Патоморфологические, бактериологические и вирусологические особенности пневмоний у обезьян, содержащихся в неволе

ВВЕДЕНИЕ

В ветеринарной практике проблема возникновения и лечения пневмоний актуальна в связи с высоким уровнем заболеваемости среди диких, домашних, сельскохозяйственных животных (кошки, собаки, крупный рогатый скот, свиньи, лошади и др.) и птиц. В основном пневмониями заболевают детеныши и молодые животные, при этом частота и тяжесть заболевания зависит от условий содержания, стресса, численности животных, их иммунного статуса, рациона питания, климата и техники производства, а также коинфекции различными патогенами [1][2][3][4][5][6][7][8][9][10][11]. У домашних животных заболеванию часто подвержены взрослые и пожилые особи [4][5][6].

Низшие обезьяны также чувствительны к большинству патогенов человека, поэтому на них легко воспроизвести в сходной форме некоторые инфекционные заболевания людей [12]. В последние десятилетия в связи с резким сокращением популяций обезьян в местах естественного обитания и запретом отлова основным источником лабораторных приматов стали питомники, осуществляющие их разведение. Животные, содержащиеся в неволе, в большинстве случаев подвержены кишечным и респираторным заболеваниям. Одно из ведущих мест в заболеваемости занимает пневмония, часто приводящая к гибели животных [13][14][15]. Пневмония развивается как самостоятельный процесс, а также встречается в виде сопутствующего (вторичного) при желудочно-кишечных заболеваниях (острые или хронические гастриты и гастроэнтероколиты) [12][16]. Кроме того, пневмония часто возникает среди особей, недавно завезенных из мест естественного обитания и проходящих акклиматизацию [17][18].

Легкие – сложная экосистема с большим числом разнообразных микроорганизмов, взаимодействующих как между собой, так и с организмом хозяина [18][19]. Существует взаимосвязь между микробиомом легких, ротоглотки и кишечника, которая влияет на развитие кишечных и легочных заболеваний (метаболические, иммунные и другие процессы). Происходит постоянная миграция микроорганизмов между ротоглоткой, верхними и нижними дыхательными путями, в связи с чем микробиом легких непрерывно изменяется. Доминирующая популяция и численность микробиома различны в здоровых и патологически измененных органах. На основании этой концепции инфекционные поражения легких рассматриваются как нарушение баланса присутствующих микробов, при этом от межмикробных взаимодействий зависит течение и исход пневмонии [19].

Важным этапом в диагностике пневмонии является выделение из дыхательного тракта и идентификация инфекционных агентов (бактерий, вирусов, грибов), принимающих участие в развитии инфекционного процесса [2][20]. По литературным данным, менее 10% случаев пневмоний описывают как полимикробные, а в более 50% случаев этиологические агенты пневмоний у обезьян являются неустановленными [19]. Наиболее частыми причинами возникновения пневмоний у обезьян разных видов, содержащихся в неволе, по сведениям из литературных источников, являются Streptococcus spp., реже – Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus и другие бактерии (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterococcus spp., Morganella morganii) [21][22][23][24][25]. Ранее сотрудниками Курчатовского комплекса медицинской приматологии (ККМП) НИЦ «Курчатовский институт» была показана причастность возбудителя парагриппа человека 3‑го типа к патологии респираторного тракта павианов анубисов [26].

Актуальность проведенной работы состоит в том, что патологии респираторного тракта в этиологической структуре заболеваний у обезьян занимают доминирующую позицию и являются одной из главных причин гибели животных в неволе.

Новизна полученных данных заключается в обобщении результатов мониторинга гибели от пневмонии обезьян, содержащихся в условиях питомника (ранее подобные исследования в России не проводились). В связи с этим представляет интерес не только выявление бактериальной микрофлоры в легких погибших животных, изучение серологических и молекулярно-генетических маркеров острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ), но также описание особенностей патологически измененных легких.

Цель исследования – изучение видовой и возрастной структуры заболеваемости обезьян пневмонией, анализ спектра легочной микрофлоры, изучение патоморфологических изменений в легочной ткани.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. В период с января 2019 по декабрь 2024 г. было изучено 1862 случая гибели обезьян разных видов от спонтанных заболеваний. Все животные содержались в питомнике ККМП НИЦ «Курчатовский институт». Погибшие самцы (n = 726) и самки (n = 1136) обезьян были в возрасте от новорожденности до 38 лет (табл. 1).

