Сравнительный анализ свойств масляных адъювантов компании VITAVAC в составе инактивированных вакцин против ящура

ВВЕДЕНИЕ

Ящур остается одной из наиболее опасных трансграничных вирусных инфекций сельскохозяйственных животных [1][2][3]. Особую эпизоотологическую и экономическую значимость болезнь приобретает в свиноводстве, где характеризуется высокой контагиозностью, быстрым развитием клинической картины и серьезными ограничительными мероприятиями для хозяйств [4][5]. В настоящее время опасность заноса вируса ящура на территорию Российской Федерации сохраняется.

Основным средством специфической профилактики ящура является вакцинация [11]. Эффективность и продолжительность поствакцинального иммунитета определяются не только концентрацией антигена в дозе и валентностью, но и типом применяемого адъюванта [12][13]. Адъюванты – это соединения как неорганического, так и органического происхождения, которые неспецифически стимулируют иммунный ответ к специфическим антигенам, повышая их иммуногенность в десятки раз [14][15][16].

В ветеринарной практике используются культуральные инактивированные сорбированные вакцины против ящура, в состав которых входят такие адъюванты, как гидроокись алюминия и сапонин [14][16]. При этом, несмотря на широкое применение, они имеют ряд недостатков, а именно: кратковременность формируемого иммунного ответа, что требует более частых ревакцинаций; высокая реактогенность и аллергенность по причине применения сапонина как дополнительного стимулятора иммунных реакций; недостаточно высокая эффективность в отношении свиней даже при увеличении дозы и кратности введения; отсутствие высокого уровня критериев стандартизации сапонина, что может приводить к вариабельности между сериями вакцин [17][18].

В хозяйствах против ящура применяют также культуральные инактивированные эмульсионные вакцины. Использование масляных адъювантов, входящих в состав данных вакцинных препаратов, имеет ряд преимуществ. Во-первых, обеспечивается формирование более напряженного и длительного иммунитета за счет того, что масляная фаза создает в месте инъекции долгосрочное депо антигена, из которого он медленно высвобождается. Это обеспечивает продолжительную стимуляцию иммунной системы, что приводит к более длительному сохранению высокого уровня специфических антител. Во-вторых, происходит стимуляция не только гуморального ответа (Th2-клетки), но и активация клеточно-опосредованного иммунитета (Th1-клетки), что важно для формирования комплексной защиты [19][20]. В-третьих, данные вакцины обеспечивают высокую эффективность как для крупного рогатого скота, так и, что крайне важно, для свиней, устраняя ключевой недостаток сорбированных препаратов. В-четвертых, эмульсионные вакцины безопасны и обладают низкой реактогенностью за счет высокой биосовместимости, что проявляется в отсутствии выраженных местных реакций. В-пятых, промышленно производимые масляные адъюванты имеют стабильный и стандартизированный состав, что гарантирует воспроизводимость между сериями вакцин [21][22].

Долгое время в Российской Федерации при изготовлении эмульсионных вакцин для крупного рогатого скота, свиней, коз, овец, птиц и объектов аквакультуры применялись масляные адъюванты компании Seppic (Франция) с торговым названием Montanide, которые обладали улучшенными свойствами. Однако высокая стоимость этих адъювантов являлась ограничивающим фактором в крупномасштабном производстве вакцинных препаратов для ветеринарии.

При изготовлении культуральных инактивированных эмульсионных вакцин против ящура наиболее часто применяются масляные адъюванты на основе минеральных и синтетических масел, формирующие эмульсии типа «вода в масле» (W/O) и «вода в масле в воде» (W/O/W). При этом к составу и свойствам масляных адъювантов предъявляются строгие требования: они должны обеспечивать стабильность эмульсии в процессе хранения и обращения, быть безвредными и хорошо переносимыми животными, а также стимулировать формирование необходимого уровня вируснейтрализующих антител (≥ 1,65 lg SN₅₀) [23].

Для расширения линейки применяемых адъювантов с 2023 г. ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») стал сотрудничать с предприятием VITAVAC (Индия), производящим масляные адъюванты. Были получены экспериментальные образцы VITAVAC 50, VITAVAC 70 и VITAVAC 250 для изготовления эмульсионных противоящурных вакцин. Особый интерес представляет их сравнительный анализ с широко применяемыми в мире масляными адъювантами Montanide ISA в условиях моделирования производства и испытания противоящурных вакцин.

