Антибиотикорезистентность бактериальных патогенов, циркулирующих на молочнотоварном предприятии Свердловской области

ВВЕДЕНИЕ

Нерациональное использование антимикробных препаратов (АМП) в животноводстве привело к тому, что сельскохозяйственные животные стали резервуаром устойчивых к антибиотикам бактерий. Резистентные штаммы микроорганизмов представляют угрозу не только для здоровья самих животных, но и могут попадать в организм человека с продуктами животного происхождения (мясо, яйца, молочные продукты). В настоящее время возникла необходимость разработки единой стратегии рационального применения АМП, включающей мониторинг чувствительности микроорганизмов, ротацию препаратов и использование альтернативных методов, позволяющих сократить их применение. Важными мерами также являются переход к экстенсивным системам животноводства, снижение стресса у животных и соблюдение гигиенических норм. Ученые всего мира акцентируют внимание на глобальном характере проблемы антибиотикорезистентности и важности международного сотрудничества для ее решения [1-4]. Зарубежные авторы подчеркивают необходимость скоординированных глобальных, региональных и национальных стратегий, основанных на принципах «единого здоровья» (One Health), для сокращения использования антимикробных препаратов и поиска альтернатив [5-7]. Всемирная организация здравоохранения и Всемирная организация здравоохранения животных разработали списки критически важных антибиотиков для медицины и ветеринарии, чтобы ограничить их нерациональное применение [3].

Отечественные ученые опытным путем установили, что многократное использование одних и тех же антибиотиков в лечебно-профилактических схемах как для крупного рогатого скота, так и для сельскохозяйственной птицы приводит к развитию устойчивости у патогенной микрофлоры. Это снижает эффективность препаратов, негативно влияет на продуктивность и увеличивает риски для здоровья животных [8-10].

Опыт ведущих зарубежных ученых в области медицины показывает, что периодическая смена антибиотиков может способствовать снижению риска развития резистентности к антимикробным препаратам (АМР). Ротация препаратов может существенно повышать чувствительность антибиотикорезистентных штаммов бактерий. Изменение протоколов лечения, рутинно применяемых в практической работе, способно приносить положительные результаты даже по прошествии нескольких лет. Авторы также проводили многоцентровые исследования для подтверждения этих результатов и оптимизации как частоты, так и вариантов ротации антибиотиков [11][12].

По мнению многих исследователей, для более эффективного противодействия устойчивости к АМП необходим интегрированный подход, сочетающий оптимизацию антибиотикотерапии, жесткие меры инфекционного контроля, инновационные методы (например, быстрая диагностика резистентности) и мониторинг АМР [13][14].

В современных отечественных публикациях также учитывают экологический статус территорий Российской Федерации при разработке мер по контролю АМР. Авторы говорят об усилении мониторинга радионуклидов и тяжелых металлов в кормах, а также антибиотикорезистентности на фермах в промышленных зонах с одновременным развитием адаптивных технологий животноводства для снижения стрессовой нагрузки на животных в загрязненных районах [15]. Исследователи подчеркивают необходимость широкого применения альтернативных методов, например использование вакцинации, пробиотиков, фитобиотиков, бактериофагов, бактериоцинов, ротации антибиотиков с осуществлением контроля их применения в промышленном животноводстве и птицеводстве [1, 16, 17]. Однако, несмотря на многообещающие результаты использования данных методов, большинство из них требуют дополнительных исследований, особенно в условиях конкретных сельскохозяйственных предприятий [17, 18, 19, 20].

Актуальность исследований, направленных на выявление антибиотикорезистентности у бактериальных патогенов, обусловлена сложной ситуацией в животноводстве, представляющей серьезную угрозу для здоровья как животных, так и для человека через пищевую цепь. Нерациональное использование АМП привело к появлению и распространению устойчивых штаммов микроорганизмов, что значительно снизило эффективность терапии и потребовало разработки новых подходов к лечению инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных. В условиях Свердловской области, характеризующейся развитым животноводством, проблема АМР приобретает особую значимость, что обуславливает необходимость проведения локального мониторинга и разработки персонализированных рекомендаций для конкретных предприятий.