Патолого-анатомическое и микроскопическое исследования. Вскрытие тел умерших животных проводили в прозектуре лаборатории патологической анатомии ККМП. Для выявления патологических изменений исследовали внутренние органы и ткани погибших животных. При обнаружении макроскопических признаков воспаления легких образцы ткани отбирались для гистологического анализа. Образцы фиксировали в 10%-м нейтральном (рН 7,4) растворе формалина, далее проводили стандартную гистологическую обработку материала с последующей заливкой в парафиновую среду Histomix (ООО «БиоВитрум», Россия). Из полученных парафиновых блоков приготавливали гистологические срезы толщиной 4 мкм, которые окрашивали гематоксилином Ганзена (железотригематеиновый способ с квасцовым гематоксилином Ганзена / F. C. Ch. Hansen) и эозином, а также пикрофуксином по Ван Гизону (Van Gieson’s stain) [27].

Обзорный морфологический анализ (микроскопическое исследование) выполнен на биологическом микроскопе для лабораторных исследований Axiolab.A1 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия). Для микрофотографирования использовали цифровую камеру Axiocam 105 color (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Германия).

Бактериологическое исследование проводили по общепринятой методике: делали мазок-отпечаток легкого на предметном стекле, окрашивали по Граму и производили посев на диагностические питательные среды с последующей биохимической идентификацией выросших колоний микроорганизмов, как описано ранее [28].

Вирусологическое исследование. В работе использованы сыворотки крови и образцы легких от 126 обезьян, погибших с диагнозом «пневмония» в 2021–2024 гг., из них: 48 – макаки-резусы, 22 – макаки яванские, 7 – зеленые мартышки, 38 – павианы гамадрилы и 11 – павианы анубисы. Суспензию из легких готовили с помощью гомогенизатора Minilys (Bertin Technologies, Франция) в соотношении 5–6 г материала на 1 мл 0,1М Na-фосфатного буфера с pH 7,4; центрифугировали 30 мин при 3000 об/мин на холодовой центрифуге Allegra (Beckman Coulter, США) для удаления осадка. Полученный 10%‑й супернатант применяли в дальнейшем исследовании.

Для детекции антител класса IgG, IgM и IgA к вирусу парагриппа типов 1 и 3, респираторно-синцитиальному вирусу (РСВ) и аденовирусу применяли тест-системы производства АО «ЭКОлаб» (Россия). Результаты иммуноферментного анализа (ИФА) учитывали на спектрофотометре лабораторном Immunochem-2100 (High Technology Inc., США) с использованием фильтра с длиной волны 450 нм. Реактивность сывороток в отношении респираторных вирусов оценивали по значениям ОП₄₅₀ (оптическая плотность исследуемых образцов сывороток при длине волны 450 нм в ИФА). Результаты интерпретировали в соответствии с инструкциями производителя.

Выделение нуклеиновых кислот производили из полученного 10%‑го легочного супернатанта с использованием набора «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя. Комплементарные ДНК синтезировали на матрице суммарной РНК с использованием набора реагентов «Реверта-L» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Полученные кДНК амплифицировали с использованием набора ПЦР-Real Time «АмплиСенс® ОРВИ-скрин-FL» для выявления возбудителей острых респираторных вирусных инфекций (РСВ; метапневмовирус; вирус парагриппа 1, 2, 3 и 4‑го типов; коронавирус; риновирус; аденовирус групп B, C и Е; бокавирус) согласно инструкции производителя. Проведение амплификации и анализ результатов осуществляли с помощью прибора Rotor-Gene Q (QIAGEN GmbH, Германия).

Статистическая обработка данных. Статистическую обработку и подсчет данных осуществляли при помощи программы GraphPadPrism 8. Для определения изменений частотных показателей в зависимости от года исследования или возраста применяли тренд-тест на основе критерия χ² (критерий согласия Пирсона). Все различия интерпретировали как достоверные при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

По результатам патолого-анатомических исследований за шестилетний период было выявлено 865 случаев пневмонии (табл. 2), что составило 46,5% от общего числа погибших животных. Пневмонию у самцов выявляли чаще, чем у самок (52,8 и 42,4% соответственно). Смертность от заболевания у разных видов обезьян приблизительно одинаковая, за исключением павианов гамадрилов и макаков лапундеров. У этих видов обезьян пневмония явилась причиной смерти более 50% животных от общего числа погибших.