Цель работы – провести сравнительный анализ свойств масляных адъювантов компании VITAVAC в составе инактивированных вакцин против ящура.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Масляные адъюванты. В работе использовали следующие экспериментальные образцы масляных адъювантов (VITAVAC, Индия): VITAVAC 50 (серия G-221), VITAVAC 70 (серия G-223), VITAVAC 250 (серия M-2508). Контролем служили масляные адъюванты Montanide ISA 206 VG и Montanide ISA 61 VG (Seppic, Франция).

Экспериментальные образцы вакцин. В качестве антигенов применяли культуральный инактивированный вирус ящура штаммов «SAT-1/Кения/2017» (генетическая линия SAT-1/I) и «SAT-2/LIB/39/2012» (генетическая линия SAT-2/VII/Lib-12). Вирус ящура культивировали с применением питательной ростовой среды, содержащей гидролизат белков крови и перевар по Хоттингеру. Инактивацию вируса ящура для изготовления вакцин проводили в соответствии с рекомендациями авторов, опубликованными ранее [24]. На основе указанных масляных адъювантов получали пять вариантов культуральных инактивированных эмульсионных вакцин против ящура, состав которых представлен в таблице 1.

Соотношение водной (антигенной) и масляной фаз, а также режим эмульгирования подбирали в соответствии с технологическими регламентами и рекомендациями производителей адъювантов для получения стабильных мелкодисперсных эмульсий. Масляные адъюванты VITAVAC 50 и 250 по количеству, добавляемому к антигену, являются аналогами по отношению к Montanide ISA 61 VG и ISA 206 VG. Масляный адъювант VITAVAC 70 – аналог Montanide ISA 70 VG, однако для изготовления вакцин против ящура ранее он не применялся. В данном исследовании было решено изготовить экспериментальный образец эмульсионной вакцины с добавлением VITAVAC 70, поскольку он является новым продуктом.

Исследование физико-химических свойств эмульсий. Тип эмульсии определяли методом «капельной пробы» (drop-test) путем нанесения капли препарата на поверхность воды и визуальной оценки ее распределения [23]. Динамическую вязкость измеряли на вискозиметре ротационного типа при температуре эмульсии (20 ± 2) °C.

Стабильность эмульсий определяли двумя способами. При использовании экспресс-метода образец вакцины объемом 10 см³ наливали в центрифужную пробирку, через сутки после приготовления и хранения при температуре (4 ± 2) °С подвергали центрифугированию при 3000 об/мин в течение 30 мин при температуре (20 ± 2) °С. По окончании анализировали наличие фракций, на которые может разделиться эмульсия.

Возможны следующие фракции после центрифугирования эмульсии:

А – масляная фракция;

B – опалесцирующий слой (масло с белым оттенком);

C – собственно эмульсия;

D – коалесцент (плотная эмульсия);

E – антигенная составляющая вакцины (водная фракция).

Второй метод заключался в хранении экспериментальных образцов эмульсий в течение всего срока годности вакцины (18 мес.) при температурах (4 ± 2), (20 ± 2) и (37,0 ± 0,1) °C с периодическим визуальным контролем раз в месяц на предмет расслоения и изменения консистенции.

Определение безопасности экспериментальных образцов вакцин. Для анализа реактогенности вакцин использовали 10 гол. клинически здоровых свиней массой 30–40 кг, которых иммунизировали тройной дозой вакцин (6,0 см³) внутримышечно для каждой из 5 групп образцов. Животных наблюдали в течение 10 сут после иммунизации, оценивали общее состояние, аппетит, поведение, регистрировали температуру тела и наличие реакций в месте инъекции.

Исследование гуморального иммунитета. В работе использовали 20 клинически здоровых свиней массой 30–40 кг, которых распределяли на 5 групп по 4 гол. согласно вариантам вакцин. В каждой группе животным образцы вводили в прививном объеме 2,0 см³ внутримышечно. До введения препарата и на 21-е сут после вакцинации у всех животных производили отбор крови, получали сыворотки, которые исследовали для определения уровня вируснейтрализующих антител в реакции микронейтрализации (РМН) в клеточной линии почки свиньи (IB-RS-2). В соответствии с требованиями Всемирной организации здравоохранения животных (ВОЗЖ) в РМН положительной считается сыворотка крови с титром не ниже 1,65 lg SN₅₀ [23].