Новизна работы заключалась в комплексном исследовании динамики микробного пейзажа и профиля резистентности возбудителей маститов в условиях реального животноводческого предприятия, расположенного на территории Свердловской области. Практическая новизна заключается в разработке и апробации алгоритма ротации АМП на основе регулярного молекулярно-генетического мониторинга, показавшего эффективность в условиях производственного стада.

Целью исследования стало определение бактериальных патогенов, вызывающих мастит у коров, с оценкой их устойчивости к АМП, применяемым на животноводческом предприятии, расположенном на территории Свердловской области, для последующей ротации таких препаратов и выдачи персонализированных рекомендаций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа проведена в рамках государственного задания Минобрнауки России «Разработка методологических подходов к мониторингу, контролю и сдерживанию антибиотикорезистентности оппортунистических микроорганизмов в животноводстве» (№ 0532–2021–0004) в отделе геномных исследований и селекции животных, в лаборатории микробиологических и молекулярно-генетических методов исследования и лаборатории биологических технологий отдела ветеринарно-лабораторной диагностики с испытательной лабораторией ФГБНУ «Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук».

Исследования включали: мониторинг циркулирующих патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, определение их чувствительности к стандартным антибиотикам и применяемым антимикробным и дезинфицирующим препаратам, определение генов резистентности, а также разработку рекомендаций по ротации АМП, применяемых в лечебных целях при воспалении молочной железы у коров, на отдельно взятом животноводческом молочнотоварном предприятии Свердловской области на протяжении 3 лет (2022, 2023, 2024 гг.).

В 2022 г. было отобрано 10 проб секрета молочной железы от коров с признаками мастита. В 2023 г. на этом же предприятии отобрано 3 объединенные пробы секрета молочной железы от 15 коров с субклиническим маститом; в 2024 г. – 16 проб.

Микробиологические исследования проводили в соответствии с «Методическими указаниями по бактериологическому исследованию молока и секрета вымени коров» (утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 30 декабря 1983 г. № 115–69)¹.

Используемые в работе питательные среды: «Основа колумбийского кровяного агара» (Bio-Rad Laboratories, Inc., Франция), дефибринированная кровь барана (ЗАО «ЭКОлаб», Россия), питательная среда для накопления сальмонелл сухая (магниевая среда), висмут-сульфит агар, агар Плоскирева, питательный агар для культивирования микроорганизмов ГРМ-агар (ФБУН «Госу- дарственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Россия), агар Сабуро с 2% глюкозы и хлорамфениколом, агар Мюллера – Хинтона (SIFIN diagnostics GmbH, Германия), триптиказо-соевый бульон с 20% глицерина (Condalab, Испания).

Идентификацию выросших колоний производили методом MALDI-ToF масс-спектрометрии (времяпролетная матрично-ассоциированная лазерная десорбционная ионизационная масс-спектрометрия) на приборе Vitek® MS (bioMérieux, Франция). Для этого бактериальную массу наносили на спот слайда, покрывали 1 мкл матрицы (α-циано-3-гидроксикоричная кислота), высушивали при комнатной температуре, далее считывали прибором масс-спектры рибосомальных белков и сравнивали с базой данных с использованием программного обеспечения MYLA® (bioMérieux, Франция).

Чувствительность к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом: по стандартной методике,описанной European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST), с использованием агара Мюллера – Хинтона (Bio-Rad Laboratories, Inc., Франция) и дисков, импрегнированных препаратами с определенной нагрузкой (Bio-Rad Laboratories, Inc., Франция). Считывание антибиотикограмм производили с помощью автоматического анализатора ADAGIO (Bio-Rad Laboratories, Inc., Франция). Интерпретацию категорий чувствительности осуществляли в соответствии с критериями EUCAST: Clinical breakpoints-bacteria (v 10.0).

