Динамика развития биоплeнок грибов Nakaseomyces glabratus

ВВЕДЕНИЕ

Из числа приоритетных для исследований патогенов, обусловливающих развитие нозокомиальных инфекций с высокими эпидемиологическими показателями уровня смертности, признаны микроскопические грибы Nakaseomyces glabratus (ранее Candida glabrata) [1]. При развитии септицемии, эндокардита, пиелонефрита, бронхопневмонии, катетер-, протез-ассоциированных патологий достоверно часто изоляты N. glabratus характеризуются множественной лекарственной резистентностью [2-4].

Тенденция статистически достоверного возрастания этиологической значимости N. glabratus установлена при развитии оппортунистической эндогенной инфекции животных на фоне антибиотикотерапии [5-10].

При развитии синдрома избыточного роста микромицетов патогенный потенциал реализуется за счет увеличения биомассы биопленок, представляющих собой гетерогенную ассоциацию микроорганизмов, объединенных межклеточным матриксом [11-13].

Система координации экспрессии генов – quorum sensing (чувство кворума) – при репрезентации сигнальных молекул позволяет регулировать количество и состав популяций биопленок, что расширяет адаптивный потенциал микроорганизмов [12][14][15].

Транскрипционный контроль адгезии, инвазии, синтеза полимерных веществ позволяет многоклеточной популяции реализовать вирулентные свойства при взаимодействии с иммунокомпетентными клетками, обеспечивает защиту от фагоцитоза и воздействия химиотерапевтических и дезинфицирующих препаратов [16][17][18].

Инициация, развитие и исход поверхностных, глубоких и системных микозов при избыточном росте и увеличении патогенного потенциала убиквитарных микроорганизмов обеспечиваются гиперагрегацией, наличием диссоциативных вариантов, дисперсией гетерогенных биопленок. Изыскание способов индикации биопленок, в том числе и при воздействии химиотерапевтических и дезинфицирующих средств, в перспективе позволит разработать фунгицидные препараты для блокировки синтеза или разрушения межклеточного матрикса биопленок.

Для усовершенствования схемы микологических исследований и разработки превентивных противоэпизоотических мероприятий приоритетным направлением научных изысканий представляется расширение границ познания механизмов многоэтапного процесса формирования биопленок.

Цель работы – изучить морфометрические и денситометрические показатели изолятов N. glabratus, выделенных и идентифицированных при развитии гингивита и одонтолитиаза у собак.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы. В опытах использовали изоляты N. glabratus, выделенные нами из смывов и соскобов слизистой оболочки ротовой полости собак при наличии клинических признаков гингивита и одонтолитиаза. Для контроля исследовали референтный штамм ATCC 66032 [19].

Питательные среды. Для культивирования микроорганизмов использовали мясо-пептонный бульон – МПБ (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd., Индия); сыворотку крови крупного рогатого скота (Микроген, Россия); рисовый агар (API-System R.A.T., Франция); среду Сабуро с глюкозой, пенициллином и стрептомицином (100 ME/L); колумбийский агар; хромогенный агар (BioMedia, Россия).

Тест-системы. Для идентификации микроорганизмов применяли набор HiCandida^TM Identification Kit (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd., Индия).

Индикация и идентификация микроорганизмов. Для микроскопических исследований из смывов и соскобов готовили препараты-отпечатки и окрашивали по Граму.

Контроль качества сред – тестирование стерильности при (36 ± 1) °С в течение 48 ч.

Для индикации гифальных проростковых трубок суточные культуры микроорганизмов культивировали в МПБ с добавлением 1,0 мл сыворотки крови при (35 ± 2) °С в течение 5 ч и выполняли микроскопическое исследование препаратов, окрашенных метиленовым синим.

Оценку теста наличия хламидоспор проводили на нативных препаратах из культур микроорганизмов, выросших на рисовом агаре при (25 ± 2) °С в течение 24 ч.

При добавлении в агар Сабуро циклогексимида (0,5 г/л среды) учитывали рост микроорганизмов при (25 ± 2) °С в течение 72 ч.

Индикацию и идентификацию микроорганизмов проводили, учитывая характерные признаки роста микроорганизмов с применением общепринятых методов [20][21].

Для учета биохимических свойств суточные культуры микроорганизмов (оптическая плотность OD = 0,5; длина волны 620 нм) вносили в лунки панели тест-системы HiCandida^TM Identification Kit и культивировали при (22,5 ± 2) °С в течение 48 ч. Идентификацию микроорганизмов проводили в соответствии с идентификационными таблицами и кодами указанной тест-системы.