Все манипуляции с животными выполняли с соблюдением этических норм и международных стандартов. Исследования одобрены комиссией по биоэтике ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Статистическую обработку данных проводили общепринятыми методами вариационной статистики с использованием статистического программного обеспечения SPSS, Microsoft Excel, Statistica. Результаты представляли в виде средних значений и их стандартных отклонений [25][26].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для сравнительного анализа масляных адъювантов были изготовлены 5 экспериментальных образцов культуральных инактивированных эмульсионных вакцин с применением: VITAVAC 50 (серия G-221), VITAVAC 70 (серия G-223), VITAVAC 250 (серия M-2508), а также Montanide ISA 206 VG и Montanide ISA 61 VG.

Исследование динамической вязкости. Образцы эмульсионных вакцин, изготовленные с использованием адъювантов компании VITAVAC, имели динамическую вязкость, сопоставимую с контрольными препаратами. При этом для эмульсий с VITAVAC отмечалось некоторое снижение вязкости (в среднем на 10–25%) по сравнению с контролем, что потенциально облегчало введение препаратов.

Следует отметить, что на этапе получения предэмульсии степень вязкости полученных с применением масляных адъювантов VITAVAC эмульсий была довольно высокой, что наблюдалось визуально при перемешивании на многофункциональном лабораторном смесителе. Как видно из таблицы 2, динамическая вязкость исследуемых образцов полученных экспериментальных эмульсионных вакцин № 1, 2, 3 составляла (0,081 ± 0,001), (0,093 ± 0,001), (0,112 ± 0,001) Па×с соответственно. Данные значения находились в пределах нормы (значения динамической вязкости для сложной эмульсии, полученной с применением масляного адъюванта Montanide ISA 206 VG, по многолетним наблюдениям специалистов ФГБУ «ВНИИЗЖ», находятся в диапазоне 0,090–0,110 Па×с; для простой обратной эмульсии с масляным адъювантом Montanide ISA 61 VG значения составляют 0,010–0,150 Па×с).

В целом при анализе готового продукта определили, что для эмульсий, изготовленных с применением опытных образцов масляных адъювантов VITAVAC 50, 70, 250, динамическая вязкость была соответственно на 25, 10 и 11% ниже по сравнению с контрольными значениями для двух типов эмульсий.

Определение типа эмульсий. Результаты «капельной пробы» подтвердили, что вакцины с VITAVAC 50 и VITAVAC 70 относятся к эмульсиям типа W/O, в то время как препараты с VITAVAC 250 и Montanide ISA 206 VG формировали эмульсии типа W/O/W (табл. 2). Это соответствовало заявленным характеристикам адъювантов и позволяло сопоставлять их между собой по типу системы.

Анализ стабильности эмульсий. Изготовленные экспериментальные образцы вакцин исследовали на стабильность эмульсий экспресс-методом. Как следует из таблицы 3, при центрифугировании опытных образцов № 1, 2 и 3 отмечали отделение небольшого количества масляной фазы (5%), что являлось приемлемым показателем для масляных эмульсий. Выделения антигенной (водной) фазы в препарате с VITAVAC 70 не наблюдалось. Вакцины, содержащие VITAVAC 50 и VITAVAC 250, характеризовались более выраженной склонностью к образованию опалесцирующего масляного слоя и частичному выделению водной фазы, что может быть связано с особенностями состава данных адъювантов.

Стабильность эмульсий также определяли при хранении изготовленных экспериментальных образцов вакцин при температурах (4 ± 2), (20 ± 2) и (37,0 ± 0,1) °C в течение 18 мес. Установили, что опытный образец № 1, изготовленный с применением масляного адъюванта VITAVAC 250, через 1 мес. хранения при температуре (4 ± 2) °С оставался в стабильном состоянии при выделении А-фазы в количестве 5%. При температуре (20 ± 2) °С отмечали расслоение на масляную составляющую (5%) и опалесцирующий слой (20%), при этом антигенная фаза не выделялась. Хранение в течение 1 мес. данной эмульсии при температуре (37,0 ± 0,1) °С вызывало отделение А- и В-фаз в том же количестве, а также дополнительно появлялась антигенная составляющая (E-фаза) в количестве 7%. Спустя 18 мес. хранения при температуре (4 ± 2) °С отмечали выделение антигенной фазы на 30%, что являлось критичным по признаку стабильности эмульсии.

При температурах (4 ± 2) и (20 ± 2) °С после окончания периода наблюдения в опытном образце № 2, содержащем масляный адъювант VITAVAC 50, отделялась масляная фракция в количестве 5%. E-фаза не выделялась. При температуре (37,0 ± 0,1) °С также отмечали появление А-фазы в количестве 5% и отделение антигенной составляющей (30%), что не являлось критичным, поскольку данная температура не предназначена для хранения вакцинного препарата.