Используемые в работе диски: амоксициллин/клавулановая кислота, гентамицин, окситетрациклин, тигециклин, левофлоксацин, норфлоксацин, цефепим, цефиксим, цефоперазон, цефотаксим, цефподоксим, цефтазидим, цефтриаксон, ципрофлоксацин, цефтиофур (Bio-Rad Laboratories, Inc., Франция). Микробиологические исследования также включали определение чувствительности к применяемым на предприятии при лечении мастита у коров антибактериальным препаратам (2023–2024 гг.) комбинированного типа, содержащим в своем составе антибиотики следующих групп: цефалоспорины, аминогликозиды, тетрациклины и полипептидные антибиотики.

Выделенные культуры микроорганизмов подвергали заморозке при –20 °C в пробирке с триптиказо-соевым бульоном с 20% глицерина в качестве криопротектора.

Для постановки полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) использовали наборы для выделения ДНК из биоматериала DiatomTM DNA Prep 200 (ООО «Лаборатория Изоген», Россия) и наборы реагентов для выявления ДНК возбудителей инфекций и генов резистентности к антибиотикам «РЕЗИСТОМ КОМПЛЕКС ESKAPE-V” (OOO НПФ «Литех», Россия). Амплификацию проводили в режиме реального времени с применением анализатора QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific Inc., США).

На основании результатов проведенных лабораторных исследований были разработаны индивидуальные рекомендации по антибактериальной терапии при заболеваниях молочной железы у коров. Выбор препаратов осуществляли в соответствии с методическими рекомендациями [21], обеспечивающими научно обоснованный подход к ротации антибиотиков, а также согласно приказу Минсельхоза России от 18 ноября 2021 г. № 771², регламентирующему ограничения на применение АМП в ветеринарной медицине.

Для обработки полученных данных использовали программу Microsoft Excel, входящую в пакет программ Microsoft Office Pro 19.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В 2022 г. в результате проведенных исследований с применением MALDI-ToF масс-спектрометрии в отобранном биологическом материале (10 проб секрета молочной железы от коров) были выявлены бактериальные изоляты: Streptococcus spp. (70,6% проб), Streptococcus agalactiae (23,5% проб), Staphylococcus aureus (35,3% проб), Escherichia coli (52,9% проб).

Данные по антибиотикорезистентности и наличию генов устойчивости к АМП у бактериальных патогенов, выделенных из секрета молочной железы коров, представлены в таблице 1.

При определении антибиотикорезистентности диско-диффузионным методом установлено, что все выявленные изоляты E. coli обладали устойчивостью к нескольким группам АМП (аминогликозидам, пенициллинам, тетрациклинам) и чувствительностью к цефокситину (цефалоспорин II поколения), ципрофлоксацину (фторхинолон II поколения). Выделенный из всех 10 проб S. aureus был резистентен к ципрофлоксацину, ванкомицину (гликопептидный антибиотик), тетрациклинам и чувствителен к хлорамфениколу, цефокситину, в единичных случаях к тобрамицину (аминогликозид) и линезолиду (оксазолидинон). Стрептококки проявляли чувствительность к АМП. Также изоляты S. aureus, E. coli были резистентны к средствам на основе хлоргексидина и йода, используемым для дезинфекции вымени до и после доения.

Методом ПЦР-РВ обнаружены ключевые гены резистентности: у E. coli в 5% случаев – гены blaDHA, blaCTX-M, blaOXA-10, определяющие устойчивость к β-лактамам (цефалоспоринам и защищенным пенициллинам); у группы бактерий рода Streptococcus в 4% случаев – ген ErmB, отвечающий за резистентность к макролидам, линкозамидам, стрептограминам; у одного изолята S. aureus – ген MecA, регулирующий резистентность к цефалоспоринам II поколения.

На основании полученных результатов были разработаны рекомендации по антибиотикотерапии с целью повышения ее эффективности и предупреждения дальнейшего распространения АМР. В качестве приоритетных препаратов для терапии мастита было рекомендовано применение цефазолина, цефтиофура, цефкинома (цефалоспорины I, III и IV поколений соответственно) и ципрофлоксацина (фторхинолон II поколения). Из лечебных схем предложено исключить ранее используемые многокомпонентные препараты, в состав которых входят тетрациклины и аминогликозиды, а также макролиды и цефалоспорины II поколения. Рекомендовано с осторожностью применять АМП группы пенициллинов. Показано проводить контроль дезинфекции доильного оборудования и мониторинг резистентности выявляемых возбудителей каждые 6 мес.