Согласно полученным данным, наиболее высокую смертность от пневмоний наблюдали у обезьян в первый месяц жизни (табл. 3).

Общее число погибших от пневмонии обезьян в среднем колеблется в диапазоне от 126 до 166 случаев в год и в процентном отношении остается приблизительно на одинаковом уровне в течение шести лет (табл. 4).

За последние шесть лет смертность обезьян первого месяца жизни неуклонно росла, и уже в 2024 г. причиной их гибели в 100% случаев явилась пневмония.

Анализируя сезонность гибели обезьян от пневмоний, отмечено, что более 50% случаев регистрировали в осенне-зимний период в 2020 и 2024 гг., а в летне-весенний – в 2023 г. В течение 2022 г. гибель животных от пневмоний была высока на протяжении всех сезонов.

Патоморфологические особенности пневмонии. У обезьян, живущих в условиях питомника, чаще регистрировали полисегментарную бронхопневмонию и намного реже – долевую фибринозную пневмонию, напоминающую крупозную пневмонию у человека. Анатомически наиболее часто патологический процесс характеризовался двусторонним поражением легких, преимущественно правого. При одностороннем поражении пневмонию чаще наблюдали только в правом легком (рис. 1).

Крупозная пневмония у обезьян характеризуется лобарным фибринозным воспалением с поражением плевры. Помимо лобарного поражения, выявляли крупнофокусные очаги пневмонии в центре долей или с выходом под плевру. Пораженная легочная ткань безвоздушная, серо-красного цвета, плотной консистенции. С поверхности разреза пораженного легкого при сдавлении отделялась мутная пенистая жидкость. Лимфатические узлы легких имели увеличенные размеры. Зарегистрированы случаи тотального поражения всех долей правого и левого легких (рис. 2), где альвеолы были заполнены преимущественно фибринозно-лейкоцитарным экссудатом с увеличением содержания серозной жидкости.

В альвеолах при крупозной пневмонии выявляли фибрин, дегенерированные лейкоциты и другие продукты клеточного распада. Встречались участки легочной ткани, содержащие в альвеолах исключительно эритроциты. Наблюдали выраженную гиперемию кровеносных сосудов с пристеночным накоплением лейкоцитов и стазы в капиллярах межальвеолярных перегородок (рис. 3).

Во всех случаях крупозной пневмонии отмечены очаги гнойного расплавления ткани, локализующиеся, как правило, вокруг пораженных бронхов. В просвете бронхов содержался гнойный экссудат и кокковая микрофлора.

Бронхопневмонии встречались как самостоятельно, так и в качестве сопутствующего заболевания, осложняющего патологии желудочно-кишечного тракта. При бронхопневмонии в легких обнаруживали множественные мелкофокусные, нередко сливающиеся очаги воспаления серо-красной или синюшно-багровой окраски, локализующиеся по ходу ветвления бронхов. Вокруг участков воспаления легочная ткань отечная, с гиперемией или выраженной эмфиземой, что придает поверхности разреза пестрый вид (рис. 4).

Микроскопическая картина воспаления, так же как при крупозной пневмонии, характеризовалась разнообразием экссудата. Наблюдали очаги ткани, содержащие в альвеолах серозную жидкость с примесью эритроцитов и полиморфный клеточный экссудат. Часто в экссудате преобладали лейкоциты и слизь с большим количеством бактериальной микрофлоры. Во всех случаях воспалительные изменения в легких сочетались с развитием очаговых ателектазов и очаговой эмфиземы (рис. 5).

Таким образом, крупозная пневмония и бронхопневмония у обезьян, содержащихся в питомнике ККМП, характеризовались разнообразием морфологических изменений в легких. По-видимому, это связано с различными свойствами возбудителей заболевания.

