Вирулицидная активность дезинфицирующих препаратов в отношении возбудителя африканской чумы свиней

ВВЕДЕНИЕ

Несмотря на предпринимаемые усилия по профилактике распространения африканской чумы свиней (АЧС) на территории Российской Федерации, риски заноса инфекции в свиноводческие хозяйства страны остаются высокими. Ущерб, причиняемый болезнью, значителен. Так, совокупные потери от АЧС в России за 2018–2020 гг. составили 32 571,6 млн руб. [1].

В сложившихся условиях особую значимость имеет биологическая защита свиноводческих хозяйств всех типов – комплекс управленческих и физических мероприятий, направленных на снижение риска заноса, укоренения и распространения болезни [2][3].

При несоблюдении или несовершенстве регламента биозащиты увеличивается вероятность заноса возбудителей опасных болезней, включая АЧС. Поэтому во всех свиноводческих хозяйствах и на предприятиях по убою свиней и переработке продуктов убоя важна организация действенных заградительных мер (сегрегация, очистка, дезинфекция) с учетом возможности проникновения инфекции как с источниками вируса (инфицированными животными), так и с контаминированными объектами окружающей среды (транспорт, одежда и обувь персонала, расходные материалы и оборудование).

В случае возникновения АЧС ветеринарными правилами регламентирована организация ветеринарных постов для обработки транспорта на выезде из очага, угрожаемой зоны и проведение трехэтапной дезинфекции в эпизоотическом очаге для предотвращения распространения инфекции [4]. В п. 49 упомянутых правил указано, что для дезинфекции объектов должны применяться хлорсодержащие (с содержанием действующего вещества не менее 25%) или другие дезинфицирующие растворы, обладающие высокой вирулицидной активностью в отношении возбудителя, согласно инструкциям по применению. Однако далеко не во всех инструкциях к коммерческим дезсредствам представлена обоснованная информация о степени их губительного действия по отношению к возбудителям и об условиях применения, обеспечивающих их эффективность.

Все перечисленное указывает на то, что для защиты от заноса и распространения АЧС необходима организация действенных дезинфекционных мероприятий, учитывающих устойчивость конкретного возбудителя во внешней среде и продукции свиноводства, а также его толерантность к некоторым типам дезинфицирующих средств, что обусловлено сложной структурой вириона.

Устойчивость вируса АЧС в разных температурных условиях составляет: 5 °С – до 7 лет, 18–20 °С – 18 мес., 37 °С – 30 сут, 50 °С – до 1 ч. В сыворотке крови при температуре 5 °С вирус может сохраняться на протяжении 6 лет, в копченой ветчине – до 180 сут, в замороженном мясе – до 155 сут [5][6].

Данные о сохранности вируса АЧС во внешней среде и в различных экскретах инфицированных животных представлены в таблице 1.

Следует отметить, что в СанПиН 3.3686-21 вирус АЧС не упомянут, поскольку не относится к возбудителям болезней, общих для человека и животных [12]. Согласно п. 2.13.2 Правил проведения дезинфекции и дезинвазии объектов государственного ветеринарного надзора, вирус АЧС относится к устойчивым (вторая группа устойчивости из четырех, установленных правилами) [13]. В документе также представлены требования по соблюдению режимов дезинфекции в соответствии с классом устойчивости возбудителя, однако перечень упоминаемых дезсредств не включает в себя широкий спектр применяемых в настоящее время препаратов (на основе кислот, щелочей, альдегидов, соединений хлора, йода, фенолов, четвертичных аммониевых соединений), заявляемыми преимуществами которых являются относительно короткий период экспозиции, отсутствие выраженного коррозийного и токсического эффектов, усиленный эффект за счет синергии компонентов при низких концентрациях действующих веществ [14][15][16].

В «Методических указаниях по контролю качества ветеринарной дезинфекции объектов животноводства», приведенных в приложении 3 к указанным выше правилам, для контроля качества текущей дезинфекции регламентированы исследования по определению наличия или отсутствия санитарно-показательных микроорганизмов (для второй группы устойчивости: Staphylococcus aureus, S. epidermatis, S. saprophiticus) [13]. Однако, хотя устойчивость вируса АЧС и стафилококков сопоставима, она не равнозначна, что обусловлено разницей в строении конкретных возбудителей и видовых механизмах резистентности [17][18]. Так, например, основой в строении клеточной стенки грамположительных бактерий, в том числе S. aureus, являются пептидогликан и тейхоевые кислоты, в то время как внутренний кор вириона АЧС окружен плотным белковым слоем, внутренней липидной оболочкой и капсидом, который является внешним слоем у внутриклеточных вирионов. Вышеперечисленное в том числе обуславливает разницу в чувствительности к различным показателям pH; так, оптимальный диапазон для размножения стафилококков составляет 7,2–7,4, в условиях повышенной кислотности (pH < 4,5) рост бактерий замедляется, в отличие от возбудителя АЧС, который инактивируется при значениях pH < 3,9 или > 11,5 [19][20].

