Иммунные реакции у морских свинок, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, на введение амида бетулиновой кислоты

ВВЕДЕНИЕ

Вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) представляет собой онкогенный ретровирус, обладающий тропизмом к В-лимфоцитам, при поражении которых возникает хроническая инфекция, характеризующаяся либо бессимптомным носительством у подавляющего большинства особей, либо персистирующим лимфоцитозом у одной трети животных, либо развитием лимфоидных опухолей в более редких случаях [1][2][3].

Даже при наиболее часто встречающемся субклиническом течении, когда патоген можно выявить только по наличию антител и/или провирусной ДНК, отмечают определенный уровень нарушения баланса в иммунной системе, который становится причиной серьезных экономических проблем в животноводстве вследствие снижения сопротивляемости организма к оппортунистическим патогенам. В результате этого повышается риск развития инфекций вымени, особенно в критический период жизни коров [4][5], изменяется микробиота рубца и толстого отдела кишечника [6], ограничивается эффективность лечения антибактериальными, противопаразитарными средствами в том числе хронических заболеваний, а также вакцинных препаратов против других болезней животных [7][8].

Несмотря на широкое распространение лейкозной инфекции и наносимые ей существенные экономические потери, эффективные вакцины и методы лечения, направленные на элиминацию вируса, пока отсутствуют [9][10][11]. Тем не менее некоторые ученые ведут активную работу по выявлению природных химических соединений, которые могли бы эффективно противостоять ВЛКРС [12][13][14]. Полученные ими данные убедительно демонстрируют, что определенные метаболиты могут быть основой для разработки новых противолейкозных средств.

В ходе долгосрочных исследований, направленных на поиск новых препаратов с высокой антиретровирусной активностью среди природных продуктов, были также выявлены бетулиновая кислота и ее предшественник бетулин, которые, имея уникальное строение, являются перспективными натуральными метаболитами, а их синтетическая трансформация и модификация позволяют усилить биологическую активность и преодолеть резистентность микроорганизмов [15]. Отмечается, что в зависимости от химической структуры бетулиновая кислота может выступать как в качестве ингибитора проникновения вируса иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1), так и ингибитора протеазы или обратной транскриптазы ВИЧ-1 [16][17].

Структурными модификациями бетулина и бетулиновой кислоты были получены противовирусные соединения, имеющие улучшенные фармакологические характеристики. В частности, ионные соли бетулиновой кислоты, конъюгированные с глицином, замедляли клеточный метаболизм и снижали выработку онкогенного вируса лейкемии мышей в клетках фибробластов мыши [18]. Помимо этого, синтезирована серия соединений, полученных из бетулиновой кислоты и ее синтетического производного бевиримата, перспективных для разработки нового поколения ингибиторов созревания ВИЧ-1 [19][20][21].

В нашем недавнем исследовании [22] было выявлено выраженное ингибирующее действие на ВЛКРС in vitro нового амидного производного бетулиновой кислоты, содержащего в структуре фармакофорную 1-(1-адамантил) этиламинную группу, а также установлена его противовирусная активность при введении морским свинкам, экспериментально зараженным ВЛКРС.

Цель работы – изучить терапевтическую противовирусную активность и эффективность иммунных реакций на введение амида бетулиновой кислоты после экспериментального инфицирования морских свинок ВЛКРС.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводили на морских свинках линии агути (возраст 4–5 мес., масса 400–500 г) в соответствии с требованиями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и иных научных целях, и были одобрены локальным независимым этическим комитетом ФГБНУ «Омский аграрный научный центр».

Было отобрано 15 клинически здоровых морских свинок, у которых при диагностическом исследовании с помощью прямой реакции иммунофлуоресценции (РИФ) в крови не был выявлен антиген ВЛКРС, а в полимеразной цепной реакции (ПЦР) отсутствовала ДНК провируса. Всех животных разделили на 3 экспериментальные группы по 5 особей в каждой. Первую группу (n = 5) составили интактные животные (контроль). Остальным морским свинкам (n = 10) инокулировали однократно внутрибрюшинно 1 мл взвеси лимфоцитов, выделенных из крови коровы с гематологическим проявлением лейкоза (концентрация лимфоцитов в 1 мкл суспензии – 10,0 × 10⁹, титр вируса в РИФ достигал 1:2048).