В 2023 г. микробиологические исследования, выполненные диско-диффузионным методом, 3 объединенных проб секрета молочной железы от 15 коров с субклиническим маститом позволили установить, что единичные выделенные из биологического материала методом MALDI-ToF масс-спектрометрии изоляты E. coli и S. aureus обладали резистентностью к ципрофлоксацину. Остальные изоляты бактерий (S. aureus, Escherichia, Enterobacter, Streptococcus spp., Enterococcus faecalis/faecium) были чувствительны ко всем АМП. Следует отметить, что изоляты E. coli и S. aureus проявляли чувствительность к средствам на основе хлоргексидина и йода, используемым для дезинфекции вымени до и после доения. Методом ПЦР-РВ у одного изолята Pseudomonas aeruginosa выявлены гены blaVIM, blaNDM, отвечающие за резистентность к карбапенемам. Остальные бактериальные изоляты были свободны от генетических мутаций, что говорит о рациональном использовании антибактериальных средств в хозяйстве в исследуемый период и дальнейшей возможности применения большего спектра антимикробных групп препаратов в лечении воспалительных заболеваний молочной железы у коров с учетом определения их фенотипической антибиотикочувствительности.

На протяжении 2022–2023 гг. было установлено, что выявленные изоляты являлись устойчивыми к применяемым средствам для обработки сосков после доения. В связи с чем были рекомендованы к использованию комбинации дезинфектантов с разным механизмом действия для оптимизации гигиенических мероприятий при доении. В качестве препарата выбора для обработки сосков вымени коров после доения было предложено средство, состоящее из комплекса поливинилпирролидона с йодом.

Проведенные микробиологические исследования на том же предприятии в 2024 г. показали преобладание в 16 отобранных пробах секрета молочной железы от коров с маститом таких бактерий, как E. coli и Staphylococcus spp. (100% проб), K. pneumoniae (30%), реже были обнаружены Enterobacter spp. (20%) и E. faecalis/faecium (10%).

Данные по антибиотикорезистентности и наличию генов устойчивости к АМП у бактериальных патогенов, выделенных из секрета молочной железы коров в 2024 г., представлены в таблице 2.

С помощью диско-диффузионного метода было выявлено, что все изоляты E. coli, S. aureus и Staphylococcus spp. обладали резистентностью к цефалоспоринам, карбапенемам. Методом ПЦР-РВ у 30% E. coli обнаружены гены blaOXA-10, определяющие устойчивость к АМП из группы цефалоспоринов, и единично гены blaCTX-M. У 50% изолятов K. pneumoniae выявлены гены blaKPC и blaOXA-48-like, отвечающие за резистентность к карбапенемам. У 50% изолятов Staphylococcus spp. установлено наличие гена MecA, обуславливающего устойчивость к β-лактамам. Представители рода Enterobacter в 30% случаев имели гены резистентности (blaGes, blaDHA) к карбапенемам, защищенным пенициллинам и цефалоспоринам. Единично в биологических пробах обнаружены E. faecalis/faecium с наличием гена устойчивости (VanB) к гликопептидам. Таким образом, у культур микроорганизмов, изолированных в 2024 г. из секрета молочной железы от коров, было выявлено 8 различных генов резистентности к АМП. Установлена высокая распространенность множественной лекарственной устойчивости у выявленной бактериальной микрофлоры секрета молочной железы, а также обнаружена резистентность к антибиотикам резерва.

Все выделенные в 2024 г. изоляты были чувствительны к предложенному в 2023 г. средству для обработки сосков вымени коров после доения, состоящему из комплекса поливинилпирролидона с йодом.

