Изучение антигенных свойств вакцины против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак

ВВЕДЕНИЕ

Вирус чумы плотоядных (canine distemper virus, CDV) поражает некоторые виды животных отряда плотоядных, в числе которых представители псовых, енотовых, кошачьих и др., а также панды. Возбудитель политропен – может затрагивать практически все системы организма. Согласно международной классификации, вирус относится к отряду Mononegavirales, семейству Paramyxoviridae, подсемейству Orthoparamyxovirinae, роду Morbillivirus, виду Morbillivirus canis [1][2].

Парвовирус собак типа 2 (canine parvovirus type 2, CPV-2) – возбудитель парвовирусного энтерита и основная причина гибели собак от вирусных болезней; чрезвычайно заразен. Клиническими признаками заболевания являются: острый гастроэнтерит, отслоение и геморрагическое воспаление слизистой оболочки толстого кишечника, геморрагическая диарея, эксикоз, лейкопения и нейтропения [2]. Вирус принадлежит к отряду Piccovirales, семейству Parvoviridae, подсемейству Parvovirinae, роду Protoparvovirus, виду Protoparvovirus carnivoran 1 [1].

Вирус коронавирусного энтерита собак (canine coronavirus, CCoV) вызывает энтерит с характерными признаками, среди которых анорексия, рвота, диарея, лимфопения, летаргия [3][4][5][6]. Проявление болезни варьирует от бессимптомного течения до летального исхода [7]. По уровню встречаемости среди энтеропатогенов вирусного происхождения коронавирус занимает второе место в мире [8][9][10]. Возбудитель относится к отряду Nidovirales, подотряду Cornidovirineae, семейству Coronaviridae, подсемейству Orthocoronavirinae, роду Alphacoronavirus [1].

Аденовирус собак серотипа 2 (canine adenovirus serotype 2, CAV-2) вызывает инфекционный ларинготрахеит, проявляющийся в транзиторной, бессимптомной или легкой формах; может вызвать тяжелый некротизирующий бронхит, интерстициальную пневмонию [11], диарею [12] и поражение центральной нервной системы [2]. Вирус относится к отряду Rowavirales, семейству Adenoviridae, роду Mastadenovirus, виду Mastadenovirus canidae, серотипу 2 [1].

Вирус бешенства (rabies virus, RABV) поражает центральную нервную систему у теплокровных животных и человека, заболевание приводит к летальному исходу [13][14]. Лечение не разработано. Вирус относится к отряду Mononegavirales, семейству Rhabdoviridae, подсемейству Alpharhabdovirinae, роду Lyssavirus [1][15][16].

Штаммовый состав ассоциированной вакцины против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак «Карникан-5R» был подобран согласно руководству, опубликованному Группой по составлению руководств по вакцинации (Vaccination Guidelines Group, VGG) Международной ветеринарной ассоциации мелких домашних животных (World Small Animal Veterinary Association, WSAVA). К базовым вирусным болезням, профилактика которых должна осуществляться вне зависимости от географического положения животного, относят: чуму плотоядных, парвовирусный энтерит и аденовирусную инфекцию (возбудитель CAV-2) собак. Вакцинопрофилактика лептоспироза в руководстве классифицирована как дополнительная [17]. Иммунизация против бешенства урегулирована законодательством Российской Федерации [18][19], в связи с этим в состав вакцины был включен штамм вируса этой болезни. Однако данное руководство не является обязательным, и схемы вакцинации определяются ветеринарными врачами согласно распространенности вирусных заболеваний в конкретном регионе. Ввиду возрастающего числа случаев летального исхода в популяции собак вследствие переболевания коронавирусным энтеритом [5][6][10] в состав вакцины также включили штамм возбудителя указанного заболевания.