Опытный образец № 3, содержащий масляный адъювант VITAVAC 70, спустя 18 мес. хранения при всех заявленных выше температурах сохранялся в стабильном состоянии при выделении А-фазы в количестве 5%, что абсолютно не критично. Антигенная фаза не выделялась, эмульсия сохраняла свою стабильность.

Таким образом, при длительном хранении (18 мес.) с применением различных температурных режимов наилучшими показателями стабильности эмульсии отличался препарат, содержащий VITAVAC 70: эмульсия сохраняла однородность, отделение масляной фазы не превышало ~ 5%, антигенная фаза визуально не выделялась.

Для эмульсий с VITAVAC 50 и VITAVAC 250 в ряде случаев отмечали более выраженное расслоение, включая отделение значительного объема водной фазы при повышенных температурах хранения, что может ограничивать их применение без дополнительной оптимизации технологических параметров. Масляный адъювант VITAVAC 70 в составе исследуемых вакцин против ящура, изготовленных на основе вируса серотипов SAT 1 и SAT 2, продемонстрировал оптимальное сочетание реологических свойств и стабильности эмульсии в широком диапазоне температур хранения.

Определение безопасности экспериментальных образцов вакцин. Реактогенность экспериментальных образцов вакцин, изготовленных с применением указанных выше масляных адъювантов, исследовали на свиньях, которых наблюдали в течение 10 сут после иммунизации, оценивая общее состояние, аппетит, поведение, температуру тела и наличие реакций в месте инъекции.

Во всех группах свиней после однократного введения вакцин как в стандартной, так и в тройной дозе не наблюдали формирования олеогранулем и других выраженных местных реакций в области инъекции. Температура тела животных в первые сутки после вакцинации кратковременно повышалась до (40,4 ± 0,2) °C, что расценивалось как физиологическая реакция организма на введение инактивированной вакцины и отмечалось во всех группах, включая контрольные. В дальнейшем температурные показатели снижались до физиологической нормы, поведение и аппетит животных оставались удовлетворительными (рис. 1).

Таким образом, по результатам проведенных исследований все варианты вакцин с применением масляных адъювантов VITAVAC и Montanide ISA могут быть охарактеризованы как безвредные для свиней при однократном введении.

Исследование гуморального иммунитета. Проводили сравнение уровня гуморального иммунитета свиней после введения пяти экспериментальных образцов эмульсионных вакцин, изготовленных с применением указанных выше масляных адъювантов.

Результаты исследования сывороток крови в РМН отражены в таблице 4 и на рисунке 2. Из них следует, что на 21-е сут после иммунизации свиней формирование специфических вируснейтрализующих антител к вирусу ящура штаммов «SAT-1/Кения/2017» и «SAT-2/LIB/39/2012» наблюдали во всех опытных и контрольных группах. При этом уровни вируснейтрализующих антител и их распределение по группам различались.

Введение в организм свиней эмульсионной вакцины, изготовленной с применением масляного адъюванта VITAVAC 250 (опытный образец № 1), на 21-е сут после иммунизации стимулировало выработку вируснейтрализующих антител с титрами выше пороговых значений, рекомендованных ВОЗЖ. Средние титры вируснейтрализующих антител против вируса ящура штаммов «SAT-1/Кения/2017» и «SAT-2/LIB/39/2012» составляли по (1,575 ± 0,087) lg SN₅₀, что позволяло рассматривать данный вариант как обеспечивающий удовлетворительный уровень специфической защиты. При этом значения титров вируснейтрализующих антител были ниже по сравнению с контролем № 1 для штаммов «SAT-1/Кения/2017» и «SAT-2/LIB/39/2012» в 2,3 и 1,6 раза соответственно.

Эмульсионная вакцина, содержащая масляный адъювант VITAVAC 50, обеспечивала положительный иммунный ответ, однако средние титры вируснейтрализующих антител были ниже по сравнению с эмульсионной вакциной, содержащей Montanide ISA 61 VG, и с другими вариантами вакцин с VITAVAC. Так, масляный адъювант VITAVAC 50 стимулировал выработку антител против антигена вируса ящура штаммов «SAT-1/Кения/2017» и «SAT-2/LIB/39/2012» в сравнении с контролем № 2 ниже в 3,3 и 2,8 раза; по сравнению с VITAVAC 250 – ниже в 1,4 и 1,3 раза; в сравнении с VITAVAC 70 – ниже в 2,3 и 1,9 раза соответственно.

