Разработка системы внутреннего контроля на основе штамма «Ла-Сота» вируса ньюкаслской болезни при диагностике бешенства методом ОТ-ПЦР

Введение. На достоверность результатов, получаемых при проведении ПЦР-диагностики, могут влиять такие факторы, как ошибки оператора, неполадки в работе амплификатора, наличие в образце ингибиторов реакции, низкое качество реактивов и другое. Все это может приводить к появлению так называемых ложноотрицательных результатов.

Цель исследования. Разработка системы внутреннего контроля на основе гетерологичного вируса ньюкаслской болезни при детекции вируса бешенства методом полимеразной цепной реакции.

Материалы и методы. В качестве внутреннего контрольного образца использовалась «Вакцина против ньюкаслской болезни из штамма «Ла-Сота» сухая живая» производства ФГБУ «ВНИИЗЖ» (Россия). РНК из образцов выделяли с помощью набора реагентов «РИБО-сорб» (ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора, Россия). Для полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией использовали реактивы фирмы Promega (США) и олигонуклеотиды производства ООО «Синтол» (Россия).

Результаты. В качестве объекта для внутреннего контрольного образца выбран штамм «Ла-Сота» вируса ньюкаслской болезни. Проведен дизайн праймеров. В серии экспериментов установлено, что ПЦР-система для внутреннего контрольного образца не конкурирует с ПЦР-системой для вируса бешенства при их совместном использовании. Оптимизированы основные параметры обратной транскрипции и полимеразной реакции. Проведена валидация разработанной методики, в ходе которой определялись такие характеристики, как правильность, специфичность, чувствительность, промежуточная прецизионность в условиях повторяемости (сходимость) и промежуточная прецизионность в условиях воспроизводимости (воспроизводимость). По результатам валидации полученные характеристики метода соответствуют требуемым.

Заключение. На основе штамма «Ла-Сота» вируса ньюкаслской болезни разработана система внутреннего контрольного образца для использования совместно с методикой выявления вируса бешенства методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, позволяющая контролировать ход всех этапов анализа в каждой реакционной пробирке. Данная система при надлежащей оптимизации потенциально может применяться также в экспериментальных научных исследованиях в соответствующих профильных научных организациях при ПЦР-диагностике заболеваний, вызываемых другими РНК-содержащими вирусами.

1. Hoorfar J., Malorny B., Abdulmawjood A., Cook N., Wagner M., Fach P. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 2004; 42 (5): 1863–1868. https://doi.org/10.1128/JCM.42.5.1863-1868.2004

2. Buckwalter S. P., Sloan L. M., Cunningham S. A., Espy M. J., Uhl J. R., Jones M. F., et al. Inhibition controls for qualitative real-time PCR assays: are they necessary for all specimen matrices? Journal of Clinical Microbiology. 2014; 52 (6): 2139–2143. https://doi.org/10.1128/JCM.03389-13

3. Favoretto S. R., Martorelli L. F. А., Elkhoury M. R., Zargo A. M., Durigon E. L. Rabies virus detection and phylogenetic studies in samples from an exhumed human. Clinical Infectious Diseases. 2005; 41 (3): 413–414. https://doi.org/10.1086/431766

4. Smith J. S., Orciari L. A., Yager P. A. Molecular epidemiology of rabies in the United States. Seminars in Virology. 1995; 6 (6): 387–400. https://doi.org/10.1016/S1044-5773(05)80016-2

5. De Mattos C. C., De Mattos C. A., Loza-Rubio E., Aguilar-Setién A., Orciari L. A., Smith J. S. Molecular characterization of rabies virus isolates from Mexico: implications for transmission dynamics and human risk. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 1999; 61 (4): 587–597. https://doi.org/10.4269/ajtmh.1999.61.587

6. Dacheux L., Reynes J. M., Buchy P., Sivuth O., Diop B. M., Rousset D., et al. A reliable diagnosis of human rabies based on analysis of skin biopsy specimens. Clinical Infectious Diseases. 2008; 47 (11): 1410–1417. https://doi.org/10.1086/592969

7. Araújo D. B., Langoni H., Almeida M. F., Megid J. Heminested reverse-transcriptase polymerase chain reaction (hnRT-PCR) as a tool for rabies virus detection in stored and decomposed samples. BMC Research Notes. 2008; 1:17. https://doi.org/10.1186/1756-0500-1-17

