Видовое разнообразие клостридий у крупного рогатого скота

ВВЕДЕНИЕ

Впервые род клостридий был описан A. Prażmowski в 1880 г., в настоящее время выявлено более 225 видов данной бактерии в различных регионах планеты. Клостридии являются грамположительными палочками, образующими споры, имеют широкое распространение в окружающей среде, а также входят в состав микробиома человека и животных, но только некоторые из них способны вызывать заболевания у животных [1][2][3]. Клостридиозы характеризуются высокой смертностью. Благодаря способности спорообразования клостридии могут долгое время сохраняться в почве, таким образом представляя собой потенциальную угрозу возникновения заболевания [4][5][6]. Проникновение в организм животных происходит в основном при поедании контаминированного корма (алиментарным путем), через раны либо при вдыхании. Основными факторами патогенности клостридий являются экзотоксины и ферменты [7][8][9][10], которые обладают гемолитическим, некротизирующим и летальным эффектами. Наиболее сильнодействующими токсинами клостридиального происхождения являются ботулинистический и столбнячный нейротоксины, а также эпсилон-токсин, вырабатываемый Clostridium perfringens типов B и D [11][12][13][14].

Появление полирезистентных штаммов клостридий приводит к более широкому распространению клостридиозов. Ряд ученых отмечают низкую терапевтическую эффективность антибактериальных препаратов при клиническом проявлении анаэробной энтеротоксемии у молодняка крупного рогатого скота, высокую летальность и необходимость специфической профилактики [7][15][16][17][18][19].

В настоящее время, по данным компонента «Гален» ФГИС «ВетИС», перечень зарегистрированных вакцин против клостридиозов крупного рогатого скота на территории Российской Федерации представлен следующими препаратами: «Клостривак» (Tecnovax S. A., Аргентина); «Коглавакс» (Ceva Sante Animale, Франция; Ceva-Phylaxia Veterinary Biologicals Company, Венгрия); «Клостбовак-8» (ООО «Ветбиохим», Россия); «Клостарм-9» (ФКП «Армавирская биофабрика», Россия); «Куболак» (CZ Vaccines S. A. U., Испания); «Антокс-9» (ФКП «Ставропольская биофабрика», Россия); «ВанШотУльтра 8» (Zoetis Inc., США); «Скоугард 4КС» (Zoetis Inc., США).

Актуальность и новизна работы заключается в получении данных по антибактериальной устойчивости этиологически значимых изолятов клостридий, о структуре штаммов, выделенных от крупного рогатого скота, токсигенных и патогенных свойствах. Полученные сведения будут способствовать совершенствованию системы контроля за клостридиальными инфекциями крупного рогатого скота, что, в свою очередь, снизит экономические потери животноводства.

Целью работы стало проведение мониторинговых исследований по выявлению клостридий, а также оценка уровня антимикробной резистентности изолятов Clostridium perfringens, полученных от крупного рогатого скота из различных регионов России, изучение их токсигенных и патогенных свойств.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в 2022–2024 гг. на базе лаборатории диагностики и контроля антибиотикорезистентности возбудителей наиболее клинически значимых инфекционных болезней животных ФГБНУ «Федеральный научный центр – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К. И. Скрябина и Я. Р. Коваленко Российской академии наук» в рамках государственного проекта Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (FGUG-2025-0003). В результате собственных исследований получены мониторинговые данные и выполнена практическая часть. Секционный и патолого-анатомический материалы, отобранные от крупного рогатого скота, поступили из различных регионов России: Нижегородской, Московской, Ленинградской, Рязанской, Новосибирской, Пензенской областей, Республики Мордовии.

Биоматериал. Всего было исследовано 359 образцов (печень, сердце, селезенка, легкое, почка, мышца, тонкий и толстый кишечник, желудок, срез с копыт, околоплодные воды и др.).

Выделение изолятов, определение патогенных и токсигенных свойств. Исследование, целью которого было выделение изолятов микроорганизмов, этиологически наиболее значимых для промышленного животноводства, а именно семейства Clostridiaceae (клостридии), реализовано согласно ГОСТ 26503-85 «Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики клостридиозов»¹.

Идентификация клостридий. Видовую идентификацию микроорганизмов выполняли методом масс-спектрометрии с использованием системы MALDI Biotyper (Bruker Daltonik GmbH, Германия) согласно «Методическим указаниям по идентификации микроорганизмов с применением масс-спектрометра MALDI Biotyper при исследовании продовольственного сырья и пищевых продуктов» (одобрены НТС Россельхознадзора от 03.04.2014).