После выявления положительной реакции в прямой РИФ и ПЦР на 21-е сут от начала эксперимента 5 особей (1-я группа) были подвергнуты подкожному введению амида бетулиновой кислоты в дозе 40 мкг/кг, другим 5 особям препарат не вводили, их использовали в качестве позитивного контроля (2-я группа).

Амидное производное бетулиновой кислоты было получено на кафедре органической и экологической химии ФГАОУ ВО «Тюменский государственный университет» профессором, доктором химических наук И. В. Кулаковым [22].

До введения экспериментального препарата, а также на 14-е и 28-е сут после отбирали пробы крови из ретроорбитального венозного сплетения для оценки клеточных и гуморальных реакций иммунитета, а также постановки ПЦР.

Производили подсчет количества лейкоцитов, лейкоцитарного профиля, абсолютного числа Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и цитотоксических Т-лимфоцитов с помощью реакций спонтанного, комплементарного и непрямого глобулинового розеткообразования, а также оценку спонтанной и стимулированной активности нейтрофилов в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ-тест) на фотометре с последующим определением функционального резерва как отношения стимулированной тетразолиевой активности к спонтанной [23].

Ферментную активность миелопероксидазы и содержание катионных белков нейтрофилов определяли цитохимически в соответствии с методами Грэма – Кнолля с использованием бензидина [24], и М. Г. Шубича, с бромфеноловым синим [25]. При микроскопии мазков подсчитывали процент положительно прореагировавших клеток и в соответствии со стандартными методиками рассчитывали средний цитохимический коэффициент (СЦК).

Антитела в сыворотке крови морских свинок определяли путем постановки непрямой РИФ. Титрование сыворотки проводили в 96-луночных иммунологических планшетах (с разведения 1:2 до 1:4096), используя компоненты из набора для диагностики лейкоза в реакции иммунодиффузии (антиген ВЛКРС, положительная сыворотка крови крупного рогатого скота в титре 1:2, отрицательная сыворотка крови крупного рогатого скота) производства ФКП «Курская биофабрика – фирма «БИОК» (Россия) и люминесцирующую сыворотку крови кролика против глобулинов морской свинки (ФГБУ «НИЦ эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи», Россия). Для расчета средней геометрической величины титра антител осуществляли их перевод в логарифмы с основанием 2.

Определение антигена ВЛКРС проводили в прямой РИФ, для чего готовили мазки из суспензии лимфоцитов, выделенных из крови морских свинок с помощью центрифугирования в градиенте плотности (1,077 г/см³) рентгеноконтрастного вещества тразографа, затем их окрашивали сконструированными нами диагностическими флуоресцирующими иммуноглобулинами против ВЛКРС [26]. Учет реакций прямого и непрямого метода осуществляли по четырехкрестовой системе на микроскопе Axiostar plus (Carl Zeiss, Германия). За положительный результат принимали специфическое свечение комплекса антиген – антитело с оценкой в 3–4 креста.

Провирус в крови морских свинок выявляли с применением ПЦР в реальном времени с использованием комплекта реагентов для выделения ДНК «ДНК-сорб-В» и системы «ЛЕЙКОЗ» вариант FRT50 F (ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия).

Статистическую обработку цифрового материала выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с оценкой значимости различий между группами с помощью F-критерия Фишера, а также последующим post-hoc анализом по критерию Тьюки для проведения множественных сравнений. Для оценки достоверности различий между средними геометрическими значениями титров антител применяли t-критерий Стьюдента. Различия считали достоверными при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Однофакторный дисперсионный анализ иммунологических параметров у морских свинок трех групп на 21-е сут после внутрибрюшинной инокуляции вируссодержащей суспензии позволил выявить неоднородность средних величин в содержании лимфоцитов (F = 6,3; р < 0,01), цитотоксических Т-лимфоцитов (F = 13,9; p < 0,001), СЦК катионных белков (F = 16,0; p < 0,001) и СЦК миелопероксидазы (F = 23,4; p < 0,001).

