Конструирование прокариотической системы экспрессии фрагмента гена ORF-2 цирковируса свиней 2-го типа

ВВЕДЕНИЕ

Цирковирусные болезни свиней на сегодняшний день являются одной из наиболее значимых проблем свиноводства в экономически развитых странах. Цирковирус свиней 2-го типа (ЦВС-2) считается основным этиологическим агентом синдрома мультисистемного послеотъемного истощения (СМПИ, PMWS – postweaning multisystemic wasting syndrome) поросят, а также встречается при синдроме дерматита и нефропатии свиней, респираторном симптомокомплексе и инфекционном врожденном треморе поросят [1]. Цирковирусные болезни у свиней могут проявляться в виде субклинической и клинической инфекций, при этом субинфекция является наиболее распространенной формой инфекционного процесса, вызываемого ЦВС-2, и выражается в потере среднесуточного прироста массы тела без специфических клинических признаков [2]. Системное заболевание поражает поросят преимущественно в возрасте 6–15 недель и характеризуется анорексией, диспептическими явлениями и лимфаденопатией [3]. Случаи массовой заболеваемости свиней цирковирусными инфекциями зарегистрированы в большинстве регионов мира, что влечет за собой серьезные экономические последствия для свиноводческой отрасли [4-7].

Цирковирус свиней 2-го типа, относящийся к роду Circovirus семейства Circoviridae, представляет собой мелкий икосаэдрический безоболочечный ДНК-содержащий вирус с кольцевым геномом длиной 1766–1768 п. н. [8]. Известно о существовании 4 типов ЦВС, обладающих высокой нуклеотидной идентичностью (68–76%) и схожей геномной организацией [9][10]. Геномная ДНК ЦВС-2 состоит из нескольких открытых рамок считывания, кодирующих основные вирусные протеины – ORF-1 (репликативный протеин), ORF-2 (капсидный протеин), ORF-3 (апоптотический протеин), ORF-4 (ингибитор апоптоза) [11]. Наибольший интерес с точки зрения разработки средств специфической профилактики и диагностики заболеваний, вызванных ЦВС-2, представляет ORF-2, кодирующий капсидный протеин молекулярной массой ≈30 кДа [12]. На сегодняшний день идентифицировано 5 основных генотипов ЦВС-2: 2a, 2b, 2c, 2d, 2e; в течение последних 20 лет доминирующими в разных регионах мира являлись генотипы 2a, 2b и 2d [13].

Известно, что оптимальный профилактический эффект в отношении цирковирусных болезней свиней достигается за счет проведения комплекса ветеринарно-санитарных мероприятий в сочетании с вакцинацией. В настоящее время российский рынок вакцин против цирковирусной инфекции, обусловленной ЦВС-2, представлен цельновирионной инактивированной вакциной «Циркостоп» (ФКП «Щелковский биокомбинат») и рекомбинантной вакциной на основе белка ORF-2, полученного в бакуловирусной системе экспрессии, «ВЕРРЕС-ЦИРКО» (ООО «Ветбиохим») [14]. Однако, учитывая высокую эволюционную изменчивость ЦВС-2, способствующую потенциальному появлению различных генотипов и штаммов [15], можно утверждать, что вопрос разработки новых кандидатных рекомбинантных вакцин, обеспечивающих перекрестную защиту от штаммов разных генотипов, остается дискутабельным. Анализ существующих в мире коммерческих вакцин показал, что успешно применяются преимущественно препараты на основе рекомбинантного белка Cap, полученного в бакуловирусной системе экспрессии. Однако применение данной эукариотической системы зачастую является трудоемким и дорогостоящим [16], в связи с чем весьма актуальным является получение вакцинного белка при помощи других инструментов экспрессии.

Целями настоящего исследования явились конструирование прокариотической системы экспрессии фрагмента гена ORF-2 ЦВС-2 и оценка ее функциональности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы и плазмиды. Для формирования консенсусной последовательности фрагмента гена ORF-2 использовали нуклеотидные последовательности геномов эпизоотически значимых штаммов и изолятов ЦВС-2 генотипов 2a, 2b и 2d, депонированные в базе данных GenBank Национального центра биотехнологической информации (NCBI), а именно:

– генотип 2а: IAF2897 (ID AF408635.1), ID AY094619.1, DE99/2014 (ID MW262923.1), AUT-1 (ID AY424401.1), SPA1 (ID AF201308.1), 212 (ID AY256455.1);

– генотип 2b: QZ0401 (ID AY691169.1), NL_Control_1 (ID AY484407.1), 24657 NL (ID AF201897.1), n10eu (ID DQ629116.1), ADDLPP 10069 (ID EU594437.1), DE1054/2014 (ID MW262924.1), AUT5 (ID AY424405.1);

– генотип 2d: 28031_Mantova_32_13/12/2013 (ID KP231140.1), Uy99 (ID KP867050.1), BDH (ID HM038017.1), DE222-13 (ID KP698398.1).