В связи с этим для исследовательских целей по определению дезинфицирующих свойств испытуемых средств или отдельных их компонентов больше подходит методология, разделяющая испытания по типу конкретных возбудителей (отдельно бактерии, вирусы, грибы и др.).

В рамках научно-исследовательских работ в референтной лаборатории по АЧС ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») проводится изучение вирулицидной активности коммерческих дезинфицирующих средств в отношении вируса АЧС генотипа II. Испытания проходят в два этапа: in vitro с определением минимальной эффективной концентрации и экспозиции; методом орошения тест-поверхностей рабочими растворами препаратов. На всех стадиях предусмотрено применение искусственного органического загрязнения для имитации условий, приближенных к реальным.

Цель исследования – сравнительная оценка шифрованных дезинфицирующих препаратов с известным химическим составом по их вирулицидным свойствам в отношении возбудителя АЧС.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Испытаниям подвергнуты 12 дезинфицирующих средств российских производителей. Образцы препаратов шифровали перед постановкой экспериментов.

В отсутствие соответствующих ведомственных документов исследования проводились по схеме испытаний дезинфекционных средств, схожей с представленной в ГОСТ Р 58151.4-2018 и Р 4.2.3676-20, но с модификацией методологии под условия применения дезсредств в ветеринарии и адаптацией к актуальному возбудителю – вирусу АЧС [21].

Работа с вирусом АЧС и интерпретация полученных результатов выполнялась в соответствии с «Методическими рекомендациями по выделению и титрованию вируса африканской чумы свиней в культуре клеток селезенки свиней» [22].

Первый этап по оценке свойств in vitro проводили в двух вариантах: без белковой нагрузки и с добавлением инактивированной сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС) из расчета 40%-й концентрации в смеси вируса c дезинфектантом. В качестве тест-объекта использовали 2-суточный субконфлюэнтный монослой первичной культуры клеток селезенки свиньи с добавлением поддерживающей питательной среды Игла MEM по прописи ФГБУ «ВНИИЗЖ», содержащей 10% фетальной сыворотки крови КРС.

Заражение культуры клеток проводили методом инокуляции жидкофазного материала гемадсорбирующего референс-штамма Arm 07 вируса АЧС II генотипа, депонированного в государственную коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ».

К образцам очищенной от клеточного детрита суспензии, содержащей штамм Arm 07 вируса АЧС в титре не менее 6,0 lg ГАдЕ₅₀/см³, добавляли рабочий раствор испытуемых дезинфицирующих препаратов в пропорции 1:9 (1 объем вируссодержащего материала и 9 объемов средства).

Для нейтрализации действия препаратов и имитации органического загрязнения использована 70%-я инактивированная сыворотка крови КРС.

Полученные образцы (как с сывороткой, так и без нее) выдерживали при комнатной температуре в течение срока экспозиции, впоследствии нейтрализовали путем обработки образца сывороткой крови КРС в соотношении 1:1 (объем образца и нейтрализатора).

Затем образцы смеси вируса, препарата и нейтрализатора вносили в лунки планшета с монослоем чувствительной к вирусу АЧС культуры клеток селезенки свиньи, через 30 мин удаляли смесь, заменяли поддерживающей средой. Культуру клеток инкубировали в атмосфере с 5%-м содержанием СО₂ в течение 7 сут при 37 °C с ежедневным контролем результатов.

Второй этап тестирования эффективности обеззараживания осуществляли способом орошения из пульверизатора рабочими растворами дезсредств тест-пластин из бетона размером 10 × 10 см. Перед экспериментом все поверхности подвергали механической очистке (мыли водой с мылом и щеткой, промывали проточной водой, после чего протирали несколько раз стерильной влажной салфеткой) и автоклавировали.

Тест-пластины располагали горизонтально и пипеткой на каждую наносили суспензию вируса АЧС в титре не менее 6,0 lg ГАдЕ₅₀/см³ из расчета 0,5 см³/м² с добавлением 5% инактивированной сыворотки крови КРС на площадь в 100 см², равномерно распределяли по поверхности. Контаминированные вирусом поверхности высушивали при комнатной температуре, затем обрабатывали раствором испытуемого дезинфекционного препарата в минимальной эффективной на первом этапе концентрации и при минимальном времени экспозиции.