Исследование динамики развития биопленки. Для учета динамики развития биопленок микроорганизмы культивировали в статических условиях при (35 ± 2) °С в течение 18, 24, 48 ч.

Для оценки денситометрических показателей по истечении указанного времени культивирования жидкость удаляли, осадок трижды промывали 200,0 мкл фосфатно-буферного раствора (рН 7,2). Фиксацию проводили 150,0 мкл 96°-го этилового спирта в течение 15 мин. Затем образцы подсушивали при (35 ± 2) °С в течение 20 мин, вносили 0,5%-й раствор кристаллического фиолетового и помещали в термостат при (35 ± 2) °С на 5 мин. Содержимое лунок удаляли, трижды промывали 200,0 мкл фосфатно-буферного раствора (рН 7,2) и подсушивали. Краситель элюировали 200,0 мкл 96°-го этилового спирта в течение 30 мин [13].

Оптическую плотность исследуемых образцов определяли по степени связывания кристаллического фиолетового (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd., Индия) с применением фотометрического анализатора ImmunoChem-2100 (High Technology Inc., США) при длине волны 580 нм (OD₅₈₀).

Для морфометрических исследований в чашки Петри помещали стекла и вносили 100,0 мл взвеси 18-часовых культур микроорганизмов в концентрации 10⁵ КОЕ/мл. По истечении заданного времени культивирования микроорганизмов препараты фиксировали трехкратно, последовательно погружая в 96°-й спирт в течение 10 мин и высушивая на воздухе в течение 10 мин. Затем препараты окрашивали раствором генцианвиолета из набора окраски по Граму (БиоВитрум, Россия).

При репрезентативной выборке достоверной частоты встречаемости (≥ 90,0% поля зрения оптического микроскопа Carl ZEISS Axio Lab.A1, Германия) проводили микрофотосъемку цифровой камерой ADF PRO 08 (Китай) с разрешением матрицы 8 мегапикселей (4К).

Полученные данные обрабатывали методом статистического анализа с использованием критерия Стьюдента, результаты считали достоверными при р ≤ 0,05 [18].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Индикация и идентификация микроорганизмов. При наличии клинических признаков гингивита и одонтолитиаза у собак наблюдали интенсивные желто-серого цвета наложения, плотно прикрепленные к слизистой оболочке. Как правило, при удалении этих наложений выявляли ярко-красные язвочки.

При оптической микроскопии мазков-отпечатков из соскобов слизистой оболочки ротовой полости выявляли большое количество грамположительных дрожжевой формы микроорганизмов размером 1,1–2,1 × 3,1–4,0 мкм.

При (35 ± 2) °С через 48 ч на агаре Сабуро микроорганизмы формировали блестящие колонии белого цвета.

Наличие хромогенных субстратов в индикаторной среде позволило дифференцировать колонии N. glabratus розового цвета, имеющие слегка фиолетовый оттенок (рис. 1).

Микроскопические грибы N. glabratus сбраживали мальтозу, трегалозу; не сбраживали уреазу, мелибиозу, лактозу, сахарозу, галактозу и ксилозу. Микроорганизмы не обладали уреазной активностью.

При микроскопическом исследовании препаратов из культур микроорганизмов, выросших в МПБ с добавлением 1,0 мл сыворотки крови при (35 ± 2) °С в течение 5 ч, не выявляли образования гифальных проростковых трубок, соответственно, тест отрицательный.

В культурах микроорганизмов, выросших на рисовом агаре при (25 ± 2) °С в течение 24 ч, хламидоспор не обнаружено, следовательно, тест отрицательный.

При инкубировании посева при (25 ± 2) °С в течение 72 ч на агаре Сабуро, содержащем циклогексимид (0,5 г/л), рост микроорганизмов не наблюдали, соответственно, тест отрицательный.

В процессе учета толерантности микроорганизмов к температуре: (35 ± 2), (42 ± 2), (45 ± 2) °С, проведенного в течение 24 ч, выявили характерное помутнение жидкой среды Сабуро, наличие слабого осадка, на поверхности среды наличие серого цвета тонкой пленки, следовательно, тест положительный.

Референтный штамм и изоляты, независимо от источника выделения, имели характерные признаки дрожжеподобных грибов вида N. glabratus (табл.).