У большинства погибших животных отмечали бессимптомное течение пневмонии, диагноз установили лишь на вскрытии. Дифференцировать крупозную пневмонию от бронхопневмонии иногда не представлялось возможным из-за стертости симптомов. В некоторых случаях наблюдали внутрилегочные осложнения – гнойные бронхиты, лимфангоиты, очаги гнойного воспаления, крайне редко – эмпиему плевры. Регистрировали внелегочные осложнения – гнойный менингит, серозно-гнойный перикардит.

Микробный пейзаж легких. Исследование микрофлоры легких обезьян показало, что во всех мазках-отпечатках были обнаружены грамположительные кокки. В результате бактериологического исследования за шесть лет было выделено 1660 микроорганизмов, из которых большую часть составляли представители семейства Enterobacteriaceae (58,5%), грамположительная кокковая микрофлора обнаружена в 36,6% случаев, доля неферментирующих бактерий, в том числе Pseudomonas aeruginosa, была равна 1,0%, недифференцированных грамположительных палочек – 3,8% (табл. 5).

Статистический анализ показал значимые изменения в выявляемости некоторых микроорганизмов за годы исследования (p < 0,0001), что свидетельствовало о сдвигах в составе микрофлоры легких.

Количество представителей трибы Proteeae варьировало без явной тенденции к росту или снижению, что указывает на динамическое изменение роли этих микроорганизмов (p = 0,0002). Число выявлений Klebsiella spp. с годами сократилось (p = 0,0048), что может свидетельствовать об уменьшении значения данного возбудителя в развитии пневмонии. Количество случаев обнаружения Citrobacter spp. (p = 0,0344) и Bacillus spp. (p = 0,0024) варьировало в разные годы. Несмотря на высокую частоту выделения Staphylococcus spp., отмечается тенденция к заметному снижению (p < 0,0001) в последние годы (от 123 до 25). Также наблюдали сокращение случаев выявляемости грамположительных палочек (p < 0,0001). Неферментирующие грамотрицательные палочки из легких выделяли редко, однако в 2024 г. они были обнаружены в 6 случаях (p < 0,0001). Общий уровень изолированных микроорганизмов снижался с годами (от 410 в 2019 г. до 206 в 2024 г.), что было подтверждено статистическими данными (p < 0,0001).

Если рассматривать микробный пейзаж, то лидирующую позицию занимали E. coli, которые обнаружены в легких 66,1% обезьян, на втором месте – Staphylococcus spp., в том числе S. aureus (41,1%), далее – представители Proteeae (Proteus spp., Providencia spp., M. morganii) и Enterococcus spp. (34,8 и 27,5% соответственно). В редких случаях была выявлена другая микрофлора. За анализируемый период из основных бактериальных возбудителей пневмоний чаще выделяли S. aureus – у 267 обезьян (31,5%), другие обнаружены в единичных случаях, а именно: K. pneumoniae – у 19 обезьян (2,2%), Ps. aeruginosa – у 7 обезьян (0,8%), St. pneumoniae – у 5 обезьян (0,6%). В 7 случаях (0,8%) на питательных средах отсутствовал рост бактерий. Также у 17 обезьян с пневмонией не был взят материал для исследования в связи с трупным разложением. Имели место бактериальные ассоциации, однако за анализируемый период количество случаев их выявления уменьшилось. Так, в 2019 г. отмечено 89% ассоциаций, а в 2024 – 52%, при этом явно заметно снижение частоты обнаружения 4-компонентных микробных ассоциаций.

Анализируя возможную роль выделенных микроорганизмов в развитии пневмонии у обезьян, необходимо учитывать, что у большинства из них заболевание развивалось на фоне желудочно-кишечной патологии и при сниженном иммунитете. Об этом свидетельствует обнаружение представителей кишечной группы бактерий в легких, а также затяжной характер течения пневмонии с нечеткими клиническими симптомами. Исключение составляют S. aureus, так как ранее проведенные молекулярно-генетические исследования показали высокий патогенный потенциал этого возбудителя и тропность некоторых штаммов к легочной ткани [29][30].