Иммунологическая перестройка к 21-м сут от начала эксперимента сопровождалась увеличением числа лейкоцитов в 1-й и 2-й опытных группах в 1,3 раза относительно контроля (табл. 1). Концентрация клеток белой крови повышалась за счет популяции лимфоцитов, которая возрастала в группах, где была предусмотрена инокуляция патогена, в 1,4 и 1,5 раза (p₁ ˂ 0,05) по сравнению с интактными животными.

Наиболее значимой трансформации была подвержена субпопуляция цитотоксических Т-лимфоцитов как в 1-й, так и в 2-й опытной группах, где их уровень в крови животных был соответственно выше в 2,7 (p₁ ˂ 0,01) и в 3,4 (p₁ ˂ 0,001) раза, чем в контрольной группе. Также было отмечено увеличение количества В-лимфоцитов в 1,5–1,65 раза, однако выраженность этих изменений по критерию Тьюки не достигала статистически достоверной разницы. В то же время абсолютное содержание Т-клеток в этих группах оставалось неизменным.

Инфицирование морских свинок ВЛКРС также сопровождалось усилением деятельности внутриклеточных бактерицидных компонентов нейтрофилов, на что указывало увеличение СЦК катионных белков и миелопероксидазы. Так, относительно контроля в 1-й опытной группе отмечен рост этих показателей соответственно в 1,8 (p₁ ˂ 0,01) и в 2,2 (p₁ ˂ 0,001) раза, а в 2-й – в 1,8 (p₁ ˂ 0,001) и в 1,95 (p₁ ˂ 0,001) раза.

Параметры функционального состояния нейтрофилов по результатам исследования в НСТ-тесте не претерпевали существенных изменений, хотя и прослеживалась некоторая тенденция к увеличению функционального резерва нейтрофилов у морских свинок, инфицированных ВЛКРС.

Следует также отметить, что по результатам исследований сыворотки крови с помощью непрямой РИФ у животных 1-й и 2-й опытных групп был выявлен приблизительно одинаковый среднегеометрический титр антител, при этом у всех без исключения особей была установлена положительная реакция как в ПЦР, так и в прямой РИФ.

Однофакторный дисперсионный анализ иммунологических параметров на 35-е сут эксперимента выявил статистически значимые различия между группами по содержанию лимфоцитов (F = 6,9; р < 0,05), В-лимфоцитов (F = 11,35; р < 0,01), цитотоксических Т-лимфоцитов (F = 7,3; р < 0,05), СЦК катионных белков (F = 55,6; р < 0,001) и СЦК миелопероксидазы (F = 17,6; р < 0,001).

У морских свинок, подвергнутых введению экспериментального препарата (1-я группа), наблюдалось незначительное увеличение численности лейкоцитов по сравнению с интактными особями (табл. 2), тогда как у животных, инфицированных ВЛКРС (2-я группа), повышение их количества было более выраженным (в 1,25 раза). Возрастание концентрации клеток белой крови в 2-й группе происходило за счет лимфоцитов, в которой их содержание было в 1,4 раза выше, чем в контроле, а также в 1,85 раза (р₂ ˂ 0,05) выше относительно морских свинок, которых после заражения обработали производным бетулиновой кислоты. Кроме того, следует отметить, что в 1-й группе, по сравнению с контрольной, отмечено снижение числа лимфоцитов в 1,3 раза, которое не достигало статистически достоверной разницы.

Количество Т-клеток в обеих опытных группах имело некоторую тенденцию к уменьшению. Более выраженная трансформация выявлена в содержании В-лимфоцитов и цитотоксических Т-лимфоцитов. Так, по сравнению с интактными, а также с особями, подвергнутыми обработке производным бетулиновой кислоты (1-я группа), у инфицированных вирусом лейкоза морских свинок 2-й группы концентрация В-клеток была увеличена в 1,7 и 4,1 (р₂ ˂ 0,01) раза, цитотоксических Т-лимфоцитов – в 2,5 (р₁ ˂ 0,05) и 3,8 (р₂ ˂ 0,05) раза соответственно. Относительно контрольной группы указанные параметры у особей 1-й группы, напротив, недостоверно снижались в 2,4 и 1,5 раза.