Для клонирования целевого гена использовали экспрессионный вектор pET-22b(+) (Novagen, Германия), для экспрессии – штамм Escherichia coli Rosetta 2(DE3): F-ompT hsd SB (rB- mB-) gal dcm (DE3) pRARE2 (CamR) (Novagen, Германия), любезно предоставленный канд. биол. наук Р. Ф. Хайруллиным.

Дизайн антигенной конструкции. Анализ аминокислотных последовательностей ЦВС-2 осуществляли при помощи ресурсов The Immune Epitope Database (IEDB, США), при этом основным критерием выбора фрагмента для экспрессии служила плотность расположения B-клеточных эпитопов. Поиск гомологичных аминокислотных последовательностей эпизоотически значимых штаммов и изолятов ЦВС-2 осуществляли при помощи BLAST-анализа. Прогнозирование основных физико-химических свойств укороченного гена ORF-2 проводили c использованием ресурса Peptide Property Calculator (Innovagen AB, Швеция), гомологическое моделирование трехмерной белковой структуры – веб-сервера SWISS-MODEL (SIB, Швейцария). Укороченная последовательность гена ORF-2 (276–699 п. н.) была оптимизирована по кодонам для экспрессии в E. coli без изменения аминокислотного состава и синтезирована на аутсорсе (ЗАО «Евроген», Россия), после чего клонирована в вектор pET-22b по сайтам рестрикции BamHI и EcoRI. Наличие целевого гена в векторе было подтверждено секвенированием. Трансформацию клеток штамма-реципиента осуществляли методом теплового шока с дальнейшей селекцией на агаризованной среде с добавлением антибиотиков (200 мкг/мл ампициллина, 34 мкг/мл хлорамфеникола).

Экспрессия rORF-2. Для индукции экспрессии целевого гена клетки штамма E. coli Rosetta 2(DE3)/pET-22b/ORF-2 культивировали в питательной среде Лурия – Бертани, содержащей ампициллин и хлорамфеникол, на термошейкере ES-20 (Biosan, Латвия) при температуре +37 °С и 180 rpm до достижения оптической плотности (ОП) 0,7 единиц. Экспрессию гена индуцировали добавлением изопропил-β-D-1-тио- галактопиранозида – ИПТГ (Promega, США) в концентрации 1 мМ, после чего культивировали клетки в течение 5–6 ч. Клеточные лизаты получали путем механической дезинтеграции биомассы в L-буфере (50 мМ трис-HCl, рН 8,0; 0,3% KCl; 2 мМ PMSF); первичную очистку целевого продукта осуществляли при помощи набора для экстракции бактериального белка «НЭББ-10» (ООО «Диаэм», Россия). Концентрацию белка определяли методом M. Bradford [17]. Наличие зрелого рекомбинантного белка rCap устанавливали в аналитическом disc-электрофорезе клеточных лизатов в 15%-м полиакриламидном геле с окраской Кумасси G250.

Непрямой иммуноферментный анализ. Серологическую активность rCap оценивали в непрямом иммуноферментном анализе (нИФА). Для этого из сыворотки крови, полученной путем гипериммунизации свиней ЦВС-2 (ФКП «Щелковский биокомбинат», Россия), методом одноступенчатой ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе [18] выделяли иммуноглобулины класса G, которыми сенсибилизировали поверхность полистироловых иммунологических планшетов средней сорбции (Corning, США) в концентрации 50 нг на лунку и инкубировали в течение 16 ч при температуре +4 °С. После трехкратной отмывки фосфатно-буферным раствором с твином (ФБР-Т) в лунки вносили клеточные лизаты в разведении 1:10 на ФБР и инкубировали в течение 1 ч при температуре +37 °С. В качестве отрицательного контроля использовали лизат клеток, трансформированных плазмидой pET-22b без вставки, гетерологичного контроля – рекомбинантный антиген Е2 вируса классической чумы свиней, полученный в аналогичной системе экспрессии. После отмывки вносили специфический пероксидазный конъюгат, полученный по модифицированной методике P. K. Nakane and A. Kawaoi [19], в концентрации 20 нг на лунку и инкубировали аналогично предыдущему шагу. После пятикратной отмывки вносили субстрат – тетраметиленбензидин (ТМБ) и инкубировали планшет в темноте при комнатной температуре в течение 15–20 мин. Учет результатов проводили после внесения стоп-раствора (0,2 М раствора серной кислоты) на планшетном ридере Model 680 (Bio-Rad, США) при длине волны 450 нм. Значения ОП интерпретировали полуколичественно с указанием коэффициента позитивности (отношения ОП опытного образца к пороговому значению), вычисленного по минимальному оптическому сигналу образцов, отобранных на стадии пост-индукции. Анализ данных проводили при помощи пакета программ Statistica 7.0 (StatSoft, США) по критерию Манна – Уитни с поправкой на множественное сравнение. За пороговое значение статистически значимых отличий принимали p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате биоинформатического анализа было выявлено, что наибольший интерес для дизайна антигенной композиции в структуре белка Cap представляет фрагмент с 92 по 233 а. о., так как он характеризуется наиболее высокой плотностью расположения типоспецифических эпитопов. Более того, иммуногенный потенциал разных доменов данного фрагмента был ранее подтвержден рядом исследователей (табл.).