Наибольший уровень антител у животных опытных групп выявлен в группе № 3, которую иммунизировали экспериментальным образцом вакцины, в состав которой входил масляный адъювант VITAVAC 70.

Во всех группах при введении тройной дозы эмульсионной вакцины отмечали более высокие уровни вируснейтрализующих антител по сравнению со стандартной дозой, что соответствовало общим закономерностям дозозависимой стимуляции иммунного ответа вакцинными препаратами.

Сопоставление данных по стабильности эмульсий, их безопасности и иммуногенности показало, что масляный адъювант VITAVAC 70 обладал оптимальным комплексом характеристик. При анализе культуральных инактивированных эмульсионных вакцин адъюванты VITAVAC 250 и 50 уступали продукту VITAVAC 70 по стабильности эмульсии, а также по уровню выработки вируснейтрализующих антител. Все исследуемые адъюванты позволяли получить эмульсионные вакцинные препараты с заявленным типом эмульсии, которые являлись безвредными для свиней. При этом следует отметить, что VITAVAC 250 и 50 нуждаются в дополнительной оптимизации состава и режима эмульгирования для достижения высоких показателей стабильности эмульсии и иммуногенности вакцин.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По результатам исследования физико-химических свойств экспериментальных образцов культуральных инактивированных эмульсионных вакцин, изготовленных с применением масляных адъювантов VITAVAC 50, 70 и 250 (Индия), выявлено, что наилучшие показатели стабильности при хранении в широком диапазоне температур продемонстрировала вакцина, в состав которой входил адъю-вант VITAVAC 70: при испытании не отмечено выделения антигенной фазы и значимого расслоения.

Определено, что масляные адъюванты VITAVAC 50, 70 и 250 могут быть использованы для изготовления культуральных инактивированных эмульсионных вакцин против ящура, обеспечивая формирование эмульсий с удовлетворительными реологическими характеристиками и безвредность препаратов для свиней при однократном введении тройного прививного объема вакцины.

Выявлено, что вакцины, содержащие масляные адъюванты VITAVAC 70 и VITAVAC 250, обеспечивали формирование вируснейтрализующих антител к вирусу ящура штаммов «SAT-1/Кения/2017» и «SAT-2/LIB/39/2012» с титром выше 1,65 lg SN₅₀. При этом в опытной группе с применением масляного адъюванта VITAVAC 70 титры антител в РМН были наибольшими по сравнению с другими адъювантами VITAVAC.

Установлено, что вакцина, содержащая масляный адъювант VITAVAC 50, не обеспечивала формирования вируснейтрализующих антител в достаточном количестве для защиты от ящура по сравнению с другими исследованными вариантами и, вероятно, требует доработки технологических параметров применения (концентрация, режим эмульгирования и др.).

Совокупность полученных данных позволяет рассматривать VITAVAC 70 как наиболее перспективный адъювант для использования при промышленном производстве инактивированных эмульсионных вакцин против ящура для свиней, сопоставимый по ряду показателей с традиционно применяемыми масляными адъювантами Montanide ISA 206 VG и Montanide ISA 61 VG.

Вклад авторов: Кара Д. И. – проведение исследований, анализ и интерпретация полученных данных, подготовка рисунков; Доронин М. И. – формирование идеи, формулировка и развитие ключевых целей и задач, проведение исследований, анализ и интерпретация полученных данных, подготовка и редактирование текста, принятие ответственности за все аспекты работы, целостность всех частей статьи и за ее окончательный вариант; Борисов А. В. – научное консультирование, редактирование текста статьи; Михалишин Д. В. – научное консультирование; Михалишин В. В. – научное консультирование; Гусева М. Н. – сбор статистических данных; Жбанова Т. В. – статистический анализ; Оковытая Т. В. – подготовка рисунков и редактирование текста.

Contribution of the authors: Kara D. I. – investigation, data analysis and interpretation, visualization; Doronin M. I. – conceptualization, methodology, investigation, formal analysis, writing of original draft, paper review & editing, supervision, project administration; Borisov A. V. – scientific consultation, paper editing; Mikhalishin D. V. – scientific consultation; Mikhalishin V. V. – scientific consultation; Guseva M. N. – statistical data collection; Zhbanova T. V. – statistical analysis; Okovytaya T. V. – visualization, paper editing.