8. David D., Yakobson B., Rotenberg D., Dveres N., Davidson I., Stram Y. Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains. Veterinary Microbiology. 2002; 87 (2): 111–118. https://doi.org/10.1016/s0378-1135(02)00041-x

9. Heaton P. R., Johnstone P., McElhinney L. M., Cowley R., O’Sullivan E., Whitby J. E. Heminested PCR assay for detection of six genotypes of rabies and rabies-related viruses. Journal of Clinical Microbiology. 1997; 35 (11): 2762–2766. https://doi.org/10.1128/jcm.35.11.2762-2766.1997

10. Nadin-Davis S. A., Sheen M., Wandeler A. I. Development of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction methods for human rabies diagnosis. Journal of Medical Virology. 2009; 81 (8): 1484–1497. https://doi.org/10.1002/jmv.21547

11. Wacharapluesadee S., Sutipanya J., Damrongwatanapokin S., Phumesin P., Chamnanpood P., Leowijuk C., Hemachudha T. Development of a TaqMan real-time RT-PCR assay for the detection of rabies virus. Journal of Virological Methods. 2008; 151 (2): 317–320. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2008.05.004

12. Landry M. L., Garner R., Ferguson D. Real-time nucleic acid sequence-based amplification using molecular beacons for detection of enterovirus RNA in clinical specimens. Journal of Clinical Microbiology. 2005; 43 (7): 3136–3139. https://doi.org/10.1128/JCM.43.7.3136-3139.2005

13. Hayman D. T. S., Banyard A. C., Wakeley P. R., Harkess G., Marston D., Wood J. L. N., et al. A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses. Journal of Virological Method. 2011; 177 (1): 87–93. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2011.07.002

14. Wakeley P. R., Johnson N., McElhinney L. M., Marston D., Sawyer J., Fooks A. R. Development of a real-time, TaqMan reverse transcription-PCR assay for detection and differentiation of lyssavirus genotypes 1, 5, and 6. Journal of Clinical Microbiology. 2005; 43 (6): 2786–2792. https://doi.org/10.1128/JCM.43.6.2786-2792.2005

15. Hoffmann B., Freuling C. M., Wakeley P. R., Rasmussen T. B., Leech S., Fooks A. R., et al. Improved safety for molecular diagnosis of classical rabies viruses by use of a TaqMan real-time reverse transcription-PCR“double check” strategy. Journal of Clinical Microbiology. 2010; 48 (11): 3970–3978. https://doi.org/10.1128/JCM.00612-10

16. Wadhwa A., Wilkins K., Gao J., Condori Condori R. E., Gigante C. M., Zhao H., et al. A Pan-Lyssavirus Taqman Real-Time RT-PCR Assay for the detection of highly variable Rabies virus and other lyssaviruses. PLoSNeglected Tropical Diseases. 2017; 11 (1):e0005258. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005258

17. Dacheux L., Larrous F., Lavenir R., Lepelletier A., Faouzi A., Troupin C., et al. Dual combined real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay for the diagnosis of lyssavirus infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 2016; 10 (7):e0004812. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004812

18. Suin V., Nazé F., Francart A., Lamoral S., De Craeye S., Kalai M., Van Gucht S. A two-step lyssavirus real-time polymerase chain reaction using degenerate primers with superior sensitivity to the fluorescent antigen test. BioMed Research International. 2014; 2014:256175. https://doi.org/10.1155/2014/256175

19. Coertse J., Weyer J., Nel L. H., Markotter W. Improved PCR methods for detection of African rabies and rabies-related lyssaviruses. Journal of Clinical Microbiology. 2010; 48 (11): 3949–3955. https://doi.org/10.1128/JCM.01256-10

20. Smith J., McElhinney L. M., Heaton P. R., Black E. M., Lowings J. P. Assessment of template quality by the incorporation of an internal control into a RT-PCR for the detection of rabies and rabies-related viruses. Journal of Virological Methods. 2000; 84 (2): 107–115. https://doi.org/10.1016/s0166-0934(99)00124-x