Таким образом, модифицированный фрагмент укороченной аминокислотной последовательности Cap содержит основные значимые эпитопы, являющиеся мишенями для серологической диагностики. По результатам прогнозирования физико-химических свойств данного мультиэпитопного полипептида было установлено, что он обладает молекулярной массой 17,8 кДа, хорошей растворимостью и оптимальным периодом полураспада (более 20 ч) in vivo для E. coli.

На следующем этапе исследований сконструировали экспрессионный вектор pET-22b/ORF-2, которым были трансформированы клетки E. coli Rosetta 2(DE3), после чего отработали условия культивирования штамма-продуцента. Так, был испытан диапазон значений ОП культуры до индукции (от 0,5 до 1,0 ОЕ), концентрации вносимого ИПТГ (от 0,2 до 2,0 мМ), времени (от 2 до 6 ч) и температуры (от +25 до +37 °С) культивирования индуцированных клеток. В результате исследования полипептидных профилей клеточных лизатов, соответствующих каждому режиму культивирования, было установлено, что оптимальными параметрами являются: ОП культуры до индукции – 0,6 ОЕ, концентрация ИПТГ – 1 мМ, условия культивирования пост-индукции – 6–7 ч при температуре +37 °С. Данный режим культивирования позволяет достичь выхода рекомбинантного продукта на уровне 35–40 мг/л, что составляет 1,75–2% от общего объема биомассы продуцента.

Серологическая активность и специфичность rCap была подтверждена в нИФА. Так, ОП суммарного белкового препарата составила (1,065 ± 0,144) ОЕ, коэффициент позитивности – 4,34 (p < 0,005). Основные характеристики прокариотической системы экспрессии rCap представлены на рисунке.

Представленные данные подтверждают функциональность разработанной системы экспрессии, что открывает перспективу для использования полученного rCap как в диагностических, так и профилактических целях.

Возможность успешного применения коли-экспрессии для получения компонентов вакцин против цирковирусной инфекции, вызванной ЦВС-2, задокументирована некоторыми исследователями. К примеру, X. Xi et al. сообщают, что полноразмерный растворимый Cap при экспрессии в E. coli при нейтральном рН самоорганизуется в гомогенную вирусоподобную частицу (VLP), по размерам соответствующую интактному ЦВС-2 и демонстрирующую протективный эффект in vivo, сопоставимый с таковым коммерческих вакцин [26]. Особый интерес представляет экспрессия Cap, слитого с различными модифицированными бактериальными белками. В частности, имеются сведения о том, что рекомбинантный Cap, слитый с флагеллином, обеспечивал на мышиной модели достижение более высоких уровней вируснейтрализующих антител, стимулируя гуморальное и клеточное звенья иммунитета [27]. Однако сообщается и об ограничениях прокариотических систем экспрессии. Известно, что экспрессия полноразмерного Cap возможна только в тех штаммах E. coli, которые содержат плазмиды, несущие гены тРНК редких для E. coli кодонов (pRARE). Более того, зачастую продукт экспрессии не поддается очистке в нативных и денатурирующих условиях, что требует дополнительной оптимизации вставки [28].

Несмотря на то что в представленном исследовании удалось достичь приемлемых уровней синтеза укороченного rCap и подтвердить специфичность продукта, ключевую роль в масштабировании производства вакцинного белка будет играть разработка экономичного и эффективного способа его очистки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе представленной работы была сконструирована прокариотическая система экспрессии фрагмента гена ORF-2 ЦВС-2, содержащего наиболее значимые иммуногенные эпитопы капсидного протеина. Функциональность системы экспрессии подтверждена наличием зрелого мультиэпитопного полипептида в клеточных лизатах продуцента, а также его серологической активностью в нИФА с гипериммунными к ЦВС-2 сыворотками крови свиней. На основании этих данных можно утверждать, что экспрессируемый полипептид пригоден к использованию в целях серодиагностики, а также представляет интерес в качестве основы для рекомбинантной вакцины, что является целью наших дальнейших изысканий.