Определение антибактериальной резистентности культур микроорганизмов проводили диско-диффузионным методом в соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»². В ходе реализации научной работы были использованы антибактериальные препараты различных групп (HiMedia Laboratories Pvt Ltd., Индия): макролиды (азитромицин 15 мкг, кларитромицин 15 мкг, пристинамицин 15 мкг, спирамицин 30 мкг, тилозин 15 мкг, эритромицин 15 мкг), монобактамы (азтреонам 30 мкг), пенициллины (амоксиклав 30 мкг, амоксициллин 25 мкг, ампициллин 25 мкг, бензилпенициллин 10 мкг, карбенициллин 100 мкг, пиперациллин 100 мкг), полипептиды (бацитрацин 10 мкг, полимиксин-B 50 мкг), хлорамфеникол 30 мкг, гликопептиды (ванкомицин 30 мкг), аминогликозиды (гентамицин 30 мкг, канамицин 30 мкг, спектиномицин 100 мкг, стрептомицин 25 мкг), карбапенемы (дорипенем 10 мкг), линкозамиды (клиндамицин 2 мкг, линкомицин 10 мкг), фторхинолоны (левофлоксацин 5 мкг, норфлоксацин 10 мкг, офлоксацин 5 мкг, пефлоксацин 5 мкг, ципрофлоксацин 30 мкг, энрофлоксацин 10 мкг), тетрациклины (окситетрациклин 30 мкг, тетрациклин 30 мкг, хлортетрациклин 30 мкг, доксициклин 30 мкг), ансамицины (рифампицин 15 мкг), сульфаниламиды (сульфадиазин 100 мкг, сульфафуразол 300 мкг), диаминопиримидины (триметоприм 25 мкг), цефалоспорины (цефиксим 5 мкг, цефазолин 30 мкг, цефаклор 30 мкг, цефалексин 30 мкг, цефотаксим 30 мкг, цефепим 30 мкг, цефоперазон 75 мкг, цефпиром 30 мкг, цефтриаксон 30 мкг), производные фосфоновой кислоты (фосфомицин 50 мкг), фузидины (фузидиевая кислота 30 мкг).

Интерпретацию результатов проводили в соответствии с рекомендациями CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) и EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) [20][21].

Статистическая обработка результатов велась с использованием Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенных исследований выделено и идентифицировано 137 изолятов следующих клостридий: Paraclostridium bifermentans, Clostridium perfringens, Clostridium tertium, Clostridium butyricum, Clostridium septicum, Clostridium sporogenes, Clostridium cadaveris, Clostridium sphenoides, Clostridium cochlearium, Clostridium sartagoforme, Clostridium chauvoei, Clostridium novyi, Clostridium sordellii, Clostridium paraputrificum, Clostridium spp.

Установлено видовое разнообразие изолятов клостридий, циркулирующих на территории Российской Федерации, которое представлено на рисунке 1.

Выявлено превалирование C. perfringens – 17,5%, далее по убыванию распространение имеют C. tertium – 13,1%, C. sordellii – 11,7%, C. chauvoei – 11,0%, C. novyi – 9,5%, P. bifermentans и C. butyricum – 8,0%, C. sporogenes – 6,6%, Clostridium spp. – 5,0%, C. septicum – 3,0%, C. cadaveris – 2,2%, C. sphenoides и C. cochlearium – по 1,5%, наименьшую долю составляют изоляты C. sartagoforme и C. paraputrificum – 0,7%.

Результаты определения антибиотикорезистентности изолятов C. perfringens (n = 24), выделенных от крупного рогатого скота из различных регионов Российской Федерации, представлены на рисунке 2.

Согласно полученным данным, можно утверждать, что изоляты C. perfringens (n = 24) резистентны к цефиксиму, фузидиевой кислоте, цефотаксиму, цефаклору, спектиномицину, пиперациллину, кларитромицину, дорипенему, доксициклину. Антибиотикорезистентность к ампициллину составила 85%, к амоксициллину, хлортетрациклину, ванкомицину, рифампицину и ципрофлоксацину – 80%, к тилозину и амоксиклаву – 75%, к сульфадиазину, цефалексину, офлоксацину и полимиксину-В – 60%, к пефлоксацину и цефоперазону – 55%, к бензилпенициллину, клиндамицину, цефтриаксону и хлорамфениколу – 50%, к энрофлоксацину, цефазолину, тетрациклину и стрептомицину – 45% изолятов. 40% изолятов C. perfringens имели устойчивость к бацитрацину, норфлоксацину, фосфомицину, 35% изолятов – к левофлоксацину, линкомицину, окситетрациклину, 25% изолятов – к эритромицину, спирамицину и гентамицину, 20% изолятов – к азитромицину, цефепиму, цефпирому. К сульфафуразолу и карбенициллину были чувствительны все исследуемые изоляты C. perfringens (100%), к триметоприму – 90%, к азитромицину – 70%, а к левофлоксацину – 65%, к канамицину – 45% изолятов. Промежуточной чувствительностью к азтреонаму и пристинамицину обладали все исследуемые штаммы, к спирамицину – 75%, к фосфомицину – 60%, к цефазолину – 55%, к канамицину – 45% изолятов.