При обследовании на наличие маркеров ОРВИ 126 обезьян, погибших в 2021–2024 гг. с диагнозом «пневмония», антитела класса G, свидетельствующие о постинфекционном иммунитете, были обнаружены к вирусу парагриппа 1‑го и 3‑го типа (14,3 и 4,0% соответственно), РСВ (1,2%), а также аденовирусу (8,7%). Антитела, указывающие на период острой инфекции (IgA, IgM), были обнаружены только к РСВ (35,3%). С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в паренхиме легких РНК/ДНК возбудителей ОРВИ обнаружено не было (табл. 6).

У погибших в 2021–2022 гг. обезьян (n = 41) антитела класса G были выявлены только к вирусу парагриппа 1‑го типа (41,5%) и аденовирусу (4,9%), а к вирусу парагриппа 3‑го типа обнаружены не были. Серологических маркеров, свидетельствующих об острой инфекции, также установлено не было.

У животных, погибших в 2023–2024 гг. с диагнозом «пневмония» (n = 85), в сыворотках крови были выявлены IgM к РСВ (35,3%), а наличие IgA к вирусу парагриппа 1‑го и 3‑го типа не установлено. Кроме того, антитела класса G, свидетельствующие о постинфекционном иммунитете, были обнаружены к вирусу парагриппа 1‑го и 3‑го типа (1,2 и 5,9% соответственно), РСВ (1,2%), а также аденовирусу (10,6%).

ВЫВОДЫ

1. Пневмония является наиболее распространенной причиной гибели обезьян в питомнике ККМП (46,5%) и часто возникает на фоне желудочно-кишечных заболеваний у ослабленных животных, что согласуется с ранее опубликованными данными.
2. Наиболее высокая смертность от пневмоний наблюдалась у детенышей в возрасте до месяца (92,9%) и первого года жизни (65,4%). Следовательно, наиболее уязвимыми к развитию пневмонии являлись содержащиеся в неволе обезьяны от рождения до 1 года.
3. Наиболее часто возникала двусторонняя полисегментарная бронхопневмония, реже – долевая фибринозная пневмония, напоминающая крупозную пневмонию у человека, с преимущественным поражением правого легкого.
4. Спектр выделенной бактериальной микрофлоры из пораженных пневмонией легких в основном составляли представители энтеробактерий (58,5%) и грамположительной кокковой микрофлоры (36,6%), при этом S. aureus был выделен в 41,1% случаев. При микроскопическом исследовании в тканях легкого также была обнаружена кокковая микрофлора.
5. Установлена циркуляция аденовируса, вируса парагриппа человека 1‑го и 3‑го типа, а также РСВ среди обезьян, погибших от пневмонии. Высокий процент IgM к РСВ свидетельствовал о возможной причастности этого вируса к патологии респираторного тракта у обезьян.

Вклад авторов: Калашникова В. А. – проведение бактериологического исследования, обработка результатов исследования, составление таблиц и диаграмм, подготовка текста, подбор и анализ литературных источников по теме; Радомская Е. Ю. – забор материала, пробоподготовка; Булгин Д. В. – подготовка текста, описание патоморфологических и микроскопических данных, фотографирование гистологических срезов; Полякова В. И. – забор материала, проведение бактериологического исследования, статистическая обработка данных; Догадов Д. И. – обработка результатов вирусологического исследования, подготовка текста, подбор и анализ литературных источников по теме; Демерчян А. В. – забор материала, проведение бактериологического исследования; Щербак Н. В. – изготовление гистологических микропрепаратов; Чуканов Д. В. – проведение патолого-анатомических вскрытий; Гончаренко А. М. – проведение иммуноферментного анализа; Миносян А. А. – постановка полимеразной цепной реакции; Аршба И. М. – проведение бактериологического исследования.

Contribution of the authors: Kalashnikova V. A. – bacteriological tests, study result processing, creation of tables and diagrams, paper text preparation, literature searching and analysis; Radomskaya E. Yu. – sampling, sample preparation; Bulgin D. V. – paper text preparation, description of postmortem and microscopic findings, histological section photographing; Polyakova V. I. – sampling, bacteriological tests, statistical processing of data; Dogadov D. I. – processing of virological test results, paper text preparation, literature searching and analysis; Demerchyan A. V. – sampling, bacteriological tests; Shcherbak N. V. – histological microslide preparation; Chukanov D. V. – necropsies; Goncharenko A. M. – ELISA-tests; Minosyan A. A. – PCR-tests; Arshba I. M. – bacteriological tests.