График иммунизации собак был составлен исходя из научных данных о гуморальном иммунитете и рекомендаций WSAVA. В среднем ветеринарные врачи по всему миру рекомендуют начинать вакцинацию собак в 12-недельном возрасте, бустерную вакцинацию проводить в 16-недельном возрасте и далее в зависимости от благополучия региона по вирусным болезням один раз в год или один раз в 3 года пожизненно [17].

Предварительно в процессе разработки вакцины «Карникан-5R», помимо изучения свойств вирусов и определения соотношения компонентов в препарате, были проведены эксперименты на лабораторных животных по определению ареактогенности и безвредности, а также опыт по подбору оптимальной иммунизирующей дозы и способа введения. При этом были получены следующие данные: вакцина ареактогенна и безвредна, иммунизирующая доза – 1,0 см³ (жидкий компонент является разбавителем для лиофилизированного), способ введения – подкожный или внутримышечный. Срок хранения после объединения компонентов составил 2 ч при температуре 18–25 °С.

Для оценки антигенных свойств вакцины были запланированы и проведены опыты на целевых животных по изучению формирования гуморального иммунитета и длительности сохранения вирусспецифических антител после введения препарата в течение периода наблюдения (12 мес.).

Целью исследований являлось изучение антигенных свойств вакцины против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак на целевых животных. В процессе исследования были решены следующие задачи: получение качественного иммунобиологического препарата, соответствующего заявленным параметрам, разработка программ опытов, проведение опытов, постановка серологических реакций для оценки уровня антител до и после вакцинации, обработка и структурирование полученных данных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование антигенных свойств вакцины против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак «Карникан-5R» было проведено согласно требованиям приказа Минсельхоза России от 06.03.2018 № 101 «Об утверждении правил проведения доклинического исследования лекарственного средства для ветеринарного применения, клинического исследования лекарственного препарата для ветеринарного применения, исследования биоэквивалентности лекарственного препарата для ветеринарного применения».

Вакцина. Разработанная Федеральным центром охраны здоровья животных (ФГБУ «ВНИИЗЖ») вакцина «Карникан-5R» включает 2 компонента: лиофилизированный (содержит аттенуированный вирус чумы плотоядных), жидкий (включает инактивированные парвовирус, коронавирус, аденовирус и вирус бешенства собак). Препарат зарегистрирован в РФ, на изобретение получен патент [20].

Действующим веществом лиофилизированного компонента вакцины является аттенуированный штамм «Рокборн» CDV; жидкого компонента – инактивированные аминоэтилэтиленимином штамм «Грей» CPV-2, штамм «Рич» CCoV, штамм «Юнити» CAV-2, штамм «ВНИИЗЖ» RABV. В качестве целевой добавки для лиофилизированного компонента использованы стабилизаторы: гидролизат лактальбумина, сахароза и желатоза; для жидкого компонента – адъювант гидроокись алюминия. Все компоненты вакцины прошли всесторонний входной контроль качества. Одна иммунизирующая доза препарата содержит не менее 3,0 lg ТЦД₅₀/см³ аттенуированного CDV и инактивированные вирусы CPV-2 (титр вируса до инактивации не менее 7,0 log₂, ГАЕ 1:128), CCoV (титр вируса до инактивации не менее 3,0 lg ТЦД₅₀/см³), CAV-2 (титр вируса до инактивации не менее 3,0 lg ТЦД₅₀/см³), RABV (титр вируса до инактивации не менее 1,0 МЕ/см³).

Животные. Клинические исследования проводились с использованием собак 10–12-недельного возраста (n = 35).

Животные содержались в условиях приютов, ветеринарных клиник и индивидуально в частном владении. Состояние здоровья собак оценивалось до начала исследования и в течение всего периода наблюдения.

Для оценки эффективности вакцины «Карникан-5R» проводили двукратную иммунизацию щенков с интервалом 21 сут; препарат вводили внутримышечно в каудопроксимальную часть тазовой конечности в объеме одной иммунизирующей дозы.