Для имитации органического загрязнения (белковой нагрузки) использовали 40%-ю инактивированную сыворотку крови КРС, которую наносили на контаминированные вирусом поверхности. Затем поверхности орошали из пульверизатора испытуемым дезинфекционным препаратом при норме расхода 0,3 л/м² обрабатываемой площади (согласно инструкциям производителей).

Контрольные тест-пластины орошали стерильной или прокипяченной водопроводной водой при той же норме расхода (0,3 л/м²), что и в опыте. Для определения полноты инактивации вируса АЧС с испытуемых поверхностей отбирали пробы-смывы с последующим нанесением их на чувствительную культуру клеток селезенки свиньи (индикацию осуществляли методом вирусовыделения с проведением трех слепых пассажей на культуре клеток каждого из образцов).

Учет результатов проводили по наличию или отсутствию феномена гемадсорбции – качественного специфического показателя репродукции вируса АЧС (рис.). Считали, что образец препарата обладал вирулицидной активностью при отсутствии гемадсорбции.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты испытаний эффективности (по наличию или отсутствию вирулицидной активности) шифрованных дезинфекционных препаратов в двух последовательных этапах in vitro представлены в таблице 2.

Установлено, что способностью инактивировать высоковирулентный вирус АЧС референтного штамма Arm 07 во всех заявленных производителями концентрациях и экспозициях при орошении бетонных тест-поверхностей обладали девять дезинфицирующих препаратов из двенадцати.

Препараты под шифрами 1, 2 и 3, главным действующим веществом которых является калия пероксомоносульфат в концентрациях 0,55, 0,5 и 1,5% соответственно, показали активность в отношении вируса АЧС как при тестировании суспензионным методом, так и способом орошения тест-поверхностей из бетона при времени экспозиции 30 и 60 мин. Пероксомоносульфат калия способен инактивировать вирус АЧС даже при значительном органическом загрязнении, однако в таком случае концентрация его должна составлять не менее 1,0% [23]. Данные настоящего исследования демонстрируют активность препаратов на основе пероксомоносульфата калия меньшей концентрации как при белковой нагрузке, так и без нее, что может учитываться при оптимизации химического состава дезсредств.

Зашифрованный под номером 4 препарат, рабочий раствор которого представляет собой 0,002%-й диоксид хлора, обладал достаточной вирулицидной эффективностью на первом этапе исследования, однако инфекционная активность вируса АЧС сохранялась на бетонной тест-поверхности при экспозиции 3 мин. Испытуемая концентрация ClO₂ превосходит рекомендуемую (0,0012%) для инактивации возбудителя АЧС, и отсутствие активности, скорее всего, связано с недостаточным временем экспозиции. Для достижения оптимального эффекта деградации вируса при нанесении диоксида хлора на поверхность следует выдерживать строгий температурно-временной режим (не менее 50 мин, 37 °C) [24].

Препараты под шифрами 5, 6, 7, 8, 9, 10 и 12 имеют в своем составе глутаровый альдегид. Дезсредство под номером 7 в эксперименте не показало выраженной вирулицидной активности, несмотря на заявленную производителем достаточно высокую концентрацию действующего вещества (0,024%) в рабочем растворе, превосходящую показатели других дезинфектантов, например зашифрованного под номером 10 и содержащего всего 0,015% глутарового альдегида, который оказался в проведенных испытаниях действенным против вируса АЧС. Доступные результаты немногочисленных исследований показывают возможность применения глутарового альдегида в концентрации 0,1% при экспозиции 30 мин [23]. Возможно, отсутствие эффекта у препарата под шифром 7 связано с недостаточным содержанием в составе вспомогательных веществ или с нарушением технологии его производства. Существенный недостаток информации о минимальной эффективной концентрации глутарового альдегида для инактивации вируса АЧС свидетельствует о необходимости проведения исследовательских работ по оценке губительного воздействия дезсредств. Следует отметить, что концентрация глутарового альдегида более 0,5% может приводить к увеличению цитотоксичности, что значительно лимитирует диапазон экспериментов [25].