Динамика развития биопленок. При исследовании денситометрических и морфометрических показателей были выявлены общие закономерности развития биопленок изолятов N. glabratus, независимо от источника выделения.

В зависимости от времени культивирования микроорганизмов установили постепенное увеличение значений абсолютных величин оптической плотности исследуемых образцов: через 18 ч – от 0,218 ± 0,05 до 0,221 ± 0,08; интенсивность формирования биопленок – ≥ 0,1; через 24 ч – от 0,289 ± 0,04 до 0,297 ± 0,09; интенсивность формирования биопленок – ≥ 0,2; через 48 ч – от 0,331 ± 0,10 до 0,350 ± 0,08; интенсивность формирования биопленок – ≥ 0,3.

При репрезентативной выборке по морфометрическим параметрам достоверной частоты встречаемости (≥ 90,0% в поле зрения оптического микроскопа) обнаруживали объединенные межклеточным матриксом дрожжевидные клетки типичных для вида N. glabratus формы и размеров (рис. 2).

При развитии биопленок, в зависимости от времени культивирования, выявляли такие этапы, как адгезия, фиксация, коагрегация, микроколонии, дисперсия.

На ранних этапах развития за счет сорбции планктонных форм происходило первичное прикрепление – адгезия микроорганизмов к исследуемому субстрату (в наших исследованиях – к поверхности стекла). Эта стадия считается обратимой, то есть прикрепившиеся клетки могут открепляться от субстрата и вновь переходить в планктонную форму.

По мере адгезии клеточные стенки микроорганизмов продуцировали экзоцеллюлярные молекулы, обеспечивающие фиксацию клеток к поверхности стекла. Прочно фиксированные к субстрату клетки способствовали адгезии последующих клеток.

Популяционная иммобилизация архитектоники зрелой трехмерной биопленки, в соответствии с условиями культивирования, опосредована феноменом quоrum sensing. Это особая форма межклеточной коммуникации микроорганизмов за счет синтеза многочисленных экзоцеллюлярных молекул, концентрация которых пропорциональна плотности клеток.

При увеличении времени культивирования интенсивная пролиферация сопровождалась дифференциацией дрожжевых форм и формированием межклеточного матрикса (рис. 3).

Число прикрепившихся делящихся клеток достоверно увеличивалось и, соответственно, наблюдался рост микроколоний, имеющих сходство с колониями, формирующимися на плотных питательных средах. При увеличении численности микроорганизмов за счет возрастания синтеза экзоцеллюлярных молекул формировались межклеточные связи, происходила иммобилизация популяции, именуемой зрелой биопленкой.

При достижении определенных размеров микроколоний периодически имела место дисперсия отдельных клеток, способных через некоторое время прикрепиться к поверхности и образовать новую микроколонию.

Общая закономерность упорядоченности и компактности многоклеточной гетероморфной популяции биопленок обусловлена стадиями клеточного цикла и степенью развития межклеточного матрикса. Клеточный состав зрелой биопленки был представлен овоидной или эллипсоидной формы клетками, имеющими типичные для вида размеры (1,1–1,9) × (3,1–3,4) мкм (рис. 4).

Популяционная иммобилизация архитектоники зрелой трехмерной биопленки N. glabratus, в соответствии с условиями культивирования, сопровождалась коагрегацией многочисленных гетероморфных клеток разных размеров и форм в зависимости от стадии клеточного цикла [12][15][18].

Результаты исследований общих закономерностей развития гетерогенной популяции микроорганизмов представляют перспективность для расширения границ познания механизмов адаптации убиквитарных микроорганизмов к длительной персистенции in vivo и in vitro.

Способы изучения морфометрических и денситометрических показателей биопленок без нарушения естественной архитектоники рекомендуется применять для оптимизации схемы микологических исследований, являющихся длительными и ретроспективными, а также при разработке эффективных способов лечения и профилактики микозов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При микроскопии мазков-отпечатков из соскобов слизистой оболочки ротовой полости собак с клиническими признаками гингивита и одонтолитиаза выявили избыточный рост грамположительных дрожжевой формы микроорганизмов. В зависимости от времени культивирования микроорганизмов установили постепенное увеличение значений абсолютных величин оптической плотности. Реализация межклеточных коммуникаций достигалась коагрегацией гетероморфных структур, формирующих кластеры, между которыми выявлялись округлые образования, содержащие жидкость. Упорядоченность и компактность многоклеточной гетероморфной популяции зрелой биопленки обусловлена стадиями клеточного цикла и степенью развития межклеточного матрикса.