21. Zambenedetti M. R., Pavoni D. P., Dallabona A. C., Dominguez A. C., Poersch C. O., Fragoso S. P., Krieger M. A. Internal control for real-time polymerase chain reaction based on MS2 bacteriophage for RNA viruses diagnostics. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 2017; 112 (5): 339–347. https://doi.org/10.1590/0074-02760160380

22. Dreier J., Störmer M., Kleesiek K. Use of bacteriophage MS2 as an internal control in viral reverse transcription-PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 2005; 43 (9): 4551–4557. https://doi.org/10.1128/JCM.43.9.4551-4557.2005

23. Felder E., Wölfel R. Development of a versatile and stable internal control system for RT-qPCR assays. Journal of Virological Methods. 2014; 208: 33–40. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2014.07.028

24. Blaise-Boisseau S., Hennechart-Collette C., Guillier L., Perelle S. Duplex real-time qRT-PCR for the detection of hepatitis A virus in water and raspberries using the MS2 bacteriophage as a process control. Journal of Virological Methods. 2010; 166 (1–2): 48–53. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2010.02.017

25. Borghetti I. A., Zambenedetti M. R., Requião L., Vieira D. S., Krieger M. A., de Cássia Pontello Rampazzo R. External control viral-like particle construction for detection of emergent arboviruses by real-time reverse-transcription PCR. BioMed Research International. 2019; 2019:2560401. https://doi.org/10.1155/2019/2560401

26. Wie Y., Yang C., Wie B., Huang J., Wang L., Meng S., et al. RNase-resistant virus-like particles containing long chimeric RNA sequences produced by two-plasmid coexpression system. Journal of Clinical Microbiology. 2008; 46 (5): 1734–1740. https://doi.org/10.1128/JCM.02248-07

27. Wang X., Liu F., Jiang L., Bao Y., Xiao Y., Wang H. Use of chimeric influenza viruses as a novel internal control for diagnostic rRT-PCR assays. Applied Microbiology and Biotechnology. 2016; 100 (4): 1667–1676. https://doi.org/10.1007/s00253-015-7042-y

28. Ursi J.-P., Ursi D., Ieven M., Pattyn S. R. Utility of an internal control for the polymerase chain reaction: application to detection of Mycoplasma pneumoniae in clinical specimens. Journal of Pathology, Microbiology and Immunology. 1992; 100 (7–12): 635–639. https://doi.org/10.1111/j.1699-0463.1992.tb03978.x

29. Zimmermann K., Mannhalter J. W. Technical aspects of quantitative competitive PCR. BioTechniques. 1996; 21 (2): 268–279. https://doi.org/10.2144/96212rv01

30. Brightwell G., Pearce M., Leslie D. Development of internal controls for PCR detection of Bacillus anthracis. Molecular and Cellular Probes. 1998; 12 (6): 367–377. https://doi.org/10.1006/mcpr.1998.0195

31. Zimmermann K., Rieger M., Groß P., Turecek P. L., Schwarz H. P. Sensitive single-stage PCR using custom-synthesized internal controls. BioTechniques. 2000; 28 (4): 694–702. https://doi.org/10.2144/00284st05

32. Roux G., Ravel C., Varlet-Marie E., Jendrowiak R., Bastien P., Sterkers Y. Inhibition of polymerase chain reaction: pathogen-specific controls are better than human gene amplification. PLoS ONE. 2019; 14 (9):e0219276. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219276

33. Liu J., Gratz J., Amour C., Nshama R., Walongo T., Maro A., et al. Optimization of quantitative PCR methods for enteropathogen detection. PLoS ONE. 2016; 11 (6):e0158199. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0158199

34. Metlin A. E., Rybakov S. S., Gruzdev K. N., Neuvonen E., Cox J., Huovilainen A. Antigenic and molecular characterization of field and vaccine rabies virus strains in the Russian Federation. Developments in Biologicals. 2006; 125: 33–37. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16878458

35. Jarman S. N. Amplicon: software for designing PCR primers on aligned DNA sequences. Bioinformatics. 2004; 20 (10): 1644–1645. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bth121

36. Sachadyn P., Kur J. The construction and use of a PCR internal control. Molecular and Cellular Probes. 1998; 12 (5): 259–262. https://doi.org/10.1006/mcpr.1998.0170