Введение производного бетулиновой кислоты на 35-е сут после инфицирования животных вызывало существенное усиление внутриклеточного метаболизма нейтрофилов. Так, у морских свинок 1-й группы по сравнению с особями, инфицированными вирусом бычьего лейкоза, обнаружено увеличение содержания катионных белков в 1,8 раза (р₂ < 0,001) и ферментной активности миелопероксидазы в 1,55 раза (р₂ < 0,01), а относительно контрольной группы – в 1,9 (р₁ < 0,001) и 1,7 (р₁ < 0,001) раза соответственно.

Параметры функционального состояния фагоцитов по результатам исследования спонтанной и стимулированной тетразолиевой активности не претерпевали значительных изменений. Необходимо отметить, что функциональный резерв имел более высокие значения у особей, которым инъецировали экспериментальный препарат, а более низкие – у инфицированных животных.

У морских свинок, подвергнутых обработке препаратом (1-я группа), также отмечено увеличение титра антител в 1,2 раза (р < 0,01) по сравнению с 2-й группой, где не было предусмотрено введения производного бетулиновой кислоты. По результатам исследований в прямой РИФ специфическая флуоресценция в 3–4 креста обнаруживалась у 80% животных 1-й группы и 100% особей 2-й группы, в то же время провирусная ДНК была выявлена соответственно в 40 и 100% случаев. В контрольной группе были зафиксированы отрицательные реакции в прямой РИФ и ПЦР.

Однофакторный дисперсионный анализ иммунологических показателей у морских свинок на 49-е сут от начала эксперимента, как и на 35-е сут, указывал на неоднородность между группами средних величин лимфоцитов (F = 6,85; р < 0,05), В-лимфоцитов (F = 12,3; р < 0,01), цитотоксических Т-лимфоцитов (F = 30,4; р < 0,001), СЦК катионных белков (F = 32,9; р < 0,001) и СЦК миелопероксидазы (F = 23,8; р < 0,001).

Количество лейкоцитов относительно контроля было повышенным в 1-й группе в 1,15 раза и в 2-й группе – в 1,3 раза, но у инфицированных ВЛКРС морских свинок, в отличие от особей, обработанных препаратом, это увеличение сопровождалось возрастанием концентрации лимфоцитов (табл. 3). Так, число лимфоидных клеток в 2-й группе было выше в 1,4 раза (р₁ < 0,05) по сравнению с контрольной и так же в 1,4 раза (р₂ < 0,05) по сравнению с 1-й группой.

Концентрация Т-лимфоцитов имела некоторую тенденцию к увеличению в обеих опытных группах, но более заметным оно было у морских свинок, получавших инъекцию препарата, у которых их содержание было в 1,5 раза выше, чем в контроле.

У животных, инфицированных ВЛКРС (2-я группа), на 49-е сут, так же как и на 35-е сут, наблюдалось увеличение количества В-лимфоцитов и цитотоксических Т-лимфоцитов. Так, по сравнению с интактными особями их число возрастало в 1,85 раза (р₁ < 0,05) и в 2,7 раза (р₁ < 0,001) соответственно, а относительно морских свинок, обработанных производным бетулиновой кислоты (1-я группа), – в 2,4 (р₂ < 0,01) и в 2,3 (р₂ < 0,001) раза. Следует отметить, что указанные среднестатистические параметры в 1-й группе были сопоставимы с контролем, несмотря на некоторую тенденцию к снижению концентрации В-клеток в 1,3 раза и повышению эффекторных клеток в 1,15 раза.