Все эксперименты осуществляли в соответствии с требованиями стандартов ФГБУ «ВНИИЗЖ» СТО 00495527-0002 «Животные лабораторные. Использование для контроля и экспериментов» и СТО 00495527-0230 «Доклинические исследования лекарственных средств для ветеринарного применения».

Серологические исследования. Исследование сывороток крови собак для определения уровня антител к CDV, CCoV, CAV-2 проводили с использованием реакции нейтрализации (РН) в микропланшетах [21][22][23], к RABV – с помощью реакции нейтрализации методом Fluorescent Antibody Virus Neutralization (РН FAVN) и к CPV-2 – в реакции торможения (ингибирования) гемагглютинации (РТГА) согласно утвержденным методическим рекомендациям [24].

Статистический анализ результатов. Обработка полученных данных производилась с использованием статистических методов в программе Microsoft Exсel. Расчет титра специфических антител осуществляли по формуле Кербера и выражали в логарифмах с основанием 2 (log₂).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

После вакцинации изменений температуры тела, ухудшения общего физиологического состояния организма, анорексии и местной реакции в области введения вакцины не отмечали. Признаков заболевания чумой плотоядных, парвовирусным и коронавирусным энтеритом, аденовирусной инфекцией собак и бешенством также не было зафиксировано.

При исследовании сывороток крови щенков до вакцинации среднегрупповой уровень специфических антител к CDV, CCoV, CAV-2 составлял < 1,0 log₂ (в РН); к CPV-2 – 4,23 ± 0,63 log₂ (в РТГА); к RABV – < 0,5 log₂ (в РН FAVN).

На рисунке 1 представлена динамика формирования гуморального иммунитета у собак после введения вакцины «Карникан-5R». Было установлено, что вакцинация индуцировала выработку вирусспецифических антител к CDV, CPV-2, CCoV, CAV-2 и RABV. Через 21 сут после первичной иммунизации уровень антител к CDV составлял 4,00 ± 0,25 log₂; к CPV-2 – 5,67 ± 0,58 log₂; к CCoV – 2,67 ± 0,14 log₂; к CAV-2 – 2,83 ± 0,14 log₂; к RABV – 0,82 ± 0,03 log₂, что достоверно выше пороговых значений.

Среднегрупповые титры вирусспецифических антител на 7, 14, 21 и 35-е сут были выше титров, установленных до начала иммунизации собак. На 35-е сут регистрировали достоверно более высокий уровень вирусспецифических антител, чем в предыдущих точках контроля (р ≥ 0,1), который к CDV составил 8,60 ± 0,14 log₂; к CPV-2 – 8,93 ± 0,58 log₂; к CCoV – 5,0 ± 0,25 log₂; к CAV-2 – 5,36 ± 0,14 log₂; к RABV – 2,86 ± 0,07 log₂. Показатели уровня антител демонстрировали «эффект плато» с 42-х и с 51-х сут. На основании полученных данных был сделан вывод о том, что двукратное введение вакцины «Карникан-5R» с интервалом 21 сут стимулировало формирование напряженного гуморального ответа к 35-м сут после первого введения. Таким образом, рекомендованной схемой вакцинации собак против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции собак и бешенства является: начало вакцинации – с 10–12-недельного возраста, бустерная иммунизация – через 21 сут, далее – ежегодная иммунизация. Схема вакцинации взрослых животных аналогична и не зависит от возраста собаки.

На следующем этапе была изучена длительность иммунитета после двукратной вакцинации против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов собак, аденовирусной инфекции собак и бешенства. Для этого в течение 12 мес. (срок наблюдения) у животных производили отбор проб крови каждые 30 дней.

