфологического исследования туш и органов вынужденно убитых или павших животных при наличии патологического процесса выявляют лейкозные (опухолевые) разрастания, увеличение лимфатических узлов, изменения величины внутренних органов и консистенции их ткани. При различных формах вирусного лейкоза крупного рогатого скота наблюдаются свои патологические изменения в органах и различных системах организма. Например, при лимфоидной, недифференцированной и миелоидной формах заболевания лимфатические узлы увеличены, на разрезе они серо-белого цвета, сочные и саловидные, также бывает увеличена в размере селезенка. При миелоидной форме лейкоза пульпа селезенки красно-малинового цвета, ткань органа рыхлой консистенции с кровоизлияниями. При гематосаркоме (в частности, лимфогранулематозе) селезенка бывает увеличена примерно у 50% животных. При любых формах лейкоза крупного рогатого скота отмечают очаговые (диффузные) разрастания серо-розового или серо-белого цвета в органах (почках, печени, скелетной мускулатуре и др.) в случае их поражения. При неполной картине патоморфологических изменений проводятся гистологические исследования, для этого готовят срезы кусочков органов (костного мозга, селезенки, лимфатических узлов и др.) и тканей мышц (соединительной, мышечной и др.) убойного животного по предусмотренной методике. Основными недостатками патоморфологического и гистологического методов является то, что с их помощью невозможно выявить серопозитивных к ВЛКРС животных на ранней стадии, а для проведения гистологических исследований и последующей послеубойной постановки диагноза на лейкоз крупного рогатого скота требуется определенное время (3–4 сут), что может повлиять на качество исследуемого мяса и субпродуктов [16][17].

Большое значение в послеубойной диагностике имеет молекулярно-генетический метод. ПЦР применяют при неполной патолого-анатомической картине, которая затрудняет постановку диагноза. Данный метод позволяет выявить в тканях органов и мышцах животного ДНК провируса ВЛКРС, который встроен в геном клетки хозяина. В то же время ПЦР имеет ряд недостатков: высокая стоимость исследований, необходимость соблюдать температурные параметры внешней среды, неспецифические реакции и др.

В исследованиях, проведенных ранее, был применен серологический способ послеубойной диагностики лейкоза крупного рогатого скота. С помощью РИД выявлялись антитела к антигену ВЛКРС в мышечно-тканевой жидкости (в плазме и лимфе), полученной из туш и субпродуктов послеубойных животных [18][19]. Несмотря на существенные преимущества предложенного метода послеубойной диагностики (низкая стоимость набора, легкость в постановке реакции и т. д.), он имеет немало недостатков. К ним относятся: сроки постановки РИД (учет реакции проводится только через 48 ч), низкая чувствительность реакции, вероятность получения сомнительных результатов реакции (возникновение перекрестных реакций) [20].

Исходя из вышеизложенного, была поставлена цель: применение нового метода (способа) послеубойной диагностики лейкоза крупного рогатого скота с использованием иммуноферментного анализа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Основным материалом для проведения исследований на лейкоз крупного рогатого скота послужили пробы с туш и субпродуктов убойных животных (83 шт.), отобранных на Махачкалинском универсальном рынке № 2. На основании ветеринарных справок (из ветеринарного участка) 12 гол. из числа исследованных после убоя животных были прижизненно серонегативными к ВЛКРС, а 71 гол. прижизненно не исследовали на лейкоз крупного рогатого скота с применением РИД, ИФА и т. д.

Для диагностических исследований с различных частей туш и органов отбирались смывы. Для взятия проб были использованы стерильные скальпели, вата, пробирки с колпачком объемом 5 мл. Из стерильной ваты делались маленькие тампоны, с помощью которых из надрезов туш и органов послеубойных животных производили взятие смывов. Затем полученные тампоны со смывами помещали в одноразовые пробирки, в обязательном порядке промаркированные, и готовили сопроводительные документы для транспортировки, где указывали время и место взятия пробы, дату, номер и другую информацию. В исследовательской лаборатории в пробирки со смывами в зависимости от размера тампона добавляли от 0,1 до 0,2 мл дистиллированной воды (или изотонического раствора – 0,85%-го раствора NaCl), оставляли на 1,5–2,0 ч при комнатной температуре (22–26 °С) и периодически встряхивали. Полученный однородный субстрат из пробирки использовали для проведения ИФА в соответствии с инструкцией по применению набора для выявления антител к ВЛКРС (ООО «Ветбиохим», Россия).