На основе результатов исследований для животноводческого предприятия были рекомендованы пересмотр схем лечения маститов с обязательным тестированием чувствительности выявляемых возбудителей, усиление мер биологической безопасности (дезинфекция оборудования, карантин животных) и внедрение регулярного мониторинга антибиотикорезистентности. Указано на необходимость применения критически важных антибиотиков (цефалоспоринов III, IV поколений, фторхинолонов) только в крайних случаях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных микробиологических исследований и MALDI-ToF масс-спектрометрии в секрете молочной железы от коров были идентифицированы следующие доминирующие бактериальные патогены: в 2022 г. – Streptococcus spp. (70,6%), S. agalactiae (23,5%), S. aureus (35,3%), E. coli (52,9%); в 2023 г. – чувствительные к АМП S. aureus, Escherichia coli, Enterobacter spp., Streptococcus spp., E. faecalis/faecium, P. аeruginosa, единично E. coli и S. aureus, обладающие резистентностью к ципрофлоксацину; в 2024 г. – E. coli и Staphylococcus spp. в 100% проб и появление новых патогенных бактерий: K. pneumoniae (30%), Enterobacter spp. (20%) и E. faecalis/faecium (10%).

В 2022 г. у E. coli выявили резистентность к аминогликозидам, пенициллинам, тетрациклинам и наличие у 5% изолятов одновременно нескольких генов резистентности blaDHA, blaCTX-M и blaOXA-10 к цефалоспоринам и защищенным пенициллинам; у S. aureus установлена устойчивость к фторхинолонам, ванкомицину, тетрациклинам и в единичном случае обнаружен ген резистентности MecA к цефалоспоринам II поколения; 4% бактерий группы Streptococcus spp. содержали ген резистентности к макролидам, линкозамидам, стрептограминам. В 2023 г. у выделенных изолятов гены резистентности к АМП выявлены не были, за исключением одного изолята P. аeruginosa, у которого установлены гены резистентности к карбапенемам blaVIM и blaNDM. В 2024 г. у 30% E. coli обнаружены гены blaOXA-10 и единично гены blaCTX-M, которые отвечают за устойчивость к цефалоспоринам. У 50% K. pneumoniae выявлены гены резистентности blaKPC, blaOXA-48-like к карбапенемам, а у Staphylococcus spp. – ген MecA, обуславливающий устойчивость к β-лактамам; у 30% Enterobacter spp. – гены резистентности blaGes, blaDHA к карбапенемам, защищенным пенициллинам и цефалоспоринам. В единичных случаях у E. faecalis/faecium обнаружен ген устойчивости VanB к гликопептидам.

В 2022 г. установлена необходимость исключения из лечебных схем многокомпонентных препаратов, используемых при лечении маститов у коров, на основе тетрациклинов, аминогликозидов, макролидов и цефалоспоринов II поколения. В качестве альтернативы рекомендовано применение цефазолина, цефтиофура, цефкинома (цефалоспорины I, III и IV поколений) и ципрофлоксацина (фторхинолон II поколения). Внедрение системы ротации антибиотиков на основе мониторинга позволило в 2023 г. временно снизить уровень резистентности. Однако последующий возврат к прежним схемам лечения в 2024 г. спровоцировал резкий рост полирезистентности среди бактериальных возбудителей мастита. Полученные результаты подтверждают необходимость непрерывного мониторинга антибиотикорезистентности, строгого соблюдения рекомендаций по ротации антимикробных препаратов, интеграции молекулярно-генетических методов в систему ветеринарного контроля в качестве инструмента для отслеживания распространенности генов устойчивости к АМП у бактерий.

В 2022–2023 гг. был выявлен рост устойчивости бактериальных изолятов к применяемым на животноводческом молочнотоварном предприятии дезинфицирующим средствам. В качестве препарата выбора для обработки сосков вымени коров после доения было предложено средство, состоящее из комплекса поливинилпирролидона с йодом. Контрольные исследования в 2024 г. подтвердили эффективность данных мер: резистентность к дезинфицирующему средству не была выявлена, что обосновывает целесообразность его дальнейшего применения на животноводческом предприятии.

Результаты работы имеют практическую значимость для ветеринарной службы предприятия и могут быть использованы при разработке региональных программ по контролю антимикробной резистентности в животноводстве.