Зашифрованный под номером 11 препарат, содержащий в своем составе пероксисольват карбоната натрия 0,012%, алкилбензолсульфонат натрия 0,75%, лимонную кислоту 0,135%, метиленовый синий 0,36%, углекислый натрий 0,00015%, показал частичное губительное воздействие на возбудитель. При экспозиции 30 мин в заявленных концентрациях препарат не проявил вирулицидной активности в отношении вируса АЧС, однако с пролонгированной экспозицией, а именно 60 и 90 мин, был достаточно эффективен. Отдельные компоненты, входящие в его состав, согласно литературным данным, обладают активностью в отношении возбудителя АЧС при больших концентрациях и длительной экспозиции [26]. Соединения хлора широко используются в качестве дезинфицирующих средств благодаря их высокой эффективности за счет способности к денатурации белков, однако они обладают коррозионным действием и ингибируются органическими веществами. Алкилбензолсульфонат натрия относится к анионным поверхностно-активным веществам с хорошо выраженными моющими свойствами. Вирулицидные свойства лимонной кислоты были доказаны при ее использовании в концентрации 2% при экспозиции 30 мин, эффект достигается за счет взаимодействия липофильных структур с мембраной вируса и снижения pH. Карбонат натрия также оказался эффективным в отношении вируса АЧС при концентрации 1% с экспозицией 30 мин [26].

Проведенные испытания показывают, что белковая нагрузка (как имитация органического загрязнения), короткое время экспозиции и относительно низкие температуры (рабочего раствора, обрабатываемого объекта, окружающей среды) – все это крайне важные факторы, которые способны значительно снизить эффективность дезсредств. Поэтому для практики по-прежнему большое значение имеет предварительная тщательная механическая очистка поверхностей, строгое соблюдение рекомендаций, в том числе по продолжительности экспозиции и температурному режиму, что согласуется с данными литературы [17].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По результатам проведения первого этапа испытаний дезсредств в культуре клеток селезенки свиней вирулицидную активность в отношении референтного штамма Arm 07 вируса АЧС показали все 12 тестируемых препаратов, что подтверждает их эффективность in vitro и отсутствие цитотоксического действия при соблюдении заявленных концентраций и времени экспозиции.

При этом на втором этапе испытаний (с применением тест-поверхностей из бетона как с имитацией органического загрязнения, так и без нее) эффективностью обладали только 9 из 12 препаратов, что подчеркивает необходимость проведения комплексных исследований по оценке вирулицидной активности дезсредств с применением различных тест-объектов.

Для оптимизации состава компонентов дезинфицирующих средств с целью повышения их эффективности против возбудителя АЧС считаем целесообразным использовать глутаровый альдегид с концентрацией минимум 0,05%, пероксомоносульфат калия с концентрацией минимум 0,5%.

Подтверждаемое экспериментами влияние органических загрязнений на вирулицидный эффект дезсредств показывает, что при их практическом применении крайне важно проводить тщательную очистку поверхностей и подбирать наиболее эффективные средства как для дезинфекции, так и для мойки. Кроме того, требуется учитывать и другие факторы, в том числе действенный в отношении конкретного возбудителя состав и концентрацию действующих веществ дезсредства, температуру окружающего воздуха, обрабатываемых поверхностей, рабочего раствора дезинфектанта, время экспозиции, параметры сушки и др.

Практическое применение коммерческих дезсредств, вирулицидная активность которых в отношении возбудителя АЧС неизвестна, повышает риски свести на нет значительные усилия, прилагаемые при проведении профилактических и ликвидационных мероприятий, что указывает на необходимость введения в соответствующие нормативно-правовые акты требований по проведению испытаний коммерческих дезинфицирующих средств на предмет их эффективности в отношении актуальных возбудителей заразных болезней, которые заявлены в инструкции по применению препарата.

Вклад авторов: Лаврентьев И. А. – формирование идеи, развитие ключевых целей и задач, подготовка текста рукописи, проведение статистического анализа; Иголкин А. С. – формирование идеи, развитие ключевых целей и задач, утверждение окончательного варианта рукописи; Шевцов А. А. – подготовка текста рукописи; Колбин И. С. – проведение экспериментов; Пузанкова О. С. – проведение экспериментов; Гаврилова В. Л. – проведение экспериментов; Чернышев Р. С. – формирование идеи, разработка методологии, проведение экспериментов, подготовка текста рукописи.

Contribution of the authors: Lavrentiev I. A. – formulating the idea, developing key goals and objectives, preparing the manuscript, conducting statistical analysis; Igolkin A. S. – formulating the idea, developing key goals and objectives, approving of the manuscript final version; Shevtsov A. A. – preparing the manuscript text; Kolbin I. S. – conducting experiments; Puzankova O. S. – conducting experiments; Gavrilova V. L. – conducting experiments; Chernyshev R. S. – formulating the idea, developing methods, conducting experiments, preparing the manuscript text.