Взятие смывов с туш и внутренних органов (субпродуктов) послеубойных животных проводилось согласно приказу Минсельхоза России от 28.04.2022 № 269 «Об утверждении Ветеринарных правил убоя животных и Ветеринарных правил назначения и проведения ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и продуктов убоя (промысла) животных, предназначенных для переработки и (или) реализации»¹, а серологические исследования – согласно «Методическим указаниям по диагностике лейкоза крупного рогатого скота», утвержденным Департаментом ветеринарии МСХ РФ 23.08.2000 № 1372/2130².

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При исследовании методом ИФА 71 пробы, полученной от прижизненно не исследованного на лейкоз крупного рогатого скота, в 75 лунок стрипованного планшета (96-луночная микропанель с адсорбированным в лунках специфическим антигеном gp51 ВЛКРС) вносили по 100 мкл буфера для разведения образцов. В 4 из 75 лунок добавили по 4 мкл контрольных сывороток (К⁺ и К^–) в 2 повторах, а в остальные (71 лунка) – также по 4 мкл испытуемого однородного субстрата (смыв с тканевой жидкостью, диффундированной дистиллированной водой), после чего содержимое лунок тщательно перемешивали, планшет накрывали липкой пленкой и инкубировали в течение 1 ч в термостате при температуре 37 °С. После часа инкубации планшет 3 раза промывали заранее подготовленным рабочим фосфатно-солевым буферным раствором, содержащим твин-20, доверху заполняя лунки вручную (по 300 мкл на лунку). После этого находящуюся жидкость в лунках удаляли, а планшет подсушивали постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге. В дальнейшем в лунки микропанели вносили по 100 мкл раствора конъюгата (моноклональные антитела к lgG крупного рогатого скота, меченные пероксидазой), накрывали липкой пленкой и инкубировали в термостате при температуре 37 °С в течение 1 ч. Затем лунки микропанели промывали 3 раза фосфатно-солевым буферным раствором с твин-20 (по 300 мкл на лунку) и подсушивали планшет постукиванием по сложенной фильтровальной бумаге. После этого в лунки вносили по 100 мкл раствора тетраметилбензидина, содержащего перекись водорода, и выдерживали 10 мин в темном месте при комнатной температуре (22 °С). Останавливали реакцию путем добавления в каждую лунку по 50 мкл стоп-раствора (1 N H₂SO₄). Учет результатов ИФА проводили посредством измерения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 450 нм.

Итоговую оценку результатов анализа производили, определяя среднее значение оптической плотности (ОП) отрицательного и положительного контролей. Относительное содержание антител к ВЛКРС, выраженное в международных ИФА-единицах (EU), в отрицательном контроле (К^–) и испытуемых образцах вычисляли по формуле:

В результате проведенных лабораторных исследований 71 пробы однородного субстрата (смыва) с применением ИФА в 6 (8,5%) из них были выявлены специфические антитела к антигену gp51 ВЛКРС.

Аналогичным образом анализировали 12 проб с туш и субпродуктов убойных животных, прижизненно серонегативных к ВЛКРС при исследовании в РИД (контрольные образцы). Все пробы в ИФА дали отрицательный результат.

На следующем этапе провели сравнительный анализ исследованных в ИФА образцов (71 проба) методом РИД, в результате чего в 3 (4,2%) пробах (смывах) были выявлены антитела к антигену ВЛКРС. В таблице отражены результаты послеубойной диагностики лейкоза крупного рогатого скота с применением РИД и ИФА, которые демонстрируют, что иммуноферментный анализ обладает большей чувствительностью по сравнению с реакцией иммунодиффузии.

Таким образом, метод ИФА позволяет выявлять специфические антитела, содержащиеся в тканевой жидкости (в плазме и лимфе), к антигену gp51 ВЛКРС, что упрощает и может ускорить послеубойную диагностику лейкоза крупного рогатого скота.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных послеубойных исследований проб (смывов) с туш и субпродуктов животных на выявление антител к антигену ВЛКРС, содержащихся в тканевой жидкости (в плазме и лимфе), лейкоз крупного рогатого скота методом ИФА был диагностирован в 6 (8,5%) случаях из 71, а с помощью РИД – в 3 (4,2%) случаях из 71. Контрольными образцами служили 12 проб смывов, отобранных с туш и органов животных, прижизненно РИД-отрицательных к ВЛКРС, которые в послеубойной диагностике с применением ИФА также дали отрицательный результат.

Таким образом, проведенные послеубойные исследования с применением ИФА показали, что данная тест-система применима в диагностике лейкоза крупного рогатого скота наряду с общепринятыми методами (патолого-анатомическим, гистологическим и др.) [21].