Как показано на рисунке 2, продолжительность иммунитета к возбудителям указанных заболеваний составила не менее 12 мес. На момент бустерной вакцинации через год после начала иммунизации собак было отмечено незначительное снижение уровня специфических антител. Однако, согласно опубликованным результатам исследований, протективный уровень антител к CDV составляет 2–4 log₂ [25][26]. Двукратное введение вакцины индуцировало прирост антител до 9,15 ± 0,14 log₂, минимальное значение за период наблюдения составило 7,75 ± 0,14 log₂. Уровень антител для защиты собак от заболевания парвовирусным энтеритом должен быть не ниже 4 log₂ [25][26][27][28][29][30][31]. После двукратной вакцинации максимальный уровень антител к CPV-2 составил 10,40 ± 0,58 log₂, минимальный – 9,0 ± 0,28 log₂. Двукратная иммунизация стимулировала прирост антител к CAV-2 до 6,35 ± 0,25 log₂, в течение 12 мес. минимальное значение регистрировали на уровне 5,90 ± 0,14 log₂. Протективный уровень вирусспецифических антител к CCoV достоверно не установлен, однако титр антител после второго введения вакцины превышал 5,95 ± 0,14 log₂, а минимальный – составлял 5,08 ± 0,28 log₂, что позволяет сделать предположение о защите животных от заболевания [32]. Согласно научным данным и требованиям Всемирной организации здравоохранения животных, вакцина против бешенства должна обеспечивать выработку антирабических антител в титре ≥ 0,5 МЕ/см³ [14][33]. В нашем случае после иммунизации максимальный титр антител к RABV был равен 3,69 МЕ/см³, минимальный – 2,6 МЕ/см³.

В течение года в среднем титр антител к CDV составил 8,74 ± 0,53 log₂, к CPV-2 – 9,95 ± 0,42 log₂, к CCoV – 5,75 ± 0,34 log₂, к CAV-2 – 6,09 ± 0,14 log₂, к RABV – 3,12 ± 0,37 МЕ/см³. Таким образом, вакцина «Карникан-5R» обеспечивает образование гуморальных антител к вирусам чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов собак, аденовирусу собак серотипа 2 и вирусу бешенства.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В процессе исследования были изучены антигенные свойства вакцины против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак. На основании полученных данных установлено, что препарат «Карникан-5R» индуцирует сероконверсию у целевых животных. При двукратном введении вакцины с интервалом 21 сут продолжительность иммунитета составляет не менее 12 мес. Иммунный ответ формируется через 21 сут после двукратного введения препарата. Уровень титра антител через 1 мес. после бустерной вакцинации к CDV составил в среднем 9,15 log₂ (в РН), к CPV-2 – 10,2 log₂ (в РТГА), к CCoV – 5,95 log₂ (в РН), к CAV-2 – 6,2 log₂ (в РН), к RABV – 3,05 МЕ/см³ (в РН FAVN). Уровень антител к указанным вирусам у собак выше протективного, что обеспечивает защиту организма животного от перечисленных инфекций.

Вакцина ареактогенна и безвредна, не вызывает выраженной местной реакции при внутримышечном или подкожном введении и не оказывает отрицательного действия на физиологическое состояние животных. Препарат провоцирует выраженный иммунный ответ в виде образования вирусспецифических антител в защитных титрах.

Разработанная в ФГБУ «ВНИИЗЖ» ассоциированная вакцина против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции и бешенства собак «Карникан-5R» может использоваться для специфической профилактики вирусных болезней у собак. Препарат прошел контроль в ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ») и зарегистрирован на территории РФ.

Вклад авторов: Климова А. А. – проведение исследований, систематизация результатов, анализ литературы, написание текста; Комарова А. А. – вирусологические исследования, обработка биологического материала, анализ и интерпретация данных; Киселев А. М. – вирусологические исследования, обработка биологического материала; Галкина Т. С. – идея и дизайн исследования, утверждение окончательного варианта статьи.

Contribution of the authors: Klimova A. A. – testing, test result systematization, literature data analysis, paper writing; Komarova A. A. – virological tests, biological sample processing, data analysis and interpretation; Kiselev A. M. – virological tests, biological sample processing; Galkina T. S. – study idea and design, paper review and editing.