Среди 137 выделенных изолятов клостридий у 25 установлены патогенные свойства и у 17 – токсигенные. Полученные данные представлены графически в процентах на рисунках 3 и 4.

Патогенными свойствами в большинстве случаев обладали изоляты C. perfringens (6,6%). Наличие факторов патогенности выявлено у 5,1% штаммов C. novyi, у 4,4% изолятов C. chauvoei, у 1,5% штаммов C. septicum и у 0,7% изолятов Clostridium spp. Токсигенные свойства установлены у C. sordellii (3,7%), C. perfringens (3,7%), C. novyi (3,0%), C. septicum (1,5%) и Clostridium spp. (0,7%).

Места локализации клостридий в организме крупного рогатого скота представлены в таблице.

Согласно приведенным данным, чаще всего клостридии выделяли из печени, тонкого и толстого отделов кишечника, а также мышц.

Клостридии являются широко распространенными микроорганизмами, вызывающими заболевания у животных, птиц и людей. Устойчивость к противомикробным препаратам является серьезной проблемой в ветеринарии ввиду того, что 80% всех антибиотиков в мире применяется в сельском хозяйстве, в том числе в качестве кормовых добавок и стимуляторов роста. Полученные при проведении настоящего исследования результаты по антимикробной резистентности к цефотаксиму согласуются с данными Н. А. Безбородовой и соавт. [7], H. A. Ahmed et al. [22]. В работе, проведенной иранскими исследователями F. Khademi et al., отмечена устойчивость C. perfringens к ампициллину (25,8%), эритромицину (32,9%), гентамицину (45,4%), тетрациклину (19,5%), амоксициллину (19,3%), бацитрацину (89,1%) [23]. Группа ученых из Китая и Пакистана исследовала 11 наиболее часто используемых антибиотиков, 2 из них не оказывали ингибирующего воздействия, 5 – были эффективны, а 4 – обладали умеренной активностью против C. perfringens. Линкомицин и амикацин не ингибировали изоляты, тетрациклин, пенициллин, эритромицин и окситетрациклин в меньшей степени подавляли рост клостридий. Ученые пришли к выводу о целесообразности использования нескольких видов антибиотиков, что является более эффективным подходом для подавления бактериальной инфекции [24]. Исследователи из Кот-д’Ивуара в своей работе определили, что уровень антибиотикорезистентности у C. perfringens к тетрациклину, доксициклину, хлорамфениколу, эритромицину составляет от 20 до 50% [25]. Группа ученых из Южной Кореи при изучении степени распространенности и устойчивости C. perfringens к антибиотикам установила, что резистентность к тетрациклину составила 100%, к ампициллину – 31,6%, к хлорамфениколу – 68,4%, к метронидазолу – 34,2%, к имипенему – 71%. Также авторы исследования отмечают важный момент комбинированной устойчивости 78,9% изолятов к нескольким антимикробным препаратам [26].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований секционного и патматериала от крупного рогатого скота в 2022–2024 гг. выделено 137 изолятов клостридий, из них у 25 установлены патогенные свойства, а у 17 – токсигенные. Наиболее частыми местами локализации клостридий были печень, толстый и тонкий отделы кишечника, мышцы, желудок. Также бактерии обнаруживали в почках, селезенке, околоплодных водах и смывах с копыт.

При проведении мониторинговых исследований по определению антимикробной резистентности изолятов C. perfringens выявлена устойчивость к цефиксиму, фузидиевой кислоте, цефотаксиму, цефаклору, спектиномицину, пиперациллину, кларитромицину, дорипенему, доксициклину.

Результаты данного исследования могут быть использованы для модификации существующих протоколов лечения клостридиальных инфекций, корректировки состава иммунобиологических препаратов, разработки рекомендаций по использованию антибиотиков в животноводстве для снижения рисков развития антимикробной резистентности.

Вклад авторов: Шастин П. Н. – подбор и анализ источников по теме, анализ экспериментальных и лабораторных исследований, написание текста статьи; Савинов В. А. – подбор и анализ источников по теме; Лаишевцев А. И. – редактирование текста статьи, формальный анализ, формулировка выводов; Мандрыка Е. Д. и Фабрикантова Е. А. – проведение микробиологических исследований, сбор и систематизация данных; Супова А. В. – проведение микробиологических исследований, обобщение и интерпретация результатов исследования.

Contribution of the authors: Shastin P. N. – source selection and analysis, experimental and laboratory data analysis, paper writing; Savinov V. A. – source selection and analysis; Laishevtsev A. I. – paper editing, formal analysis, drawing conclusions; Mandryka E. D. and Fabrikantova E. A. – microbiological tests, data accumulation and systematization; Supova A. V. – microbiological tests, test result compilation and interpretation.