Активность внутриклеточных бактерицидных компонентов нейтрофилов, как и на 14-е сут после введения экспериментального препарата, находилась на более высоком уровне у животных 1-й группы. В частности, СЦК катионных белков и СЦК миелопероксидазы были выше, чем в контроле, в 2,1 раза (р₁ < 0,001), а по сравнению с 2-й группой – в 1,8 раза (р_1,2 < 0,001). В то же время у особей, инфицированных вирусом бычьего лейкоза, после всплеска метаболической функции нейтрофилов в начале эксперимента произошло снижение интенсивности антимикробной деятельности до уровня, наблюдаемого у интактных морских свинок. Параметры функционального состояния нейтрофилов по результатам постановки НСТ-теста не претерпевали статистически значимых изменений, тем не менее необходимо подчеркнуть, что у животных 2-й группы наблюдалась некоторая тенденция к снижению генерации активных форм кислорода.

Титр антител в непрямой РИФ был в 1,2 раза выше (р ˂ 0,05) у морских свинок, обработанных препаратом, по сравнению с инфицированными животными. У 100% животных 1-й и 2-й групп зарегистрировано свечение комплекса антиген – антитело в прямой РИФ, тогда как провирусная ДНК была обнаружена в 60 и 100% случаев соответственно. Все исследуемые пробы контрольной группы были негативными. Следует отметить, что отрицательный результат ПЦР был зарегистрирован у особей, являвшихся ранее носителями провируса ВЛКРС, и, наоборот, положительный – у тех, которые в предыдущий срок исследования имели негативную реакцию.

Таким образом, при инфицировании морских свинок вирусом бычьего лейкоза выявлены изменения, характеризующиеся пролиферацией цитотоксических Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и сбоем в работе бактерицидных систем нейтрофилов, описанными в других работах при лейкозной инфекции у овец и крупного рогатого скота [27][28][29], а также в ранее проведенных исследованиях на лабораторных животных [30][31]. Введение производного бетулиновой кислоты повышало
эффективность иммунных реакций, что проявлялось нормализацией концентрации цитотоксических Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, усилением деятельности внутриклеточных антимикробных систем нейтрофилов, а также повышением уровня антител. В отличие от ранее проведенного нами эксперимента, где была изучена профилактическая противовирусная активность [22], препарат не предотвращал первичное заражение морских свинок. Отрицательный результат ПЦР-анализа у отдельных особей при наличии специфической флуоресценции, вероятно, связан со снижением уровня провирусной ДНК на данном этапе развития вирусной инфекции. Непостоянное обнаружение провируса у одного и того же животного также наблюдали в своих исследованиях другие ученые при заражении кроликов [32].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании проведенных исследований можно заключить, что иммунологическая перестройка в ответ на инфицирование морских свинок вирусом бычьего лейкоза сопровождается увеличением числа лимфоидных клеток в течение всего срока наблюдения, а также гиперреактивностью бактерицидных систем нейтрофилов продолжительностью до 21 сут с последующим угнетением их метаболизма до уровня, наблюдаемого у интактных животных. Введение амидного производного бетулиновой кислоты на 21-е сут после заражения способствует нормализации численности общего числа лимфоцитов, В-лимфоцитов и цитотоксических Т-лимфоцитов, усилению функционально-метаболической активности нейтрофилов, а также стимулирует выработку антител, но не предотвращает носительство ВЛКРС. Полученные результаты позволяют предположить возможное использование экспериментального препарата в ветеринарии с целью профилактики развития клинической и гематологической формы лейкозной инфекции у животных.

Вклад авторов: Новикова Н. Н. – проведение экспериментов, подбор научной литературы, анализ полученных данных, оформление статьи; Бармина К. А. – отбор материала, проведение экспериментов, помощь в оформлении статьи; Власенко В. С. – концепция представления материалов, составление таблиц, статистическая обработка результатов, интерпретация данных и обобщение результатов исследования; Вишневский Е. А. – проведение экспериментов, помощь в оформлении статьи.

Contribution of the authors: Novikova N. N. – conducting experiments, searching for scientific literature, analysis of obtained data, paper design; Barmina K. A. – collection of samples, conducting experiments, assistance in the paper designing; Vlasenko V. S. – concept of data presentation, compilation of tables, statistical processing of the study results, interpretation of data and summarizing the study results; Vishnevsky E. A. – conducting experiments, assistance in the paper design.